西藏白菜型油菜油體特征與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及油體提取物的SDS-PAGE分析

侯維海，王建林，旦 巴，胡 單

(西藏農(nóng)牧學(xué)院 高原作物分子育種實(shí)驗(yàn)室,植物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000)

植物種子內(nèi)積累的三酰甘油酯(TAG)是種子重要的儲(chǔ)藏物質(zhì)之一，為種子萌發(fā)、幼苗自養(yǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)源。三酰甘油酯一般由離散的球形液滴細(xì)胞器,即油體或脂肪體所包裹，在種子成熟階段，其以小而聚集的形式廣泛分布于胚乳、子葉或胚軸等組織[1-2]。前人研究表明，TAG合成過(guò)程中，油體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特化位點(diǎn)合成并吸附在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在復(fù)活酶的作用下填充中性脂質(zhì)并逐漸膨大至最佳大小，然后釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[3]，最終小的油體彼此融合或合并形成更大的油體[4]。油體是植物細(xì)胞中最小的細(xì)胞器，不同植物中油體平均粒徑為0.2～2.5 μm，其大小、數(shù)量等可能受油體C代謝、脂肪酸合成、TAG合成等多個(gè)因素的調(diào)控[4-6]。油體由單層磷脂膜包被的液態(tài)TAG基質(zhì)和嵌入表面的油體結(jié)合蛋白組成[2,7-10]，這些油體結(jié)合蛋白對(duì)維持油體的穩(wěn)定、參與油體的形態(tài)建成和生物學(xué)功能的發(fā)揮、油脂代謝和利用等具有重要影響[1,11-12]。例如，油體在干燥種子細(xì)胞內(nèi)或體外經(jīng)離心分離的上浮液中均不發(fā)生融合或聚合，甚至經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的貯存也能夠保持穩(wěn)定[11]。此外，不同植物種子其油體的大小、數(shù)量等表型均存在差異，這可能與油體C代謝、脂肪酸合成、TAG合成及細(xì)胞分裂等有關(guān)，也可能受營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境等多個(gè)因素的調(diào)控[5-7,13]。

植物種子油體的分離純化液中?；煊?.6%～3.0%的蛋白質(zhì)[3],這些蛋白質(zhì)已從多種植物種子油體中得到鑒定，被認(rèn)為是油體結(jié)合蛋白并將其分為3類[14]。其中第1類是油體蛋白，其含量占油體結(jié)合蛋白的75%～80%，幾乎覆蓋在整個(gè)油體表面，為主要油體結(jié)合蛋白，由分子質(zhì)量為15～26 ku的小分子量堿性蛋白組成[15-16]。目前，在多種植物中發(fā)現(xiàn)油體蛋白存在2個(gè)或2個(gè)以上的異構(gòu)體，通常將其簡(jiǎn)單地分為高或低分子量類型[8-9,13,17-18]。第2類是分子質(zhì)量約為27 ku的油體鈣蛋白，包含1個(gè)Ca2+結(jié)合EF手型的N-末端親水結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C-末端親水結(jié)構(gòu)域[19]。第3類是分子質(zhì)量約為37 ku的油體固醇蛋白，包含1個(gè)N-末端脂質(zhì)錨定位點(diǎn)和固醇結(jié)合脫氫酶結(jié)構(gòu)域[20]，涉及油體的形成和降解[21]。另外，還有脂質(zhì)液滴相關(guān)蛋白(LDAP)[22]、主要脂質(zhì)液滴蛋白(MLDP)[23]和分子質(zhì)量為39 ku的油體結(jié)合蛋白也相繼被鑒定。因此，油體結(jié)合蛋白種類較多。此外，油體提取液中易混有貯藏蛋白。

當(dāng)前，關(guān)于種子含油量與油體、油體結(jié)合蛋白之間的關(guān)系研究一直受到人們的關(guān)注。研究表明，油體結(jié)合蛋白直接涉及油體磷脂膜的形成、油體融合、防止種子失水引起的油體聚集、保持油體邊界清晰和單個(gè)小油體的穩(wěn)定等[8,17]，并具有調(diào)控油體大小和功能的作用[4,10,23-24]。與低油品種相比，高油品種種子油體有較高的截面積[9]、更大的油體結(jié)構(gòu)和更高的TAG/油體蛋白比值[10]及高油體蛋白表達(dá)水平[13]。有研究表明，甘藍(lán)型油菜種子油體的總面積與含油量呈正相關(guān)，油體大小與油體蛋白呈負(fù)相關(guān)[13,25-26]。有研究從分子水平上對(duì)油體數(shù)量、TAG含量和油體蛋白的關(guān)系進(jìn)行了解析，如Liu等[27]研究表明，在水稻中過(guò)表達(dá)大豆油體蛋白基因，可導(dǎo)致油體數(shù)量增加，體積減小。在擬南芥中過(guò)表達(dá)BnGRF2a油體蛋白，種子含油量顯著增加[28]。抑制18 ku油體蛋白基因?qū)е路N子形成了更大的油體，而TAG含量相應(yīng)下降[2,15]。在水稻中分別敲除胚乳16和18 ku油體蛋白基因，種子TAG含量分別下降約60%和80%[29]。抑制油體蛋白不僅會(huì)引起種子胚細(xì)胞的畸變，也會(huì)導(dǎo)致非正常的大油體形成[2]。利用RNAi抑制大豆油體蛋白，會(huì)導(dǎo)致油體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)復(fù)合體-微油體的產(chǎn)生，表明油體蛋白具有表面活性劑的功能。此外，油體蛋白與脂肪酸也有一定的關(guān)系。利用RNAi可以抑制擬南芥18 ku油體蛋白基因的表達(dá)，改變脂類和蛋白質(zhì)的積累，其中TAGs的C20∶1增加而C18∶1有所減少[2]。 以上結(jié)果表明，油體和油體蛋白與種子含油量和脂肪酸含量緊密相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于油體的研究常采用透射電鏡技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)等，其不足之處在于試驗(yàn)設(shè)備要求高且工作效率低[28,30]。西藏高原獨(dú)特的氣候和環(huán)境，孕育出了豐富且獨(dú)具高原特征的油菜種質(zhì)資源[25,31]，表現(xiàn)為遺傳變異豐富和含油量高等特點(diǎn)，這些優(yōu)異特性與油體和油體結(jié)合蛋白表型是否存在聯(lián)系目前尚無(wú)系統(tǒng)研究和明確的結(jié)論。鑒于此，本研究采用光學(xué)生物顯微鏡對(duì)西藏白菜型油菜種子油體、油體蛋白表型進(jìn)行拍照，利用Imagepro-plus精確提取油體和油體蛋白表型數(shù)據(jù)，并結(jié)合含油量和總蛋白、脂肪酸含量進(jìn)行分析，同時(shí)利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)油體提取物中蛋白亞基的組成，以期明確西藏高原地理生態(tài)條件下白菜型油菜種子油體表型、含油量、蛋白質(zhì)和脂肪酸含量間的響應(yīng)關(guān)系，并分析材料間的親緣關(guān)系，為西藏白菜型油菜高油新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料西藏白菜型油菜農(nóng)家種、野生近緣種共計(jì)36份(編號(hào)為1～36)，由西藏農(nóng)牧學(xué)院農(nóng)學(xué)教研室于2015年從西藏全境內(nèi)72個(gè)縣的自然村搜集獲得，于2016年3月中旬種植于西藏農(nóng)牧學(xué)院試驗(yàn)田，小區(qū)面積2 m×2 m，每份材料3次重復(fù)，常規(guī)田間管理，于材料成熟后采集角果，單獨(dú)脫粒進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1 測(cè)定項(xiàng)目及方法 種子含油量按照GB/T 14488.1-2008的方法測(cè)定；種子蛋白質(zhì)含量按照GB/T 14489.2-2008的方法測(cè)定；種子脂肪酸(芥酸 C22∶1、棕櫚酸C16∶0、硬脂肪酸C18∶0、油酸C18∶1、亞油酸C18∶2、亞麻酸C18∶3、C20烯酸)含量按照GB/T 22223-2008的方法測(cè)定。

1.2.2 油體的提取 參考Tzen等[7]的油體提取方法并作適當(dāng)改動(dòng)。取0.5 g干種子置于預(yù)冷的研缽內(nèi)，加入2.5 mL研磨液(pH 7.5的10 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.6 mol/L蔗糖)，迅速充分研磨成勻漿，過(guò)3層紗布，收集濾液到15 mL離心管，加入2.5 mL漂浮液Ⅰ(含pH 7.5的10 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.4 mol/L蔗糖)，10 000×g離心20 min；挑取油體至15 mL新離心管，加入5 mL去污清洗液(含0.2 mol/L蔗糖，體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween-20，pH 7.5的5 mmol/L磷酸鈉緩沖液)懸浮油體，再加入5 mL 10 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)，10 000×g離心20 min；然后挑取油體至15 mL新離心管，加入5 mL離子洗脫液(含0.6 mol/L蔗糖，2 mol/L氯化鈉，pH 7.5的10 mmol/L磷酸鈉緩沖液)懸浮油體，再加入5 mL漂浮液Ⅱ(含0.25 mol/L蔗糖，2 mol/L氯化鈉，pH 7.5的10 mmol/L磷酸鈉緩沖液)10 000×g離心20 min；挑取油體至1.5 mL離心管，離心后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 油體觀察 挑取適量油體均勻涂抹于載玻片上，滴60 μL體積分?jǐn)?shù)20%的甘油，封片，用酒精燈烤至微干，在Leica DM5000生物顯微鏡1 000倍視野下觀察并拍照，每個(gè)樣品3個(gè)視野，3次重復(fù)。

1.2.4 油體大小的統(tǒng)計(jì) 利用Imagepro plus軟件對(duì)油體顯微照片進(jìn)行處理，并隨機(jī)選取300個(gè)油體和25個(gè)油體蛋白進(jìn)行粒徑測(cè)量，3次重復(fù)。

1.2.5 油體蛋白的SDS-PAGE電泳 挑取0.01 g油體放入1.5 mL試管中，加入50 μL研磨液(含pH 7.5的10 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.6 mol/L蔗糖)稀釋混勻，吸取40 μL混合液加入12 μL 5×SDS-PAGE loading buffer，渦旋振蕩混勻，100 ℃溫浴5 min，3 000×g離心20 s，放入4 ℃冰箱預(yù)冷。取上清液25 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濃縮膠5%，分離膠10%，恒流15 mA，待指示劑泳動(dòng)至膠底停止電泳。采用考馬斯亮藍(lán)R250染色后，酒精和乙酸溶液脫色，拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Imagepro plus軟件對(duì)1 000×光學(xué)顯微照片進(jìn)行細(xì)胞觀察，并統(tǒng)計(jì)其粒徑數(shù)據(jù)，通過(guò)SPSS20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。利用Quantity-one軟件自動(dòng)讀取蛋白譜帶，人工輔助修正，按照同一位置，有蛋白電泳條帶賦值為1，無(wú)蛋白條帶賦值為0，生成“0，1”矩陣。通過(guò)NTSYS-pc 2.1軟件對(duì)已生成的“0，1”矩陣進(jìn)行非加權(quán)類平均法聚類，計(jì)算遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，通過(guò)Microsoft Excel計(jì)算出現(xiàn)頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜型油菜種子含油量及蛋白質(zhì)、主要脂肪酸含量分析

含油量分析結(jié)果(表1)表明，36份供試材料含油量差異較大。根據(jù)含油量高低，將36 份材料分為高油組(含油量≥138 mg/g，HO)、中油組(110 mg/g≤含油量<138 mg/g，MO)、 低油組(含油量<110 mg/g，LO)，其平均含油量分別為144.26，132.77和88.29 mg/g，含油量最高和最低的材料分別為14號(hào)和23號(hào)，含油量分別為151.37和57.20 mg/g。HO、MO和LO組平均蛋白質(zhì)含量分別為44.70， 51.09和66.91 mg/g，其中23號(hào)材料的蛋白質(zhì)含量最高，30號(hào)材料最低，其蛋白質(zhì)含量分別為73.87和38.68 mg/g。分析含油量和蛋白質(zhì)含量的關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，隨著含油量的逐漸增加，蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢(shì)，兩者存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

脂肪酸含量分析結(jié)果(表1)顯示，芥酸、油酸、亞油酸和烯酸是脂肪酸的主要組成部分，而棕櫚酸和硬脂肪酸含量相對(duì)較低。根據(jù)芥酸(C22∶1)含量的大小，可將供試材料分為高芥酸組(芥酸含量≥110 mg/g)、中芥酸組(55 mg/g≤芥酸含量<110 mg/g)、低芥酸組(芥酸含量<55 mg/g)3種類型，其中芥酸最高值為132.33 mg/g，最低值為27.39 mg/g。油酸(C18∶1)、亞油酸(18∶2)含量表現(xiàn)出與芥酸相反的結(jié)果。高芥酸組材料的油酸含量為3.22～42.60 mg/g，亞油酸含量為31.22～47.00 mg/g；中芥酸組材料的油酸含量為21.44～101.51 mg/g，亞油酸含量為36.40～49.32 mg/g；低芥酸組材料的油酸含量為119.19～143.22 mg/g，亞油酸含量為41.96～53.62 mg/g。上述結(jié)果表明，隨著芥酸含量的降低，油酸和亞油酸含量逐漸增加。由表1還可看出，飽和脂肪酸和烯酸在不同芥酸組材料間差異較大，無(wú)一定的規(guī)律性。

表1 不同白菜型油菜含油量及蛋白質(zhì)、主要脂肪酸含量

表1(續(xù)) Continued table 1

2.2 白菜型油菜油體和油體蛋白特征

2.2.1 油體和油體蛋白形態(tài)特征 HO、MO、LO組油體和油體蛋白形態(tài)特征如圖1所示。

Pb.油體蛋白；Ol.大油體；Os.小油體Pb.Protein body;Ol.Large oil body;Os.Small oil body圖1 白菜型油菜種子的油體形態(tài)(1 000×)Fig.1 Morphological structure of oil bodies isolated from Brassica campestris L.seeds (1 000×)

由圖1可以看出，在成熟的白菜型油菜種子中，油體以近圓形為主，少量呈扁圓形和不規(guī)則形狀；油體數(shù)量較多，充滿了整個(gè)視野且趨向聚集狀態(tài)，二維面積和直徑有很大差異，其中小油體數(shù)量顯著高于大油體數(shù)量。油體蛋白也多為近圓形，二維面積和粒徑較大，但數(shù)量較少。

2.2.2 油體和油體蛋白粒徑 對(duì)分離的油體和油體蛋白粒徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，并進(jìn)行顯微觀察，所得結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。由表2和圖2可以看出，各材料油體粒徑為0.49～8.66 μm，隨著供試材料含油量的增加，油體平均粒徑表現(xiàn)出增加趨勢(shì)。HO組各材料油體數(shù)量較多，粒徑較大，其中最大油體粒徑為3.49～8.66 μm，平均油體粒徑為1.89～2.78 μm，組內(nèi)平均粒徑為2.12 μm；MO組各材料最大油體粒徑為3.17～7.99 μm，平均油體粒徑為1.62～2.03 μm，組內(nèi)平均粒徑為1.82 μm；LO組各材料最大油體粒徑為1.07～3.12 μm，平均油體粒徑為1.39～1.48 μm，組內(nèi)平均粒徑為1.44 μm。

表2和圖2顯示，HO組各材料油體蛋白粒徑相對(duì)較大，但數(shù)量較少，其中最大油體蛋白粒徑為5.45～21.02 μm，平均油體蛋白粒徑為2.90～12.15 μm，組內(nèi)平均粒徑為5.24 μm；MO組各材料最大油體蛋白粒徑為5.67～18.58 μm，平均油體蛋白粒徑為3.36～8.60 μm，組內(nèi)平均粒徑為4.58 μm；LO組各材料油體蛋白粒徑相對(duì)較小，但數(shù)量較多，其中最大油體蛋白粒徑為5.01～8.11 μm，平均油體蛋白粒徑為2.54～5.78 μm，組內(nèi)平均粒徑為3.81 μm。

表2 不同白菜型油菜的油體和油體蛋白粒徑Table 2 Analysis of diameter of oil body and oleosin from Brassica campestris L materials μm

2.3 白菜型油菜種子營(yíng)養(yǎng)成分與油體、油體蛋白的相關(guān)性分析

由表3可以看出，在成熟的白菜型油菜種子中，含油量與蛋白質(zhì)、棕櫚酸、烯酸含量之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.835，-0.477和-0.568；含油量與油體平均粒徑呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.634，而與油體蛋白平均粒徑相關(guān)性不顯著；蛋白質(zhì)含量與油體平均粒徑呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.561；油體平均粒徑與油體蛋白平均粒徑呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.354；油體平均粒徑和油體蛋白平均粒徑與脂肪酸含量的關(guān)系均無(wú)明顯規(guī)律性。

表3 不同白菜型油菜種子含油量及蛋白質(zhì)、脂肪酸含量與油體和油體蛋白粒徑的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis on contents of seed oil,protein and main fatty acids and average diameter of oil body and oil body protein form different Brassica campestris L.materials

注：**表示在0.01水平上相關(guān)性顯著(雙側(cè)檢驗(yàn))，*表示在0.05水平上相關(guān)性顯著(雙側(cè)檢驗(yàn))。

Note:**.Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed),*.Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).

2.4 白菜型油菜油體粗提液SDS-PAGE電泳分析

由表4和表5可以看出，36份供試材料共分離出蛋白譜帶740條，各供試材料蛋白譜帶條數(shù)為12～26條，平均每份材料的譜帶數(shù)為20.5條，其中29和13號(hào)材料蛋白譜帶數(shù)最多，均為26條，3號(hào)材料最少，為12條。按照遷移率大小，共分離出遷移率不同的譜帶32 條，各譜帶在供試材料中出現(xiàn)的頻率為5.6%～100.0%，其中13，19，20，21和24號(hào)譜帶在供試材料中均有出現(xiàn)，出現(xiàn)頻率為100%，是共有帶；11，15，22和31號(hào)譜帶在供試材料中出現(xiàn)頻率較低，均低于14%。

表4 不同白菜型油菜油體粗提液中的蛋白亞基數(shù)量Table 4 Protein subunit number of oil body crude extracts form different Brassica campestris L.materials

表5 不同白菜型油菜油體粗提液中蛋白亞基的出現(xiàn)頻率Table 5 Frequency of different subunits of protein in crude extracts of oil bodies form different Brassica campestris L.

SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖3)表明，36 份供試材料的蛋白譜帶具有一定的多態(tài)性。蛋白各亞基相對(duì)分子質(zhì)量為25.5～128.7 ku，其中譜帶較集中區(qū)域在27.4～87.8 ku。各參試材料在68.32，51.33，41.23，32.82和27.44 ku處的譜帶恒定且明顯。這些數(shù)據(jù)表明，西藏白菜型油菜種質(zhì)在蛋白水平上存在著一定的遺傳變異，蛋白亞基數(shù)量和組合方式變化豐富，存在著廣泛的等位基因變異。

1～9.分別代表1～9號(hào)供試材料；M.蛋白質(zhì)Mark1-9.Represent 1-9 test materials;M.Represents protein Mark

2.5 白菜型油菜油體蛋白的遺傳相似性分析

材料間遺傳相似系數(shù)越大，表明遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近。N-J進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果(圖4)顯示，西藏36 份白菜型油菜油體蛋白的遺傳相似系數(shù)為0.61～0.98，表明36份供試材料間遺傳背景差異較大。13和14號(hào)材料、17和18號(hào)材料間的遺傳相似系數(shù)最大，分別為0.98和0.975，表明這2組材料間的遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近。1和3號(hào)材料間遺傳相似系數(shù)最小，為0.61，但遺傳距離最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。在遺傳相似系數(shù)為0.835時(shí)可將36份供試材料聚為9個(gè)類群，其中第Ⅰ類群有3份材料；第Ⅱ類群最大，有15份材料；第Ⅲ類群有3份材料；第Ⅳ類群包括3份材料；第Ⅴ類群有2份材料；第Ⅵ類群有2份材料；第Ⅶ類群有6份材料；第Ⅷ類群有1份材料；第Ⅸ類群有1份材料。

圖4 36份西藏白菜型油菜油體粗提液蛋白亞基帶型的N-J 進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 N-J phylogenetic tree clusters of protein band patterns from crude extracts of oil bodies form 36 Brassica campestris L.materials

3 討 論

油體是植物貯藏脂質(zhì)的最重要細(xì)胞器，其大小取決于物種、品種和外界環(huán)境因素，在一般作物種子中，油體是平均粒徑為0.5～2.5 μm的小球體[1,24]。Jolivet等[32]利用光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)，擬南芥種子油體均為球形，且大小相似，粒徑為(2.81±0.72)μm。韋存虛等[33]研究認(rèn)為，白菜型油菜種子油體粒徑為0.1～6.0 μm，為便于統(tǒng)計(jì)，以粒徑1.5 μm作為區(qū)分大小油體的分界線，>1.5 μm的大油體的平均粒徑為2.39 μm，≤1.5 μm的小油體的平均粒徑為0.57 μm，其中0.4～0.5 μm的油體數(shù)量最多，粒徑>0.5 μm的油體數(shù)量隨著粒徑的增加而逐漸減少。本研究結(jié)果表明，西藏白菜型油菜油體多呈近圓形，并有少量扁圓形和不規(guī)則形狀的油體，油體粒徑為 0.49～8.66 μm，按照韋存虛等[33]的方法將油體分為大和小2種類型，其中粒徑<1.5 μm的小油體數(shù)量居多，粒徑>1.5 μm的大油體粒徑多集中在1.5～2.5 μm，粒徑大小因材料不同而表現(xiàn)出一定差異。此結(jié)果與Tzen等[7]報(bào)道的甘藍(lán)型油菜、芥菜型油菜、花生、亞麻等植物種子油體粒徑0.6～2.0 μm相比有一定差異，但與韋存虛等[33]報(bào)道的白菜型油菜種子油體粒徑相接近。此外，供試材料均有數(shù)量較少但粒徑>5 μm的巨大油體，推測(cè)為異常大油體。Hu等[9]推測(cè)認(rèn)為，在甘藍(lán)型油菜種子中，異常大油體(粒徑>5 μm)與低含油量高度相關(guān)，但本研究尚不支持這個(gè)結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)，西藏白菜型油菜種子油體粒徑偏大，這可能與本研究采用光學(xué)顯微鏡在放大1 000倍視野下對(duì)油體粒徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，部分極小油體無(wú)法有效統(tǒng)計(jì)有關(guān)，也可能與西藏特殊的地理環(huán)境有關(guān)，高原缺氧及強(qiáng)輻射條件導(dǎo)致參試材料油體中形成了較多異常大油體[1,9,26]。Heneen等[34]觀察燕麥胚乳發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，大油體是由小油體融合形成的，且認(rèn)為種子含油量與粒徑>1.5 μm的油體相關(guān)。因此白菜型油菜大油體的產(chǎn)生機(jī)理、油體大小與含油量的關(guān)系等還有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，西藏白菜型油菜種子含油量和蛋白質(zhì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，這與Hu等[9]和Cober等[35]等的研究結(jié)果一致。油體、油體蛋白平均粒徑分析顯示，平均油體粒徑表現(xiàn)為高油組>中油組>低油組，且油體蛋白也表現(xiàn)出相似趨勢(shì)。相關(guān)分析表明，含油量與蛋白質(zhì)、棕櫚酸、烯酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與油體平均粒徑呈顯著正相關(guān)，但與油體蛋白平均粒徑相關(guān)性不大；油體平均粒徑與油體蛋白平均粒徑呈顯著正相關(guān)，但兩者均與脂肪酸含量相關(guān)性不大。該結(jié)果與Hu等[9]的研究結(jié)果相反，但與Ting等[8]和韋存虛等[33]的研究結(jié)果相似。

油體蛋白在純化制備過(guò)程中易受到儲(chǔ)藏蛋白的污染，故難分離得到較純的油體蛋白[9]。本研究對(duì)油體粗提液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，分離出了清晰可辨的蛋白譜帶，其分子質(zhì)量為25.5～128.7 ku，其中包括27 ku的油體鈣蛋白、37 ku的油體固醇蛋白和39 ku的油體蛋白，但已報(bào)道的油體結(jié)合蛋白均為小分子質(zhì)量蛋白，說(shuō)明該油體粗提液富含較多的貯藏蛋白，這與Jolivet等[32]對(duì)擬南芥種子油體粗提液SDS-PAGE電泳分析的結(jié)果類似。基于種子蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳分析方法，已經(jīng)成為一種解決植物分類和進(jìn)化問(wèn)題、品種和變種的鑒定、種質(zhì)特征分析和相關(guān)評(píng)價(jià)信息補(bǔ)充的有效工具[36-37]。本研究中，油體粗提液蛋白譜帶的多樣性提示供試材料的遺傳背景具有一定的差異。N-J進(jìn)化樹(shù)分析表明，在相似系數(shù)為0.835時(shí)可將36份西藏白菜型油菜種質(zhì)材料分為9個(gè)類群，不同類群間和同一類群的不同材料間含油量、蛋白質(zhì)含量、脂肪酸含量并未表現(xiàn)出相近的規(guī)律，也未表現(xiàn)出明顯的地域分布，這可能歸因于材料生境的差異[38]。