局部注射超聲微泡促進(jìn)BMP 2在大鼠體內(nèi)骨骼肌表達(dá)的研究

郭琳琦　劉亮　栗樹偉　李巖　王東

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局部注射超聲微泡促進(jìn)BMP 2在大鼠體內(nèi)骨骼肌表達(dá)的研究

郭琳琦劉亮栗樹偉李巖王東

【摘要】目的 分析局部注射超聲微泡對(duì)BMP 2在大鼠體內(nèi)骨骼肌中表達(dá)的促進(jìn)作用。方法 將30只大鼠平均分為1組（空白對(duì)照）、2組（直接注射質(zhì)粒）、3組（注射質(zhì)粒目的基因＋微泡），并向三組大鼠股四頭肌中注射造影劑、生理鹽水和BNM 2-EGPF，每組再分為A、B組，于7 d、14 d分別處死大鼠，檢測(cè)BMP 2的表達(dá)狀況。結(jié)果 7 d后，3組中A組大鼠的BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率高于1組中A組大鼠和2組中A組大鼠（P＜0．05），14 d后，3組中B組大鼠的BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率高于1組中B組大鼠和2組中B組大鼠（P＜0．05）。結(jié)論 局部注射超聲微泡能夠提高BMP 2在大鼠骨骼肌中的表達(dá)含量，可為臨床治療骨折疾病提供新思路。

【關(guān)鍵詞】超聲微泡；BMP 2；骨骼??；作用

近年來，不斷有臨床研究發(fā)現(xiàn)，局部注射超聲微泡能夠促進(jìn)目的基因安全且有效的定向轉(zhuǎn)移，繼而能夠有效增加外源性基因表達(dá)量，在基因治療領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的應(yīng)用價(jià)值[1]。BMP 2（骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白-2）是一種具有強(qiáng)效性的骨誘導(dǎo)因子，在骨折后的骨愈合過程中發(fā)揮著重要作用[2]。基于上述現(xiàn)狀，本次研究針對(duì)局部注射超聲微泡對(duì)BMP 2在大鼠體內(nèi)骨骼肌中表達(dá)的促進(jìn)作用進(jìn)行了分析，旨在為臨床治療骨折疾病提供新思路，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為30只健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重170～190 g。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

將目的基因BMP 2-EGPF導(dǎo)入大腸桿菌DH 5 a后進(jìn)行基因擴(kuò)增篩選，按照Promega提抽試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提純，建立雙酶切反應(yīng)體系鑒定DNA質(zhì)粒，調(diào)整質(zhì)粒濃度。制備微泡后將30只大鼠平均分為1組、2組和3組，1組大鼠作為空白對(duì)照組，2組大鼠直接注射質(zhì)粒，3組大鼠注射目的質(zhì)粒基因＋超聲微泡造影劑。然后將超聲微泡造影劑、生理鹽水和已定量轉(zhuǎn)化的BMP2-EGPF混合，注入三組大鼠股四頭肌中，注射量為30 μ，后用超聲將超聲微泡局部超聲破裂，超聲頻率設(shè)置為1 MHz，聲強(qiáng)設(shè)置為0.5 W/cm2，超聲探頭每次發(fā)射1 s，間斷1 s。將各組大鼠平均分為A組和B組，于7 d后處死各組大鼠中的A組大鼠，于14 d后處死各組大鼠中B組大鼠。取各組大鼠股四頭肌，使用石蠟包埋固定，冰凍肌肉組織，切片，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組大鼠股四頭肌中BMP 2的陽(yáng)性表達(dá)狀況。

1.3BMP 2陽(yáng)性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)

BMP 2陽(yáng)性表達(dá)時(shí)呈棕黃色，為顆粒狀。隨機(jī)性選取5個(gè)100倍視野，對(duì)每個(gè)高倍視野免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行定量分析，每個(gè)視野取100個(gè)顆粒。顆粒無著色為0分，淺黃色、棕黃色、棕褐色分別為1、2、3分，0分為陰性，1分（淺黃色顆粒＜10%），2分（棕黃色顆粒11%～50%）、3分（棕褐色顆粒51%～75%）、4分（著色顆粒＞75%），任意兩者乘積≥3分即判定為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料用（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)、計(jì)量資料用（x-±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.11組中A組、2組中A組、3組中A組大鼠的BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，1組中A組5只大鼠股四頭肌中的BMP 2均呈陰性表達(dá)。2組中A組5只大鼠，2只大鼠股四頭肌中的BMP 2呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%。3組中A組4只大鼠股四頭肌中的BMP 2呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%，高于其他兩組中的A組大鼠（χ2=10.000；P=0.002，χ2=4.011；P=0.046）。2.21組中B組、2組中B組、3組中B組大鼠的BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，1組、2組、3組大鼠中B組大鼠股四頭肌的BMP 2陽(yáng)性表達(dá)只數(shù)分別為1只、3只、5只，陽(yáng)性表達(dá)率分別為20%、60%和100.0%。3組中B組大鼠股四頭肌的BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率高于其他兩組大鼠中的B組大鼠（χ2=6.667；P=0.010，χ2=4.577；P=0.029）。

2.31、2、3組大鼠BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率綜合比較

總結(jié)上述研究結(jié)果得出三組大鼠中，每組B組大鼠BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率均高于A組，3組中B組大鼠的BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率最高，其次為3組A組，2組B組，2組A組，1組B組，1組A組大鼠的BMP 2為陰性表達(dá)，上述指標(biāo)之間存在的差異均具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

機(jī)體骨體骨折后被破壞的骨質(zhì)如何快速再生一直是我國(guó)臨床重點(diǎn)研究課題之一。BMP 2因具有獨(dú)特的性質(zhì)也吸引了各國(guó)臨床的高度關(guān)注[3]。BMP 2在骨質(zhì)中的高含量表達(dá)，可加快骨折患者骨體骨折端愈合，因此認(rèn)為通過轉(zhuǎn)基因方式誘導(dǎo)BMP 2表達(dá)，有可能成為治療骨折疾病的新方法。

局部注射超聲微泡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染載體，在一定條件下可將目的基因安全而有效的進(jìn)行定向轉(zhuǎn)移，增加外源性基因表達(dá)量。但關(guān)于超聲微泡在基因轉(zhuǎn)染中的具體作用機(jī)制卻尚未完全明確[4]。研究學(xué)者認(rèn)為[5]，在超聲作用下，微泡造影劑能夠通過不斷壓縮和膨脹形成“空化效應(yīng)”，降低超聲波空化閾值，當(dāng)超聲波達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)，微泡發(fā)生破裂，并將攜帶的目的基因釋放，促使目的基因進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞，增加外源性基因表達(dá)量。

我院本次研究對(duì)局部注射超聲微泡在促進(jìn)大鼠骨骼肌中BMP 2表達(dá)的作用進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示3組大鼠中A組大鼠的BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率高于其他兩組大鼠中的A組大鼠，3組大鼠中B組大鼠的BMP 2陽(yáng)性表達(dá)率高于其他兩組大鼠中的B組大鼠。本次研究所得結(jié)果表明局部注射超聲微泡可提高BMP 2在大鼠骨骼肌中的表達(dá)量，有助于研究學(xué)者確定利用局部注射超聲微泡進(jìn)行基因治療的可行性。但由于我院本次研究使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本較少，因此所得研究結(jié)果的可靠性仍需大量臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 唐遠(yuǎn)姣，張凌燕，王磊，等． 治療性超聲介導(dǎo)微泡破裂促進(jìn)大鼠體內(nèi)肌肉基因轉(zhuǎn)染的參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究[J]． 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，43（6）：930-935．

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To Sutdy the Local Injection of Ultrasound Microbubble Promote BMP 2 Expression in Rat Skeletal Muscle

GUO Linqi LIU Liang LI Shuwei LI Yan WANG Dong, Shanxi Medical University, Taiyuan 030002, China

[Abstract]Objective To analysis the local injection of ultrasound microbubbles promoting the role of BMP 2 in expression in rat skeletal muscle. Methods Selected 30 rats were divided into group 1 (blank control), group 2 (direct injection of plasmid), group 3 (injection of plasmid, microbubble target gene), the three groups of rats injected contrast quadriceps agents, saline and BNM 2-EGPF, each group was divided into A, group B, in 7 days, 14 days rats were sacrificed to detect the expression of BMP 2 situation. Results 7 days, group 3 of rats in group A the BMP 2 expression was higher than in group A group 1 and group 2 rats in group A (P＜0.05), 14 days, group 3 of rats in group B the BMP2 expression was higher than in group B group 1 and group 2 rats in group B (P＜0.05). Conclusion Local injection of ultrasound can improve the content of BMP 2 expression in rat skeletal muscle, may provide new ideas for the clinical treatment of fractures disease.

[Key words]Ultrasound microbubbles, BMP 2, Skeletal muscle, Effect

通訊作者：王東，E-mail：30409774@qq．com

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．04．018

【文章編號(hào)】1674-9308（2016）04-0025-02

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

作者單位：030002太原，山西醫(yī)科大學(xué)