煙草根際解磷解鉀菌的篩選鑒定及應(yīng)用效果研究

萬兵兵,劉 曄,吳 越,劉世亮,王國文,張東艷,姜 瑛*(.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,河南 鄭州450002; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京20095; .山東省土壤肥料總站,山東 濟南 25000)

煙草根際解磷解鉀菌的篩選鑒定及應(yīng)用效果研究

萬兵兵1,2,劉 曄1,吳 越3,劉世亮1,王國文1,張東艷1,姜 瑛1*
(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,河南 鄭州450002; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京210095; 3.山東省土壤肥料總站,山東 濟南 250100)

為了解決植煙區(qū)土壤及煙草磷、鉀缺乏問題,從長勢較好的煙草根際土壤中篩選解磷解鉀菌株,并對其進行鑒定。結(jié)果表明,從長勢較好的煙草根際土壤中篩選出一株高效解磷解鉀菌株YC4,其對無機磷、難溶性鉀的溶解量分別達到286.33、17.90 mg/L。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性測定及 16S rDNA序列分析確定該菌株為彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)。盆栽試驗結(jié)果表明,接種該菌株的盆栽土壤有效磷、有效鉀含量分別比未接種該菌株處理(對照)提高了6.81%、4.72%;接種菌株處理煙草根總長、根總表面積、根總體積和根尖總數(shù)分別較對照顯著提高45.33%、55.96%、78.00%、28.30%,鮮質(zhì)量約為對照的2倍,株高增幅達21.03%,干質(zhì)量、SPAD值及植株的磷、鉀含量分別較對照提高91.55%、14.03%、18.29%、29.57%。綜上,該菌株可提高植煙區(qū)土壤有效磷、有效鉀含量,促進煙草生長。

根際促生菌； 解磷解鉀菌； 煙草生長

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物,種植面積已超過130萬hm2,居世界首位,主要分布在云南、山東、河南、甘肅、湖南等5個省份。其中，河南省的種植面積居全國第三,主要分布在許昌、南陽、周口和駐馬店等地,是我國濃香型煙葉的代表[1-2]。煙葉除作為卷煙的原料之外,其所含的大量的天然化學(xué)物質(zhì),如煙堿、蛋白質(zhì)、茄尼醇、尼古丁,都是優(yōu)質(zhì)的化工和醫(yī)藥原料[3]。

煙區(qū)土壤中磷、鉀元素含量及供應(yīng)情況對煙草的生長、產(chǎn)量及品質(zhì)有很大的影響。河南省有83.22%的植煙區(qū)土壤有效磷含量低于20 mg/kg,64.83%的植煙區(qū)土壤有效鉀含量低于150 mg/kg,有效養(yǎng)分的缺乏嚴(yán)重制約著煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2,4-5]。提高土壤中有效養(yǎng)分含量是解決這一問題的主要途徑,而長期、大量施用工業(yè)化肥會使有害物質(zhì)殘留量日趨增加,土壤微生態(tài)平衡失調(diào),質(zhì)量下降,同時會引發(fā)水體富營養(yǎng)化,對食品安全、人類健康及生態(tài)環(huán)境造成極大威脅[6]。因此,在當(dāng)今大力發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)的背景下,應(yīng)減少農(nóng)藥和化肥的使用,采用生態(tài)方法促進土壤磷、鉀的溶解,提高有效磷、有效鉀含量[7-8]。而接種土壤中附生于植物根系的某些植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)能夠活化土壤中的無效養(yǎng)分,促進植物生長及其對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用,是生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的有效途徑之一[9-10]。

許昌市是河南省重要的煙葉產(chǎn)區(qū)，而該煙區(qū)土壤速效鉀含量處于缺乏狀態(tài),有效磷含量也處于中等水平[11]。為此,本研究從許昌市煙草種植區(qū)選出一棵長勢較好的煙草,采集其根際土壤,篩選根際菌,分離純化能夠溶解無機磷、難溶性鉀的根際促生菌,進行液體搖瓶培養(yǎng)、煙草盆栽試驗,以期解決植煙區(qū)土壤缺磷、缺鉀問題。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土壤 土壤為許昌植煙區(qū)的0～20 cm潮土,其基本養(yǎng)分含量如表1所示。

表1 供試土壤基本養(yǎng)分含量

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 000 mL,pH 值7.0～7.2,121 ℃滅菌30 min[12]。

無機磷培養(yǎng)基：Ca3(PO4)25 g、葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、KCl 0.3 g、蒸餾水1 000 mL,pH 值7.0～7.2,121 ℃滅菌30 min[12]。

液態(tài)解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g、酵母膏0.5 g、(NH4)2SO41.0 g、K2HPO4·3H2O 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO31.0 g、鉀長石粉1.0 g、蒸餾水1 000 mL, pH 值7.0～7.2,121 ℃滅菌30 min[12]。

若需要用固體培養(yǎng)基時,在以上配方基礎(chǔ)上加瓊脂20 g/L。

1.2 解磷解鉀菌株的篩選

從許昌植煙區(qū)大田中選出一株長勢較好的煙草,除去地上部分,將根部及根部土壤裝入無菌袋中供分析。在實驗室內(nèi),取該煙草樣品根部1 mm范圍內(nèi)的根際土壤,懸浮于無菌水中,即成根際土壤懸浮液,按梯度稀釋后,選擇適當(dāng)稀釋度分別在LB固體培養(yǎng)基上涂平板 ( 每一梯度3～5皿 ),于 28 ℃ 恒溫箱培養(yǎng),根據(jù)菌落形態(tài),挑選LB 平板上生長的單菌落,劃線分離,4 ℃保存在平板上,備用[13-14]。

將分離純化的菌株分別接種于盛有30 mL無機磷培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中,放置于搖床中,于30 ℃ 180 r/min條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后,培養(yǎng)液于10 000 r/min 離心10 min,取上清液,測定有效磷含量。

同時,將分離純化的菌株分別接種于盛有30 mL液態(tài)解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中,按照以上條件進行培養(yǎng),培養(yǎng)液離心后測定有效鉀含量。

1.3 菌株形態(tài)、生理生化及分子鑒定

菌株的形態(tài)鑒定: 將篩選的菌株接種到LB平板上,30 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落大小、形狀、表面形態(tài)、邊緣特征、隆起形狀、透明度、濕潤或干燥、光滑或粗糙、菌落及培養(yǎng)基的顏色等。

菌株生理生化指標(biāo)鑒定：革蘭氏染色、好氧性、接觸酶、甲基紅、乙酞甲基甲醇(V-P)、淀粉水解、明膠水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用等試驗的方法均參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[16]。

菌株分子鑒定: 將菌株用 LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期,離心收集菌體,采用 SDS-CTAB法提取總基因組DNA,采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行16S rDNA 的PCR 擴增。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,然后切膠回收、純化、測序(北京美億美生物技術(shù)有限公司),根據(jù)獲得的16S rDNA序列在GenBank中Blast 搜索同源序列,通過 MEGA 5.0 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。并在NCBI上提交該菌株的分子序列,獲得登錄號。

1.4 解磷解鉀菌的應(yīng)用效果檢測

將供試土壤剔除雜物,過2 mm篩,每個盆裝700 g土壤,選出12棵長勢較好、均勻一致的煙草苗,移栽于已裝好供試土壤的盆中,注射無菌水,使盆栽土壤含水量達到田間持水量的(60± 2)%[18]。盆栽試驗共設(shè)置以下2個處理。接菌處理(YC4)：向盆栽中噴灑10 mL解磷解鉀菌菌液,接種量為108cfu/g,重復(fù)6次;對照(CK)：加入等量的無菌水,重復(fù)6次。培養(yǎng)30 d后取土壤樣品和植株。取樣前選擇晴朗的天氣在8：00—10：00用SPAD-502葉綠素儀活體測量中部葉片的SPAD值,每個葉片測定上(葉尖)、中(葉中部)和下(葉基)3個部位,每個部位測定3次,計算平均值。取樣后,測定株高、鮮質(zhì)量,然后經(jīng)85 ℃殺青30 min 后, 在65 ℃條件下烘干,測定干質(zhì)量,粉碎后過0.45 mm篩,經(jīng)H2SO4-H2O2消化后,分別采用鉬銻抗比色法、火焰光度計法測定植株磷、鉀含量[19];并用根系掃描儀(LA1600+ scanner,Canada)掃描獲得根系圖像,用根系分析軟件(Winrhizo2003b,Canada)分析獲取根總長、根總面積、根總體積、根尖總數(shù)等二維形態(tài)參數(shù);另外,分別采用0.5 mol/L NaHCO3溶液浸提—分光光度計法、2 mol/L HNO3溶液浸提—火焰光度法測定土壤有效磷、有效鉀含量[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根際解磷解鉀菌株的篩選及其對磷、鉀的溶解效果

從煙草根際土壤中共分離純化出9個菌株,分別標(biāo)記為YC1～YC9。經(jīng)過液體培養(yǎng)基搖瓶試驗,結(jié)果表明,9個菌株解無機磷的能力差異較大(圖1)。其中,菌株YC1、YC4、YC6和YC8對無機磷的溶解量達到140 mg/L以上,具有高效的解無機磷能力,顯著高于其他菌株;進一步分析發(fā)現(xiàn),YC4和YC6對無機磷的溶解量能夠達到200 mg/L以上,顯著高于其他菌株,尤其是YC4,對無機磷的溶解量最高,達286.33 mg/L,顯著高于其他菌株。在菌株解鉀能力復(fù)篩試驗中,YC3、YC4、YC8、YC9菌株對難溶性鉀鹽的溶解能力較強,解鉀量達到16 mg/L以上,顯著高于其他菌株;尤其是菌株YC3,其解鉀量最高,達到18.38 mg/L,高于YC4解鉀量17.90 mg/L,但未達到顯著水平。綜合以上結(jié)果,YC4具有高效解磷解鉀能力。

不同字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)圖1 9個菌株對無機磷、難溶性鉀的溶解效果

2.2 YC4菌株的菌落形態(tài)分析

經(jīng)平板劃線可見,YC4菌落呈米黃色,不透明,表面濕潤且扁平,中央向上隆起,邊緣光滑,不規(guī)則桿狀排列,產(chǎn)芽孢(圖2)。

圖2 YC4菌株的菌落形態(tài)

2.3 YC4菌株的生理生化特性分析

經(jīng)過革蘭氏染色、好氧性、接觸酶、甲基紅、V-P、淀粉水解、明膠水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用試驗(表2)發(fā)現(xiàn),YC4菌株兼性厭氧,除檸檬酸鹽利用項目顯陰性外,其他測試項目均呈陽性。

表2 YC4菌株的生理生化特性

注：+為陽性 ;-為陰性。

2.4 YC4菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Blast對YC4菌株16S rDNA序列進行同源性比對發(fā)現(xiàn),菌株YC4與BacillusflexusIFO15715(AB021185)同源性為100%;構(gòu)建菌株YC4的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),并結(jié)合該菌株的生理生化特性,最終鑒定YC4菌株為彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus),在NCBI上提交菌株YC4的16S rDNA序列,并獲得登錄號為KP743125。

圖3 YC4菌株16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5 YC4菌株的應(yīng)用效果

2.5.1 接種YC4對土壤有效磷和速效鉀含量的影響 由圖4 可見,與對照相比,噴灑YC4菌液的盆栽土壤中有效磷、速效鉀含量均有所增加,但差異未達到顯著水平,其中有效磷含量提高了6.81%,速效鉀含量提高了4.72%,說明篩選出的高效解磷解鉀菌YC4能夠促進土壤中無機磷、難溶性鉀的溶解。

圖4 接種YC4菌株對土壤有效磷和有效鉀含量的影響

2.5.2 接種YC4對煙草根系形態(tài)和煙株生長的影響 土壤中的有效養(yǎng)分含量影響煙草根系的生長發(fā)育[20],特別是有效磷含量與煙草苗期的生長發(fā)育關(guān)系密切[21]。由表3可知,接種菌株YC4能夠促進煙草根系的生長發(fā)育,與對照相比,噴灑菌液的煙草根系的總長度、總面積、總體積均極顯著增加,增幅分別達到45.33%、55.96%、78.00%,根尖總數(shù)顯著增加28.30%。

煙草苗期根系形態(tài)的良好建成是地上植株健壯生長的基礎(chǔ)[22]。由表4可知,與對照相比,經(jīng)YC4菌液噴灑的煙草植株鮮質(zhì)量提高近1倍,株高和干質(zhì)量也分別提高了21.03%和91.55%,差異均達到極顯著水平;SPAD值增加14.03%,植株中磷含量增加18.29%,鉀含量增加29.57%,差異均達到顯著水平。SPAD值代表了葉片中葉綠素含量,光合作用是作物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ), SPAD值的提高對作物產(chǎn)量的提升具有重要意義。煙草植株中磷、鉀含量影響著煙葉的香味、可燃性及色澤,是評價煙葉化學(xué)成分和等級分類的重要指標(biāo)。由此可見,噴灑YC4菌液能夠大幅度提高煙草幼苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、株高、SPAD值以及磷、鉀含量,為后期煙葉產(chǎn)量及品質(zhì)的提高打下良好的基礎(chǔ)。

表3 接種YC4菌株對煙草根系形態(tài)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后*、**分別表示處理之間差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01),下同。

表4 接種YC4菌株對煙草植株生長的影響

3 結(jié)論

本試驗從長勢較好的煙草根際土壤中篩選分離出解磷解鉀菌株YC4, 液體搖瓶試驗結(jié)果表明,該菌株具有較強的解無機磷、難溶性鉀的能力,溶解量分別高達286.33 mg/L 、17.90 mg/L。對該菌株的生理生化特性進行分析,并進行基因序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析,最終確定該菌株為彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)。盆栽試驗結(jié)果表明,與對照相比,YC4菌液能夠有效促進土壤中無機磷、難溶性鉀的溶解,提高土壤中磷、鉀的有效含量,促進煙草幼苗根系生長,使根變得更長,根尖數(shù)變多;提高煙草幼苗株高、干鮮質(zhì)量、SPAD值及植株中磷、鉀含量,為提高煙葉產(chǎn)量和改善煙葉品質(zhì)奠定良好的基礎(chǔ),對農(nóng)田中煙草的種植有實際指導(dǎo)意義。

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Screening,Identification of Phosphate- and Potassium-solubilizing PGPR and Its Promoting Effect on Tobacco

WAN Bingbing1,2,LIU Ye1,WU Yue3,LIU Shiliang1,WANG Guowen1,ZHANG Dongyan1,JIANG Ying1*
(1.College of Resources and Environment,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Resources and Environmental Science,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095，China; 3.Soil and Fertilizer Station of Shandong Province,Ji’nan 250100，China)

Some phosphorus- and potassium-solubilizing PGPR strains were isolated from tobacco rhizosphere soil and identified to solve the problem of lack of phosphorus and potassium in tobacco planting soil.The results showed that YC4 strain isolated from tobacco rhizosphere soil could transform the hard-soluble phosphorus and potassium into the soluble nutrients,the transformation amounts of tricalcium phosphate and potassium silicate were 286.33 mg/L,17.90 mg/L respectively.YC4 strain was identified asBacillusflexusbased on morphological observation,physiological and biochemical characteristics test and 16S rDNA gene conserved sequence analysis.Pot experiment results showed that compared with the non-inoculated treatment(CK),the concentrations of available phosphorous and potassium of the treatment inoculated with YC4 significantly increased by 6.81%,4.72% respectively,which led to the root length,surface area,root volumes,root tips number of tobacco increased by 45.33%,55.96%,78.00% and 28.30%,respectively.With respect to plant morphological characteristics,the average wet weight was 2 times higher than the CK,and height of tobacco inoculated with YC4 significantly increased by 21.03%;the dry weight and SPAD value significantly increased by 91.55% and 14.03% respectively,and the total P and total K contents of tobacco significantly increased by 18.29% and 29.57%,respectively.Overall,YC4 strain could improve the contents of total P and total K in soil,promote the growth of tobacco.

PGPR; phosphate- and potassium-solubilizing strain; tobacco growth

2016-03-16

國家自然科學(xué)基金項目(41401274)；河南省煙草公司重點項目(HYKJ201215)；河南省教育廳項目(15A210012,14B210025)；河南省科技廳項目(162102410031)；鄭州市民生進步科技工程項目(131PCXTD613)

萬兵兵(1990-),男,河南商丘人,在讀碩士研究生,研究方向：土壤生態(tài)學(xué)。E-mail：15136200211@163.com

*通訊作者：姜 瑛(1986-),女,河南信陽人,講師,博士,主要從事土壤生態(tài)學(xué)研究。E-mail:JY27486@163.com

S154.39;S572

A

1004-3268(2016)09-0046-06