不同環(huán)境豐富度設(shè)置下豬血清蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析研究

席赫岐，史秀麗

（1.鄭州市第一中學(xué)，河南 鄭州 450052；2.鄭州市電子信息工程學(xué)校）

不同環(huán)境豐富度設(shè)置下豬血清蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析研究

席赫岐1，史秀麗2

（1.鄭州市第一中學(xué)，河南 鄭州 450052；2.鄭州市電子信息工程學(xué)校）

為考察不同環(huán)境豐富度設(shè)置對(duì)豬血清蛋白質(zhì)圖譜的影響，以不同環(huán)境豐富度設(shè)置下的豬血清為材料，分別針對(duì)豬血清1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的稀釋倍數(shù)和12%、10%、8%的分離膠濃度進(jìn)行豬血清蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳參數(shù)優(yōu)化，并對(duì)豬血清蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明：豬血清的適宜稀釋倍數(shù)為1∶9；8%分離膠對(duì)于大于60kDa和小于50kDa的蛋白質(zhì)分離效果較好，12%分離膠對(duì)于50～60kDa間蛋白分離效果較好；共分離到豬血清蛋白質(zhì)21種，18種為各組樣品中均表達(dá)的蛋白質(zhì)，3種為試驗(yàn)組中差異化表達(dá)的蛋白，其中215.11kDa蛋白在試驗(yàn)組各樣品中均表達(dá)；65.29kDa和52.04kDa這兩個(gè)蛋白分別僅在試驗(yàn)組的樣品3、樣品2中表達(dá)。說(shuō)明不同環(huán)境豐富度設(shè)置可以引起豬血清蛋白的差異化表達(dá)。

環(huán)境豐富度；豬血清蛋白；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質(zhì)圖譜

動(dòng)物血清中含有多種蛋白質(zhì)，它們各自有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和分子量，其含量的變化與動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況、親緣關(guān)系、疾病診斷具有重要關(guān)系［1］。血清蛋白質(zhì)的研究常常是利用電泳技術(shù)，把血清中不同蛋白質(zhì)分離，進(jìn)行蛋白質(zhì)圖譜、不同蛋白質(zhì)的定量定性與差異化分析。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以凝膠為支持物，根據(jù)凝膠孔徑大小不同，利用樣品的濃縮效應(yīng)、電泳分離的電荷效應(yīng)實(shí)現(xiàn)不同蛋白質(zhì)的分離。該電泳具有所需樣品量少、分辨率高、結(jié)果可以永久保存、便于樣品的分離、純度鑒定、多態(tài)性分析與分子量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)［2］，正在被越來(lái)越多的血清蛋白質(zhì)研究者所應(yīng)用［3-5］。

豬血清蛋白質(zhì)是一種重要的質(zhì)量性狀生化遺傳標(biāo)記，其蛋白質(zhì)圖譜分析對(duì)豬的遺傳育種、飼養(yǎng)環(huán)境評(píng)價(jià)和疾病診斷有重要意義［6］。然而目前針對(duì)豬血清蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的研究報(bào)道較少。閆美榮等［7］利用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳，把血清進(jìn)行1∶2稀釋，分別采用7%和10%凝膠濃度，分析了黑豬血清蛋白質(zhì)和堿性磷酸酶同工酶生化位點(diǎn)遺傳多態(tài)性。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作難度比較大，影響因素比較多，其中凝膠濃度的確定、樣品上樣量的多少是保障蛋白質(zhì)分離效果的基礎(chǔ)，然而針對(duì)豬血清蛋白質(zhì)電泳有關(guān)膠濃度、上樣量?jī)?yōu)化參數(shù)以及利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳研究不同環(huán)境豐富度設(shè)置下豬血清蛋白質(zhì)圖譜的研究未見(jiàn)報(bào)道。該研究以不同環(huán)境豐富度設(shè)置下的豬血清為材料，針對(duì)血清稀釋倍數(shù)、分離膠濃度進(jìn)行豬血清蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳參數(shù)優(yōu)化與豬血清蛋白質(zhì)圖譜分析研究，目的是建立穩(wěn)定的豬血清SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳體系，為豬血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 豬血清 豬血清來(lái)自河南某規(guī)模豬場(chǎng)不同環(huán)境設(shè)置下的皮特蘭豬血清。環(huán)境設(shè)置以常規(guī)養(yǎng)殖環(huán)境為對(duì)照，在試驗(yàn)組圈舍內(nèi)增加利于豬只啃咬、玩耍的鐵鏈、輪胎等玩具以增加圈舍內(nèi)的環(huán)境豐富度。血清的采集分別從對(duì)照組、試驗(yàn)組隨機(jī)選取3頭豬，從耳靜脈采血5～10 ml，靜置30 min，3 000 r/min 20 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)MARKER（20 to 220 kDa），分子量依次為220、120、100、80、60、50、40、30、20kDa。電泳試劑為三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R-250、甲醇、冰乙酸等。

1.1.3 儀器與設(shè)備 H-1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀，DYY-2C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血清稀釋 豬血清稀釋倍數(shù)按照文獻(xiàn)［8］方法，取豬血清蛋白質(zhì)樣品，用pH6.8Tris-HCL緩沖液分別做1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10稀釋混勻后，在沸水浴中加熱3～4 min，冷卻后備用，上樣量為10 μl，濃縮膠為3%、分離膠為12%，進(jìn)行電泳，考察樣品稀釋倍數(shù)對(duì)電泳效果的影響。

1.2.2 分離膠濃度的選擇 根據(jù)確定的樣品稀釋倍數(shù)，分別采用8%、10%、12%的分離膠進(jìn)行電泳，標(biāo)準(zhǔn)marker的上樣量為5 μl，樣品上樣量10 μl，考察分離膠濃度對(duì)豬血清蛋白質(zhì)電泳效果的影響。

1.2.3 豬血清蛋白質(zhì)圖譜分析 按照參考文獻(xiàn)［9］，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)蛋白分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品蛋白的遷移率計(jì)算相應(yīng)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品稀釋倍數(shù)對(duì)電泳效果的影響

血清中含有多種蛋白質(zhì)，其中以白蛋白為最多，占血清蛋白的60%以上。相同上樣量情況下，適宜的稀釋倍數(shù)決定了蛋白質(zhì)的分離效果，豬血清蛋白質(zhì)樣品適宜稀釋倍數(shù)為1∶9。

2.2 分離膠濃度對(duì)豬血清蛋白質(zhì)電泳效果的影響

分離膠濃度不同，形成的凝膠孔徑不同，凝膠孔徑的大小隨凝膠濃度的增加而降低。通常需要根據(jù)分離蛋白分子量的大小配制不同孔徑的凝膠。標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker在12%、10%、8%的分離膠中，分別跑出7、6、6條帶；在12%分離膠中，大于60kDa的蛋白質(zhì)分離效果不好，50～60kDa蛋白分離條帶較為清晰，40～50kDa蛋白質(zhì)分離效果不好；在10%分離膠中，大于60kDa的蛋白質(zhì)分離條帶中明顯優(yōu)于12%分離膠，但是各蛋白質(zhì)條帶間距離較小，分子量在60kDa左右的蛋白質(zhì)分離條帶不夠清晰。比較3種分離膠對(duì)豬血清蛋白質(zhì)電泳效果，可以明顯看出，8%分離膠對(duì)于大于60kDa蛋白質(zhì)的分離效果最好，小于50kDa蛋白質(zhì)的分離效果優(yōu)于10%、12%的分離膠效果；但對(duì)于50～60kDa蛋白質(zhì)分離效果以12%分離膠效果較好。

2.3 不同環(huán)境豐富度設(shè)置下豬血清蛋白質(zhì)圖譜分析

根據(jù)8%分離膠電泳結(jié)果，建立蛋白質(zhì)Marker的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)下圖。根據(jù)試驗(yàn)組、對(duì)照組每一條帶分離蛋白的遷移率，可以獲得相應(yīng)蛋白的相對(duì)分子量，見(jiàn)下表?？梢钥闯?，8%分離膠共分離到19種蛋白質(zhì)，其中16種蛋白質(zhì)是所有豬血清共有的蛋白，分子量分別為319.52、275.64、231.63、177.28、156.74、133.10、113.02、101.12、91.03、75.29、65.29、63.26、57.53、48.85、43.27、41.26kDa。差異化表達(dá)的蛋白3種，分子量分別為215.11、65.29、52.04kDa。差異化表達(dá)的3種蛋白均出現(xiàn)在試驗(yàn)組，其中215.11kD的蛋白在試驗(yàn)組中均出現(xiàn)，而在對(duì)照組中均不表達(dá)；65.29kDa和52.04kDa這兩個(gè)蛋白僅在試驗(yàn)組的樣品3、樣品2中分別表達(dá)，在其他各組樣品中均沒(méi)有表達(dá)。在每種樣品中表達(dá)量較多的蛋白依次為75.29 kDa、65.29 kDa、91.03 kDa、43.27 kDa、177.28 kDa，并且在各樣品中表達(dá)量無(wú)顯著差異；而分子量為63.26kDa，雖然在所有樣品中都表達(dá)，但是在樣品3中的表達(dá)量明顯少于其他各樣品。說(shuō)明試驗(yàn)組中不同環(huán)境設(shè)施的增加，可以引起豬血清蛋白的差異化表達(dá)。

圖 蛋白質(zhì)Marker8%分離膠的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表 不同環(huán)境設(shè)施下8%分離膠豬血清蛋白質(zhì)圖譜分析

3 結(jié)論與討論

3.1 不同分離膠濃度對(duì)豬血清蛋白電泳效果的影響

正確選擇適宜凝膠濃度是SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳成敗的關(guān)鍵［10］。凝膠濃度不同，電泳分辨率不同。該研究表明：不同的分離膠濃度，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率、帶間距離、條帶數(shù)量不同。比如12%分離膠時(shí)，各樣品中50～60kDa蛋白均可清晰分離到4條帶；而在8%分離膠中，條帶有重合現(xiàn)象，大部分樣品都少于4條帶。但是在8%分離膠中大于60kDa和小于50kDa的蛋白質(zhì)分離效果顯著優(yōu)于10%和12%的分離膠。該研究根據(jù)8%分離膠可分離到19種豬血清蛋白，而結(jié)合12%分離膠，則可以分離到21種豬血清蛋白，其中大于60kDa蛋白有14種，50～60kDa蛋白有4種，小于50kDa蛋白3種，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)［7］所報(bào)道分離到黑豬血清蛋白10～12種。由此可見(jiàn)，分離任何一種混合蛋白，僅用一種凝膠濃度不能確定是否為最佳分離效果，需要將具有不同分子篩效應(yīng)的一系列濃度的凝膠加以比較，才能根據(jù)蛋白質(zhì)的不同分子量范圍篩選出最合適的相應(yīng)凝膠濃度。

3.2 不同環(huán)境豐富度設(shè)置對(duì)豬血清蛋白質(zhì)圖譜的影響

豬血清蛋白質(zhì)圖譜可以反映豬只血液中蛋白質(zhì)狀況，其表達(dá)量的多少和差異化表達(dá)，可以用來(lái)評(píng)價(jià)豬只的健康水平。在豬舍內(nèi)提供利于豬只天性表達(dá)的玩具等設(shè)施提高飼養(yǎng)環(huán)境的豐富度，是改善動(dòng)物福利，實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖的有效措施［11］。環(huán)境豐富度的增加，促使畜禽能在“自然”環(huán)境中表現(xiàn)其“天性”行為，使其心理和生理都達(dá)到健康狀態(tài)［12］。該研究表明，在增設(shè)利于豬只啃咬、玩耍的鐵鏈、輪胎等玩具的試驗(yàn)組豬只都差異化表達(dá)了215.11kDa蛋白，結(jié)合文獻(xiàn)［13］豬血清醋酸纖維薄膜電泳圖譜，推測(cè)該蛋白可能是免疫球蛋白的一種。此外65.29kDa和52.04kDa這兩個(gè)蛋白分別僅在試驗(yàn)組的樣品3、樣品2中表達(dá)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與豬只個(gè)體對(duì)環(huán)境豐富設(shè)施如鐵鏈或者輪胎的偏好傾向性不同有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

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1004-5090（2016）12-0009-03

2016-10-16）