分子標記技術在人參種質資源研究中的應用與展望

侯志芳，雷秀娟，張艷敬，梁韶，王英平，鄭培和

(中國農業(yè)科學院特產研究所，長春130112)

人參(PanaxginsengC.A Meyer)屬五加科人參屬多年生宿根草本藥用植物，是聞名遐邇的“東北三寶”之一。在中國，人參歷來被視為百草之王。人參種質資源是人參生產的源頭，是人參育種的原始材料，是人參產業(yè)發(fā)展的基礎。人參種質資源的好壞直接決定了人參質量的優(yōu)劣和產量的高低，因此，人參種質資源的收集和保存至關重要。新形勢下，種質資源圃是植物的主要保存方式，是植物種質保存的主要場所[1]。種質資源的鑒定也是種質資源必不可少的內容，分子標記技術具有高效、快速等優(yōu)點，有效彌補了多年生植物生長周期長、繁殖難這一缺點，所以分子標記技術可以作為人參種質資源分析和鑒定的一種有效方法。

分子標記通常指在生物個體或群體之間可遺傳并可檢測的具有差異的DNA序列，發(fā)展迅速，滲入到生物學科的各個領域，自20世紀80年代，AFLP作為研究生物遺傳多樣性的方法以來[2]，分子標記技術備受研究者青睞。本文對近些年在人參種質資源研究中應用比較多的隨機擴增多態(tài)性(Random amplified polymorphic，RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)、簡單重復間序列(Inter-simple sequence repeat，ISSR)、相關序列擴增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)等6種分子標記進行總結和討論，為人參的深入研究提供理論基礎。

1　人參種質資源的研究現(xiàn)狀

野生人參和栽培人參是人參種質資源中最主要的兩大類型，其中野生人參為國家珍稀瀕危物種。近年來，由于人們保護不當，人參種質資源遭到嚴重破壞，栽培人參品質下降、品種混亂，野生人參資源更是呈減少趨勢。因此，收集和整理人參種質資源迫在眉睫，急需構建人參種質基因庫[3]。人參栽培歷史悠久，經過不斷選擇和長期進化，栽培人參已形成長脖參、石柱參、邊條參、大馬牙、園膀園蘆、二馬牙等不同的品種類型[4]，但這些大部分只是根據(jù)形態(tài)特征和栽培特點所命名，并沒有規(guī)范明確的命名依據(jù)。人參特有的生長條件和較長的生活周期等外界因素制約了其農藝性狀特征的一致性，因此，在異地栽培條件下根據(jù)其農藝性狀進行準確識別的難度也較大[5]，所以，僅僅靠形態(tài)學標記不能滿足對人參種質資源的收集、鑒別、保護和利用。

2　分子標記技術在人參種質資源研究中的應用

2.1　RAPD分子標記

RAPD分子標記是Williams[6]和Welsh[7]于1990年首次報道的一種較為簡便的檢測DNA多態(tài)性技術，該技術具有簡便、快捷的優(yōu)點，初期深受研究者喜愛。1997年，馮斗等[8]應用RAPD方法首次獲得了人參的DNA特異性擴增片段，對不同人參品種進行了鑒定，結果顯示了2種人參品種的特異性條帶，證實了RAPD方法應用于人參鑒定是可行的。周桐[9]和許永華[10]分別優(yōu)化了人參基因組DNA的提取方法和RAPD-PCR反應條件。結果表明，用改良的CTAB方法提取的DNA均達到了RAPD-PCR分析的要求。Erin M.Schlag等[11]使用RAPD標記研究了西洋參品種間的遺傳多樣性。但由于RAPD標記重復性差、擴增條帶有限等缺點，近年來逐步被其他分子標記技術所取代。

2.2　AFLP分子標記

1993年，荷蘭Keygene公司的Zabeau和Vos 2位科學家提出了一種通過對基因組DNA進行高通量分析的分子標記技術[12]，即AFLP技術。該技術不僅能完成基因組DNA的高通量分析，而且還可以對全基因組多個遺傳變異位點進行分析[13]，在基因流動和遺傳變異等方面被廣泛應用[14]。2000年，馬小軍等[15]應用AFLP技術研究了5個農家類型人參DNA，從其特定指紋中發(fā)現(xiàn)長脖人參更接近野生人參，長脖人參內部有更多的雜合態(tài)個體，因此，長脖人參的AFLP有相對較高的多態(tài)性。但由于該分子標記受多因素影響且有操作復雜、反應步驟多等缺點，很難得到理想的結果，導致該技術在實驗室中應用較少，在人參研究中更是鮮有報道。

2.3　SSR分子標記

SSR也稱作微衛(wèi)星DNA，是基因組中的1～6個核苷酸組成的基本單位多次重復形成的一段DNA，基于此而開發(fā)了SSR分子標記技術[16]。SSR標記根據(jù)兩端相對保守的單拷貝序列設計特異性引物，然后對重復區(qū)域進行PCR擴增，再經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增片段的多態(tài)性。Hong-Il Choi等[17]應用EST-SSR標記評估了人參品種及其相關物種間的遺傳多樣性，平均每對引物可擴增1～4條帶，表明人參具有高度重復的多倍體基因組序列。Nam-Hoon Kim等[18]使用EST-SSR開發(fā)了19個微衛(wèi)星標記，建立了9個韓國品種的認證系統(tǒng)，并分析了這些品種間的系統(tǒng)發(fā)育關系，認為該分子標記將應用于人參種子產業(yè)。由于SSR標記是共顯性遺傳，具有較高的多態(tài)性，且有技術操作簡單、重復性好和特異性強等優(yōu)點，現(xiàn)在人參研究中應用較為廣泛。

2.4　ISSR分子標記

1994年，加拿大Zietkiewicz等[19]提出了一種不需構建繁瑣的基因文庫、隨機選取重復序列和錨定堿基，利用PCR擴增進行檢測的分子標記技術，即ISSR分子標記。ISSR標記無需知道任何靶標序列的SSR背景信息，同時具有DNA用量少、重復性好、操作簡便且DNA多態(tài)性高等優(yōu)點[20]。但ISSR為顯性遺傳標記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型，目前在人參種質資源研究中鮮有報道。

2.5　SRAP分子標記

2001年，Li博士和Qu-iros博士[21]創(chuàng)立了另外一種不需預知物種基因序列，直接利用PCR擴增進行檢測的分子標記技術，即SRAP分子標記。因其具有多態(tài)性豐富、簡單、結果穩(wěn)定、高效、高共顯性、易測序且不需預知物種基因序列信息等優(yōu)點，已逐步被國內、外學者應用于蘋果[22]、馬鈴薯[23]等果蔬的研究中。許永華[24]、宋佳等[25]對竹節(jié)參SRAP-PCR引物退火溫度和擴增體系的dNTPs、Taq DNA聚合酶濃度、DNA模板、引物等條件進行摸索，構建并優(yōu)化了適合竹節(jié)參DNA的SRAP-PCR擴增體系。SRAP技術在人參中的研究鮮有報道，但許永華等基于人參SRAP反應體系的研究成果為SRAP技術應用于人參品種的鑒定奠定了基礎。

2.6　SNP分子標記

SNP是指染色體基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A，G，C，T)突變引起的多態(tài)性，變異形式多種多樣，主要有插入、缺失、轉換和顛換等。SNP具有較高的遺傳穩(wěn)定性，是基因組中最常見、最簡單的多態(tài)性形式，因此，在生物學、醫(yī)學、農學等多領域被廣泛應用。與其它分子標記相比，SNP分子標記分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、易于基因分型，非常適用于種間的快速鑒定。

崔光紅等[26]利用SNP對人參、西洋參藥材進行了鑒別，主要從特異等位基因的發(fā)現(xiàn)、PCR反應體系、引物設計等方面全面證實了SNP在藥材鑒別中的可行性。王洪濤等[27]分別基于線粒體cox2[28]、nad7[29]以及26srDNA[30]部位的SNP位點鑒定了韓國品種“Chunpoong”，同時，還基于線粒體nad7部位的SNP位點鑒定了韓國品種“Gumpoong”和“Chungsun”。Juyeon Jung等[31]通過單核苷酸的差異，開發(fā)了可靠、方便的葉綠體DNA標記來鑒別韓國人參和西洋參產品。Xiaochen Chen等[32]基于DNA條形碼快速鑒定和分析了人參屬人參、西洋參和三七。由于其簡單、穩(wěn)定等優(yōu)點，SNP深受研究者的喜愛，現(xiàn)在在人參品種間的快速鑒定中應用較為廣泛，尤其是在韓國，有很多學者已經應用SNP標記對人參進行了深入研究。

3　問題與展望

分子標記輔助育種[33]是當今作物育種的發(fā)展方向，由于人參生長周期長且形態(tài)標記(如根形、果色)數(shù)量有限，而分子標記不受時間和組織器官的限制，可縮短育種周期，用于當年選擇，因此，對人參選種育種大有裨益。將來的研究，還應充分應用分子標記技術加大對人參重要農藝性狀相關的人參抗逆性、抗病蟲害、豐產、皂苷合成等特殊基因及主要功能基因的挖掘和利用，同時，與其他大田作物相結合[34]，加快在分子輔助育種上的應用進程?？茖W家們已經取得了人參cDNA文庫[35]、葉綠體基因組[36]、EST文庫[37]等一些標志性成果，與此同時，人參在分子生物學領域的研究將走向新的高度、開啟新的篇章。可以預見，在不久的將來，人參分子生物學研究的熱點也將轉向人參基因組學、轉錄組學及蛋白組學等各種組學。相信在不久的將來隨著核酸序列數(shù)據(jù)庫等資源的公共化和各組學的深入研究，人參全基因組測序也必將被公布。并且，cDNA-AFLP[38，39]、cDNA-SRAP[40]和EST-SSR[41]等新型分子標記技術的應用必將極大推動人參等五加科植物各方面的研究，有利于我們開發(fā)出更為直接有效的分子標記技術。同時，借助生物信息學等手段開展與西洋參、竹節(jié)參、三七等近緣種核酸序列數(shù)據(jù)庫等資源的比對，獲取、定位大量影響重要農藝性狀的功能基因，加快人參分子標記輔助育種的發(fā)展速度，為人參優(yōu)良品種選育和種質資源保存提供更加有力的支持。

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