超聲輔助原位生成離子液體分散液相微萃取結合高效液相色譜法分析硫酸沙丁胺醇和鹽酸萊克多巴胺

陳惠芳,黃麗英,黃麗萍

(1.泉州醫(yī)學高等?？茖W校,福建泉州 362000;2.福建醫(yī)科大學 藥學院,福建福州 350004;3.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,福建福州 350004)

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超聲輔助原位生成離子液體分散液相微萃取結合高效液相色譜法分析硫酸沙丁胺醇和鹽酸萊克多巴胺

陳惠芳1,黃麗英2,*,黃麗萍3

(1.泉州醫(yī)學高等?？茖W校,福建泉州 362000;2.福建醫(yī)科大學 藥學院,福建福州 350004;3.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,福建福州 350004)

目的:建立超聲輔助原位生成離子液體分散液相微萃取(UAIS-IL-DLPME)結合HPLC分析硫酸沙丁胺醇(SAL)和鹽酸萊克多巴胺(RAC)的方法。方法:采用綠色環(huán)保的親水性離子液體1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽[C6MIM][BF4]和離子交換試劑雙三氟甲烷磺酰亞胺鋰LiNTF2,超聲輔助原位生成[C6MIM]NTF2,目標化合物SAL、RAC同時被萃取、富集到新生成的疏水性離子液體相中,從而達到萃取、分離和富集的效果。結果:確定最佳的萃取條件是:萃取溶劑為20 μL[C6MIM][BF4]、離子交換劑為LiNTF2、鹽濃度為4%、分散劑為30 μL四氫呋喃、超聲振蕩時間為35 min,離心速度和時間分別為12000 r/min和10 min,SAL和RAC的富集倍數(shù)分別為42.3和39.6,線性范圍10～100 ng/mL。結論:UAIS-IL-DLPME結合高效液相色譜法進行分析,達到了在飼料及動物內(nèi)臟、肌肉樣品中對目標化合物SAL、RAC富集、凈化和快速檢測。

液相微萃取,離子液體,硫酸沙丁胺醇,鹽酸萊克多巴胺

鹽酸萊克多巴胺(Ractopamine,RAC)和硫酸沙丁胺醇(Salbutamol,SAL)屬于擬腎上腺素類藥物,其結構如圖1,二者能明顯增加酮體的瘦肉率[1-2]。當克倫特羅被禁止做為飼料添加劑,鹽酸萊克多巴胺和硫酸沙丁胺醇作為提高經(jīng)濟效益的一種手段添加在飼料中用于促進動物的生長,導致食用其飼料的禽畜組織和肌肉中存在不同程度的殘留,同時也導致在消費者體內(nèi)的藥物殘留一系列問題,影響人類的生命健康[3-4]。目前,除了美國批準萊克多巴胺為豬飼料添加劑外,鹽酸萊克多巴胺及硫酸沙丁胺醇在我國和歐盟等國家均已禁止使用[5-6]。因此,研究建立快速、高效的檢測鹽酸萊克多巴胺及硫酸沙丁胺醇殘留的方法顯得尤為重要,而樣品前處理又是決定待測物質檢測效果的關鍵因素之一[7]。國家檢測標準對于目標化合物RAC、SAL的樣品前處理主要采用固相萃取的方法,其所需有機溶劑用量大、操作繁瑣、萃取時間冗長[8]。為了滿足“綠色”樣品前處理的要求,擴大萃取劑的種類,使用環(huán)境友好的離子液體(Ionic liquid,IL)用于對目標化合物的萃取[9-10]。

圖1 鹽酸萊克多巴胺和硫酸沙丁胺醇化合物結構Fig.1 The compound structure of Ractopamine and Salbutamol

實驗比較了基于疏水性離子液體的分散液相微萃取與原位生成離子液體萃取技術對鹽酸萊克多巴胺及硫酸沙丁胺醇的萃取性能,將原位生成離子液體的液相微萃取新方法與高效液相色譜結合,建立了快速、高靈敏度檢測鹽酸萊克多巴胺及硫酸沙丁胺醇的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽酸萊克多巴胺 標準品,德國Dr.Ehrensorfer公司;硫酸沙丁胺醇 標準品,美侖生物技術有限公司;正庚烷磺酰鈉 色譜級,賽默飛世爾科技中國試劑有限公司;六氟磷酸銨 98%,阿達瑪斯試劑有限公司;1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽 98%,阿拉丁試劑有限公司;1-己基-甲基咪唑四氟硼酸鹽 97%,阿拉丁試劑有限公司;1-丁基-甲基咪唑四氟硼酸鹽 99%,阿拉丁試劑有限公司;六氟磷酸銨 99%,阿拉丁試劑有限公司;雙三氟甲烷磺酰亞胺鋰 99%,阿拉丁試劑有限公司;冰醋酸 色譜級,阿拉丁試劑有限公司;氯化鈉、氫氧化鈉、丙酮、四氫呋喃、甲醇、乙腈,均購自國藥集團化學試劑有限公司除特殊說明外,其他試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。

檢品來源:秘魯進口飼料,美國進口冷凍新鮮梅花肉豬肉,國內(nèi)市場飼料“百日出欄”、“豬猛大”2種飼料,泉州東街菜市場豬肉、豬肝和豬腰。

Agilent1200自動進樣高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;安捷倫化學工作站 美國安捷倫科技有限公司;Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;pH-25 pH計 上海米青科實業(yè)有限公司-雷磁品牌專業(yè)供應商;H1650-W微量臺式高速離心機 廈門寶能科技有限公司;5430-R高速冷凍離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司;BS 124S分析天平 上海奕宇電子科技有限公司;XW-80A旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;SZ-97自動三重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜條件 液相色譜柱:Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫:30 ℃,流速為1.0 mL/min,進樣量:10 μL,二極管陣列檢測器波長:280 nm,流動相比例:乙腈28%,正庚烷磺酸鈉(0.01 mol/L,pH3.20)72%,等梯度洗脫。

1.2.2 離子液體分散液相微萃取與超聲輔助原位生成離子液體分散液相微萃取步驟

1.2.2.1 離子液體分散液相微萃取 在1.5 mL PV管中準確加入目標待測物質(0.1 μg/mL)水溶液1 mL,0.04 g的NaCl,20 μL的[C6MIM][PF6],30 μL四氫呋喃,渦旋混合后,超聲振蕩10 min,以10000 r/min轉速離心10 min,管底可見有機富集相,用微量進樣器吸取富集相20 μL,用20 μL乙腈稀釋,混合均勻后,取10 μL進HPLC 分析。

1.2.2.2 超聲輔助原位生成離子液體分散液相微萃取 在1.5 mL PV管中準確加入目標待測物質水溶液1 mL,0.04 g的NaCl,20 μL的[C6MIM][BF4],30 μL四氫呋喃,渦旋混合后,超聲振蕩10 min混勻后,加入0.01 mol/L的LiNTF2水溶液,管內(nèi)呈現(xiàn)乳濁液體系,超聲振蕩后,以10000 r/min轉速離心10 min,管底可見萃取后原位生成的離子液體,用微量進樣器吸取20 μL,用20 μL乙腈稀釋,混合均勻后,取10 μL進HPLC分析。

1.2.3 萃取條件的考察

1.2.3.1 萃取溶劑的選擇 實驗考察了3種離子液體作為萃取溶劑分別是:1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4MIM][BF4]),1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C6MIM][BF4]),1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C8MIM][BF4]),方法同1.2.2.2進行萃取。

1.2.3.2 萃取溶劑體積的選擇 分別采用萃取溶劑體積為5、10、15、20、25、30 μL,方法同1.2.2.2進行萃取。

1.2.3.3 離子交換試劑種類的選擇 分別考察了NH4PF6與雙三氟甲烷磺酰亞胺鋰(LiNTF2)兩個離子交換試劑,按1.2.2.2進行萃取。

1.2.3.4 離子交換試劑體積的選擇 考察了離子交換試劑的體積分別為250、300、350、400、450、500 μL,按1.2.2.2進行萃取。

1.2.3.5 鹽濃度的選擇 考察了鹽濃度0%、1%、2%、3%、4%、5%,方法同1.2.2.2進行萃取。

1.2.3.6 分散劑種類的選擇 考察加入分散試劑,分別考察加入甲醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃各30μL,方法同1.2.2.2進行萃取。

1.2.3.7 分散劑體積的選擇 考察了分散試劑的體積為10、15、20、25、30、35 μL,方法同1.2.2.2進行萃取。

1.2.3.8 超聲振蕩時間的選擇 分別考察了超聲振蕩時間為10、15、20、25、30、35、40、45 min,方法同1.2.2.2進行萃取。

1.2.3.9 離心速度的選擇 分別考察了離心轉動速度分別為6000、8000、10000、12000、14000 r/min,方法同1.2.2.2進行萃取。

1.2.3.10 離心時間的選擇 考察了離心的時間分別為6、8、10、12、14 min,方法同1.2.2.2進行萃取。

1.2.4 實際樣品提取方法 分別稱取一定量的飼料、動物內(nèi)臟及瘦肉[11],粉碎樣品于50 mL具塞塑料離心管,加入10 mL含5%甲酸的水-乙腈混合溶液(1∶2),室溫下水浴超聲波30 min后,以10000 r/min離心10 min后,精密量取上清液1 mL,在最優(yōu)條件下,按照1.2.2.2實驗方法進行實驗分析,并按1.2.1的色譜條件進行數(shù)據(jù)采集分析。

2 結果與討論

2.1 離子液體分散液相微萃取與超聲輔助原位生成離子液體分散液相微萃取提取效果的比較

按實驗方法1.2.2.1分別采用疏水性的離子液體1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[C6MIM][PF6]、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[C4MIM][PF6]作為萃取劑,進行萃取。以及按實驗方法1.2.2.2采用親水性的離子液體1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽[C6MIM][BF4]作為萃取劑,并且加入離子對試劑雙三氟甲烷磺酰亞胺鋰(LiNTF2)進行萃取使其原位生成離子液體,從而達到萃取目標化合物的效果,繪制峰面積與萃取溶劑的關系圖表。由圖2可以看出用親水性的離子液體[C6MIM][BF4]作為萃取劑,并且采用方法1.2.2.2進行萃取目標化學物,其萃取效果最佳。因此本實驗將采用UAIS-IL-DLPME的方法進行前處理。

圖2 萃取劑類型對萃取效果的影響Fig.2 The influence of extraction agent types of extraction effect

2.2 UAIS-IL-DLPME條件優(yōu)化

2.2.1 萃取溶劑的選擇 萃取溶劑的選擇具有重要的意義,其對萃取效果有顯著的影響。按實驗方法1.2.3.1,繪制峰面積與萃取溶劑的關系圖表。從圖3可以發(fā)現(xiàn),萃取溶劑[C6MIM][BF4]對硫酸沙丁胺醇的萃取效果最好,其次是[C8MIM][BF4],而對于鹽酸萊克多巴胺,[C8MIM][BF4]的萃取效果略高于[C6MIM][BF4],而[C4MIM][BF4]對兩個目標化合物的萃取效果均較不理想,因此綜合考慮分析,選擇[C6MIM][BF4]為萃取溶劑。

圖3 萃取劑種類的選擇Fig.3 The selection of extraction agent

2.2.2 萃取溶劑體積的選擇 萃取溶劑體積會影響目標化合物的萃取效果,按方法1.2.3.2,繪制峰面積與萃取溶劑體積的關系圖表,如圖4,結果表明當萃取溶劑的體積為20 μL時,萃取效果最佳。

圖4 萃取溶劑體積的選擇Fig.4 The selection of the extractant volume

2.2.3 離子交換試劑種類的選擇 原位生成離子液體在萃取目標化合物的過程中,離子交換試劑的選擇尤為重要。按方法1.2.3.3,繪制峰面積與離子交換試劑的關系圖表,如圖5,結果表明離子交換劑為LiNTF2時,萃取效果最佳。

圖5 離子交換試劑種類的選擇Fig.5 The selection of ion exchange solvent

2.2.4 離子交換試劑體積的選擇 離子交換試劑的體積將影響其與離子液體的置換反應的反應完成程度。按方法1.2.3.4,繪制峰面積與離子交換試劑的體積的關系圖表,如圖6,結果表明當離子交換試劑的體積為450 μL時,萃取效果最佳。

圖6 離子交換試劑體積的選擇Fig.6 The selection of ion exchange solvent volume

2.2.5 鹽濃度的選擇 液相微萃取中鹽的加入,會影響最終的萃取效果,按方法1.2.3.5,繪制峰面積與鹽濃度的關系圖表,如圖7,結果表明當鹽加入后萃取效果提高,當鹽濃度為4%時,萃取效果最佳,當鹽濃度為提高到5%時,萃取效果反而下降,因此本實驗選擇鹽濃度為4%。

圖7 鹽濃度的選擇Fig.7 The selection of salt concentration

2.2.6 分散劑種類的選擇 為了提高萃取效果,本實驗考察加入分散試劑,促進離子液體試劑的分散,從而提高萃取效果。按方法1.2.3.6,繪制峰面積與分散劑種類的關系圖表,如圖8,結果表明,加入分散劑四氫呋喃對目標化合物的萃取最佳,因此本實驗選擇分散劑種類為四氫呋喃。

圖8 分散劑種類的選擇Fig.8 The selection of dispersant solvent

2.2.7 分散劑體積的選擇 分散劑體積將影響萃取的效果,按方法1.2.3.7,繪制峰面積與分散劑體積的關系圖表,如圖9,結果表明當四氫呋喃的體積為30 μL時,萃取效果最佳。

圖9 分散劑體積的選擇Fig.9 The selection of dispersant solvent volume

2.2.8 超聲振蕩時間的選擇 超聲振蕩的目的是使萃取目標化合物后的離子液體與離子交換試劑充分地反應,因此,其時間的長短關系到最終的萃取效果,按方法1.2.3.8,繪制峰面積與超聲振蕩的圖表,如圖10,結果表明當超聲振蕩時間為35 min時,萃取效果最佳。

圖10 超聲時間的選擇Fig.10 The selection of ultrasonic time

2.2.9 離心速度的選擇 離心的目的是使原位新生成的疏水性的離子液體與水系分離完成,按方法1.2.3.9,繪制峰面積與離心速度的關系圖表,如圖11,結果表明當離心速度為12000 r/min時,萃取效果最佳。

圖11 離心速度的選擇Fig.11 The selection of centrifugal speed

2.2.10 離心時間的選擇 為了使原位新生成的離子液體被分離得更完全,按方法1.2.3.10,繪制峰面積與離心時間的關系圖表,如圖12,結果表明當離心時間為10 min時,萃取效果最佳。

表1 線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、定量限及富集倍數(shù)
Table 1 Regression equation,correlation coefficient,linear range,limit of quantication and preconcentration factor

分析物線性范圍(ng/mL)線性方程相關系數(shù)r定量限(ng/mL)富集倍數(shù)SAL10～100Y=4089X+123290999603163423RAC10～100Y=13504X+0728770999809579396

圖12 離心時間的選擇Fig.12 The selection of centrifugal time

2.3 最優(yōu)的萃取條件及色譜圖

確定最佳的萃取條件是:萃取溶劑為20 μL[C6MIM][BF4]、離子交換劑為LiNTF2、鹽濃度為4%、分散劑為30 μL四氫呋喃、超聲振蕩時間為35 min,離心速度和時間分別為12000 r/min和10 min。圖13a為鹽酸萊克多巴胺與硫酸沙丁胺醇混合標準溶液濃度100 ng/mL經(jīng)最優(yōu)的UAIS-IL-DLPME條件萃取后的色譜圖,而圖13b為鹽酸萊克多巴胺與硫酸沙丁胺醇混合標準溶液濃度2 μg/mL不經(jīng)UAIS-IL-DLPME萃取的色譜圖。從圖13可以看出經(jīng)過UAIS-IL-DLPME,鹽酸萊克多巴胺與硫酸沙丁胺醇得到了很好的富集。

圖13 萃取后的色譜圖(a)和萃取前的色譜圖(b)Fig.13 Chromatograms of back extraction(a) and Chromatograms of front extraction(b)注:1.硫酸沙丁胺醇(SAL);2.鹽酸萊克多巴胺(RAC)。

2.4 檢測體系的建立與方法學確證

2.4.1 線性范圍、檢測限和富集倍數(shù) 配制SAL、RAC 標準工作液,逐級稀釋,得到一系列不同濃度的樣品溶液。在最優(yōu)條件下進行萃取,并按1.2.1的色譜條件進行數(shù)據(jù)采集,得到相應的峰面積。以濃度X(ng/mL)為橫坐標,相應的峰面積Y為縱坐標擬合工作曲線,如圖14,其在線性范圍內(nèi)線性良好,回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、富集倍數(shù),如表1所示。逐級稀釋標準儲備液,在最優(yōu)條件下對SAL、RAC同時進行萃取,并按1.2.1的色譜條件進行數(shù)據(jù)采集,觀察信噪比(S/N),以S/N>3確定方法的檢測限結果見表1所示。富集倍數(shù)(Preconcentration factor,PF)是指當萃取結束時,萃取溶劑相中目標分析物的濃度(Co.f)和供給溶液相中目標分析物的初始濃度(Caq.ini)之比,計算公式[12]如下:

式(1)

根據(jù)以上公式(1),計算得到目標分析物SAL、RAC的富集倍數(shù)(PF)如表1所示。

圖14 硫酸沙丁胺醇和鹽酸萊克多巴胺線性回歸圖Fig.14 Linear regression graph of Salbutamol and Ractopamine

表3 加標回收率(%)
Table 3 The results of recovery test(%)

分析物400ng/mLRSD500ng/mLRSD600ng/mLRSDSAL937314829442962362RAC10124521103311913245

2.4.2 精密度實驗 為了考察實驗方法的重現(xiàn)性,取0.1 μg/mL的標準溶液,在最優(yōu)條件下按照1.2.2.2實驗方法進行萃取,并按1.2.1的色譜條件進行數(shù)據(jù)采集分析,通過計算物質峰面積的相對標準偏差,考察日內(nèi)精密度和日間精密度,結果見表2,結果表明本法具有良好精密度。

表2 日內(nèi)、日間精密度
Table 2 The results of precision

分析物精密度(RSD%)日內(nèi)日間SAL140202RAC319353

2.4.3 加標回收率實驗 在豬肉樣品中添加標準工作液,選擇高、中、低三種添加水平,分別為60、50、40 ng/mL。在最優(yōu)條件下按照1.2.2.2實驗方法進行實驗分析,每組樣品重復萃取3次,并按1.2.1的色譜條件進行數(shù)據(jù)采集,計算其回收率,確定方法的準確性。

如表3所示,在豬肉樣品中鹽酸萊克多巴胺和硫酸沙丁胺醇的加標回收率在82.9%～110.3%之間。表明本方法具有較好的準確性。

2.5 實際樣品分析

稱取進口飼料5.0500 g,按照1.2.4實驗方法進行實驗分析,測得此進口飼料樣品中SAL含量為18.13(μg/g),RAC含量為2.36(μg/g),如圖15。另取國內(nèi)2種市售飼料樣品,均未檢出目標化合物。結果見表4。

圖15 飼料中SAL與RAC測定的色譜圖Fig.15 Chromatogram of SAL and RAC in Feed注:1.硫酸沙丁胺醇(SAL);2.鹽酸萊克多巴胺(RAC)，圖16同。

稱取進口的豬瘦肉2.0230 g,按照1.2.4實驗方法進行實驗分析,測得此進口豬瘦肉樣品中RAC含量為1.49(μg/g),如圖16,未萃取的進口豬瘦肉的色譜圖,見圖17。另取國內(nèi)市售豬瘦肉、豬肝及豬腰,都未檢出目標化合物。結果見表4。

圖16 進口豬瘦肉中RAC與SAL測定的色譜圖Fig.16 Chromatogram of RAC and SAL in inlet Lean meat

圖17 進口豬瘦肉的色譜圖Fig.17 Chromatogram of imports pig lean meat

表4 飼料、豬瘦肉、豬肝、豬腰中硫酸沙丁胺醇和鹽酸萊克多巴胺的含量測定(n=3)
Table 4 RAC and SAL concentration of fodder,lean meat, pork liver and pork kidney(n=3)

樣品硫酸沙丁胺醇(μg/g)鹽酸萊克多巴胺(μg/g)進口飼料1813236國內(nèi)飼料1--國內(nèi)飼料2--進口豬瘦肉-149國內(nèi)豬瘦肉--國內(nèi)豬肝--國內(nèi)豬腰--

注:“-”表示未檢出或低于檢測限。

3 結論

采用綠色環(huán)保的離子液體[C6MIM][BF4],和離子交換試劑LiNTF2,超聲輔助原位生成[C6MIM]NTF2,建立了原位生成離子液體液液微萃取方法,通過優(yōu)化離子液體的種類和體積、離子交換試劑的種類和體積、鹽濃度、超聲時間、離心速度和時間等影響因素,獲得了最優(yōu)的萃取條件,并結合高效液相色譜法進行分析,達到了對目標化合物SAL、RAC富集、凈化和快速檢測,成功地應用于飼料及豬瘦肉中硫酸沙丁胺醇和鹽酸萊克多巴胺的檢測。本實驗方法簡便快捷,實驗儀器簡單,萃取效果好,萃取溶劑綠色環(huán)保,為今后樣品前處理方法提供了新的路徑。

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Analysis of salbutamol sulfate and ractopamine hydrochloride with ultrasonic assisted in-situ ionic liquid dispersive liquid phase microextraction and HPLC

CHEN Hui-fang1,HUANG Li-ying2,*,HUANG Li-ping3

(1.Department of Pharmacy,Quanzhou Medical College,Quanzhou 362000,China;2.College of Pharmacy,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China; 3.First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China)

Objective:To bring forth a method that analyzes salbutamol sulfate and ractopamine hydrochloride with Ultrasonic assisted in-situ ionic liquid dispersive liquid phase microextraction(UAIS-IL-DLPME)and HPLC. Method:the environmentally-friendly ionic liquid[C6MIM][BF4],ion exchange agent LiNTF2and in-situ formation[C6MIM]NTF2were exploited to extract and concentrate the targeted compounds RAC and SAL in the newly generated hydrophobic ionic liquid for the sake of extraction,separation and concentration. Result:The optimal extraction conditions were determined as follows:extraction solvent for 20 μL[C6MIM][BF4],ion exchanger for LiNTF2,salt concentration for 4%,dispersant for 30 μL tetrahydrofuran,ultrasonic oscillation time of 35 min,the centrifugal speed and time respectively was 12000 r/min and 10 min,SAL and RAC preconcentration factor was 42.3 and 39.5,the linear range of 10 ng/mL to 100 ng/mL. Conclusion:the analysis based on the combination of UAIS-IL-DLPM-E and HPLC has helped to concentrate,purify and quickly detect the targeted compounds RAC and SAL in feed,animal innards and muscle samples.

liquid-phase micro-extraction;ionic liquid;salbutamol;ractopamine

2016-05-18

陳惠芳(1982-)，女，在職研究生，講師，研究方向：藥物和食品的分析檢測研究,E-mail:hfchen00@163.com。

*通訊作者:黃麗英(1964-)，女，博士，教授，主要從事金線蓮及其他藥物分析,E-mail:fjmuhly88@sina.com。

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1002-0306(2016)23-0298-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.047