不同方法比較黃酮類化合物抗氧化性及其構(gòu)效關(guān)系分析

劉慶慶,張薇娜,劉 琴

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院;江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室;江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023)

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不同方法比較黃酮類化合物抗氧化性及其構(gòu)效關(guān)系分析

劉慶慶,張薇娜,劉 琴*

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院;江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室;江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023)

通過三種化學抗氧化方法(DPPH、FRAP和ORAC法)以及細胞抗氧化方法(CAA法)對芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素4種黃酮甙元及它們的糖苷化合物抗氧化活性進行比較研究,結(jié)果表明DPPH和FRAP法基本一致,芹菜素、牡荊素和異牡荊素這類C環(huán)上無羥基且B環(huán)只有一個羥基的黃酮抗氧化性極低;在C環(huán)上的羥基相同時,B環(huán)有3′,4′-鄰二羥基的木犀草素和槲皮素的抗氧化活性顯著高于僅含4′-OH的芹菜素和山奈酚;而ORAC法的結(jié)果與此相反?；瘜W抗氧化測定結(jié)果均表明,當C環(huán)羥基被取代形成3-O-連黃酮苷時其抗氧化活性減小;而A環(huán)上6、8號位的氫被取代形成C-連黃酮苷時其抗氧化性反而會增加。CAA法結(jié)果顯示,當C環(huán)無羥基時,B環(huán)只有一個4-OH的芹菜素及其黃酮苷無細胞抗氧化性,但B環(huán)有兩個羥基的木犀草素及其糖苷卻顯示出較強的氧化性。與化學抗氧化性不同,A環(huán)上C-連黃酮苷的抗氧化性低于其苷元,而C環(huán)O-連糖苷的影響則較為復(fù)雜。

黃酮,化學抗氧化性,細胞抗氧化性,構(gòu)效關(guān)系

正常的代謝過程中會產(chǎn)生多種形式的自由基,這些自由基與細胞信號傳導(dǎo)等多種生理功能有關(guān)[1-2],但過剩的自由基會增加糖尿病、癌癥等疾病的患病風險[3-4]。黃酮類化合物是植物重要的次生代謝產(chǎn)物,其基本骨架結(jié)構(gòu)為兩個芳環(huán)(A環(huán)與B環(huán))通過一個三碳鏈(C環(huán))連接而成[5-6]。黃酮類化合物具有較強的抗氧化能力,能有效清除自由基,因此被認為具有抗衰老、降低慢性非傳染性疾病的患病風險的功能[7-8]。黃酮化合物的種類繁多,其結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系是黃酮研究關(guān)注的焦點之一[9-10]。在這些研究中,不管是采用計算[11]還是實驗方法,主要關(guān)注的是B環(huán)上3′,4′-位和C環(huán)上3-位羥基的影響以及C環(huán)C2=C3雙鍵的影響[12-15],而對于糖苷取代的影響,尤其是C-苷取代對抗氧化性影響的研究還很少。此外,大多數(shù)抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系研究采用單一的評價方法,而不同的抗氧化評價方法機理不同,因此所得到的抗氧化性結(jié)果之間有一定的差異,如Zhang等[16]的研究表明牡荊素在DPPH法中顯示出遠低于槲皮素和蘆丁的抗氧化性,而在ABTS法中卻與蘆丁相當。因此要全面了解黃酮類化合物抗氧化的構(gòu)效關(guān)系需要通過多種方法進行綜合評價。

本文根據(jù)B環(huán)和C環(huán)上羥基的不同及糖苷的聯(lián)接方式不同,選取了芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素4種黃酮甙元及它們的糖苷化合物,通過三種化學抗氧化方法(DPPH、FRAP、ORAC法)和細胞抗氧化方法(CAA法)進行抗氧化性評價,并對它們的抗氧化構(gòu)效關(guān)系進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芹菜素、牡荊素、異牡荊素、山奈酚、木犀草素、葒草素、異葒草素、金絲桃苷、蘆丁,純度≥98% 均購自阿拉丁試劑公司;人肝癌細胞株 HepG2 購自中國科學院腫瘤細胞庫。

Trolox(水溶性維生素E)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH自由基)、2,2′-偶氮二異基脒二鹽酸鹽(AAPH)、2,4,6-三(2′-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)、熒光素鈉(Fluorescein disodium)、2′,7′-二氯熒光二乙酸(DCFH-DA)、細胞培養(yǎng)級二甲基亞砜(DMSO) 購自Sigma-Aldrich公司。

DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%(w/v)胰酶-EDTA消化液、胎牛血清(FBS)、雙抗(penicillin-striptomyin,liquid),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,噻唑藍) 購自 HYCLONE公司。

甲醇、鹽酸、三氯化鐵、無水乙酸鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉 均為分析純 購自南京化學試劑廠。

SpectraMax M2e多功能酶標儀 美國分子儀器公司(MD);UV-2401PC紫外可見分光光度計 日本島津公司;Milli-Q Academic超純水系統(tǒng) 美國 Millipore公司;Allegra 64R高速冷凍離心機 美國貝克曼公司;HERA-cell150 CO2培養(yǎng)箱 美國 Thermo公司;XD30 型倒置顯微鏡 舜宇公司;SX-500快速自動高壓滅菌鍋 日本TOMY Digital Biology公司;JA5003N電子天平 上海精密科學儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DPPH法 所有的黃酮化合物用甲醇配成濃度為0.4 mmol/L的溶液,根據(jù)Liu等[17]的方法進行DPPH自由基清除率ΔA%的測定,同時以Trolox為標品繪制標準曲線。計算結(jié)果(DPPH)以Trolox 當量表示(mmol/mmol),即每毫摩爾樣品對 DPPH清除能力相當于Trolox 的毫摩爾數(shù)。

1.2.2 FRAP法 按照文獻[18]報道配制 TPTZ工作液。用甲醇配制濃度為0.5 mmol/L的樣品溶液,取0.1 mL樣品與 TPTZ 工作液0.9 mL及醋酸鈉緩沖溶液9.0 mL混合,避光封口于37 ℃水浴反應(yīng)30 min后測定596 nm處的吸光度值,同時以Trolox為標品繪制標準曲線。計算結(jié)果(FRAP值)以Trolox 當量表示(mmol/mmol),即每毫摩爾樣品對Fe3+-TPTZ還原能力相當于Trolox 的毫摩爾數(shù)。

1.2.3 ORAC法 根據(jù)參考文獻中的方法[19],用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.2 mol/L)配制濃度均為1.0 μmol/L的樣品溶液,取100 μL樣品與50 μL熒光素鈉(0.4 μmol/L)在96孔板中混合,37 ℃下孵化15 min后快速加入50 μL AAPH溶液(66.66 mmol/L)。在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長538 nm下每隔1 min測定一次,100 min后記錄各樣品的熒光衰減曲線下面積(AUC值),同時以Torlox為標品繪制標準曲線。計算結(jié)果(ORAC值)用Trolox當量表示(mmol/mmol),即每毫摩爾樣品對氧自由基吸收能力相當于Trolox的毫摩爾數(shù)。

1.2.4 細胞抗氧化性(CAA)法

1.2.4.1 細胞培養(yǎng) 本實驗根據(jù)參考文獻[20],將人體肝癌細胞HepG2接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶,用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM作為培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2條件下進行培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況進行換液或者傳代,成長至對數(shù)期的細胞即可用于實驗。

1.2.4.2 MTT實驗 取生長趨勢較好的HepG2細胞,消化后用培養(yǎng)液配制成濃度為2×104個/mL的細胞液,取100 μL細胞懸液加入無菌96孔板,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,再加入100 μL不同濃度(5、10、20、40、80、100、200、400 μmol/L)的樣品溶液(空白用DMEM代替),再培養(yǎng)24 h后加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄孔中液體,再加入200 μL DMSO,于避光37 ℃下充分震蕩30 min,測定570 nm處的OD值。計算不同樣品濃度下HepG2細胞存活率(細胞存活率(%)=(樣品的OD值/空白的OD值)×100 。

1.2.4.3 CAA實驗 取生長趨勢較好的HepG2細胞,消化后用培養(yǎng)液配制成濃度為6×104個/mL的細胞液,取100 μL加入96孔板,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后移去上清液,并用100 μL PBS清洗后加入25 μmol/L的DCFH-DA溶液與不同濃度的樣品溶液(5、10、20、40、80 μmol/L)各50 μL(空白用DMEM代替),繼續(xù)培養(yǎng)1 h后吸棄孔中液體,并立即加入100 μL 25 μmol/L的ABAP,在37 ℃下孵化,測定激發(fā)波長為485 nm,發(fā)射波長538 nm的熒光值,每5 min測一次,共跟蹤測定60 min。

圖1 十種黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of flavonoids

按照如下公式計算不同黃酮類化合物的細胞抗氧化活性(CAA)值:

用fa表示CAA值,fu表示(1-CAA)值,通過lg(fa/fu)與對應(yīng)樣品濃度的對數(shù)值lgC作圖,當lg(fa/fu)=0時對應(yīng)的濃度為樣品清除氧化自由基的半數(shù)有效濃度即EC50值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組實驗均進行三組平行實驗,實驗數(shù)據(jù)以平均值±SD表示,所有顯著性分析均基于p<0.05的顯著水平。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同結(jié)構(gòu)黃酮化合物的化學抗氧化活性比較

圖1是本研究中所涉及的黃酮化合物結(jié)構(gòu)示意圖。

三種化學抗氧化方法(即DPPH、FRAP和ORAC法)的標準曲線分別如下:A1=145.16B-2.0987,R2=0.9990;A2=0.3317 B+0.0444,R2=0.9993;A3=0.2109 B+0.3516,R2=0.9910。式中A1為DPPH自由基清除率,A2為FRAP法中的吸光度值,A3為ORAC法中的AUC值,B為Trolox的濃度。根據(jù)標準曲線,十種黃酮化合物的抗氧化活性測定結(jié)果見表1。

表1 十種黃酮類物質(zhì)的DPpH、FRAP值和ORAC值
Table 1 DPPH、FRAP and ORAC values of ten flavonoids

樣品抗氧化能力mmol(Trolox)/mmol(樣品)DPPHFRAP值ORAC值芹菜素0019±00008g0137±0005f2569±0145ef牡荊素0050±00011f0172±0004e3707±0269a異牡荊素0057±00014f0181±0002e3754±0152a山奈酚0743±0023e1823±0045d3427±0201bc木犀草素1865±0017d1951±0021c1984±0142g葒草素1887±00049c2790±0036b2529±0033f異葒草素1900±0012c2756±0042b2576±0100ef槲皮素2199±0017a3790±0021a3406±0142b金絲桃苷2100±0017b2702±004b2943±0152cd蘆丁2061±0023c2672±0021b2853±0072d

注:肩標字母不同表示差異顯著,p<0.05。

由表1可以看出,DPPH和FRAP法的測定結(jié)果基本一致,即槲皮素、金絲桃苷和蘆丁均顯示出較強的抗氧化能力;其次是木犀草素、葒草素、異葒草素和山萘酚,而牡荊素、異牡荊素和芹菜素均顯示較低的抗氧化能力。在兩種方法中槲皮素均表現(xiàn)出最強的抗氧化性,而芹菜素則表現(xiàn)出最低的抗氧化性。但是,ORAC法的結(jié)果與前兩者均存在較大差異,前兩者測定中抗氧化性很低的芹菜素、牡荊素、異牡荊素和山奈酚在ORAC法中均表現(xiàn)出較高的抗氧化能力,其中牡荊素和異牡荊素抗氧化能力最高,約為Trolox的3.7倍。三種方法中的抗氧化性結(jié)果一致的是B環(huán)上均含兩個羥基的黃酮醇及其糖苷衍生物槲皮素、金絲桃苷和蘆丁的抗氧化性大于同樣是B環(huán)上有兩個羥基的黃酮及其黃酮苷木樨草素、葒草素和異葒草素;牡荊素、異牡荊素的抗氧化性大于芹菜素;葒草素、異葒草素的抗氧化性大于木樨草素;槲皮素的抗氧化性大于金絲桃苷和蘆丁。

2.2 黃酮類化合物細胞抗氧化活性的比較

2.2.1 十種黃酮類物質(zhì)的MTT實驗結(jié)果 細胞抗氧化性實驗(CAA法)作為近年來廣泛使用的抗氧化能力測定方法,其以細胞為反應(yīng)主體,更加接近人體生理條件。在考察CAA前,必須先保證實驗中所用濃度范圍內(nèi)的樣品不會對細胞產(chǎn)生毒性,以防對結(jié)果產(chǎn)生干擾。MTT法測定細胞毒性的結(jié)果如圖2。

圖2 十種黃酮類物質(zhì)在不同濃度下的細胞存活率Fig.2 Cell survival probability of ten flavonoids

由圖2可知,這十種黃酮類物質(zhì)在濃度0～400 μmol/L范圍內(nèi)時細胞存活率在90%～110%之間,細胞致死率在10%之內(nèi),不會對HepG2產(chǎn)生明顯毒性,所以樣品可在0～400 μmol/L范圍內(nèi)進行CAA實驗。

2.2.2 十種黃酮類物質(zhì)的CAA實驗結(jié)果 圖3為不同濃度的樣品對人體肝癌細胞HepG2中熒光強度的變化隨時間的動力學曲線。由圖3可見山奈酚、木犀草素、葒草素、異葒草素、槲皮素、金絲桃苷和蘆丁這7種樣品濃度在5～80 μmol/L范圍內(nèi)隨著化合物濃度增加,細胞內(nèi)的熒光值顯著降低,說明以上7種黃酮都能有效抑制細胞內(nèi)氧化自由基的產(chǎn)生,且其抗氧化能力與濃度正相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn),芹菜素、牡荊素和異牡荊素這3種黃酮即使?jié)舛葟? μmol/L增加到400 μmol/L時其細胞熒光值的變化不明顯,這表明芹菜素、牡荊素和異牡荊素幾乎不表現(xiàn)出細胞抗氧化性,這與Wolfe等[9]人的研究結(jié)果一致。

根據(jù)有顯著細胞抗氧化活性的7種樣品的熒光曲線下積分面積(AUC值),按照1.2.4.3計算CAA 值,再通過對數(shù)法作lg(fa/fu)與lgC的線性回歸方程,當lg(fa/fu)=0時對應(yīng)的濃度為樣品清除氧化自由基的半數(shù)有效濃度即EC50值(圖4),EC50值越低,表明其細胞抗氧化性越高。

圖4 七種黃酮抑制活性氧氧化DCFH的EC50值Fig.4 EC50 Values for inhibition of peroxyl radical-induced DCFH oxidation by seven flavonoids

由圖4可見,除去不顯示細胞抗氧化性的芹菜素、牡荊素和異牡荊素外,木犀草素具有最高的細胞抗氧化性,山奈酚其次,葒草素和異葒草素這兩個木犀草素的C-連糖苷異構(gòu)體的抗氧化性低于山奈酚。盡管C環(huán)上多了一個羥基,但槲皮素的細胞抗氧化性反而低于B環(huán)羥基相同而C環(huán)無羥基的木犀草素;C環(huán)上被單糖取代的金絲桃苷的抗氧化性低于甙元槲皮素,而二糖取代的蘆丁反而高于甙元槲皮素。這與化學抗氧化性不同,說明黃酮C環(huán)上的羥基可能對細胞抗氧化性的貢獻不起主要的作用。

2.3 抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系分析

2.3.1 化學抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系分析 研究表明,C環(huán)、B環(huán)的羥基是影響黃酮類化合物的抗氧化性的主要因素。前線軌道理論和脂質(zhì)過氧化實驗表明,B環(huán)羥基是影響黃酮類物質(zhì)抗氧化性的關(guān)鍵基團:孫慶雷[11]等人通過理論計算,說明黃酮抗氧化性與B環(huán)羥基的位置及數(shù)量密切相關(guān);劉帥濤[14]等也通過對四種黃酮小分子清除DPPH自由基能力的比較發(fā)現(xiàn)B環(huán)上的鄰二酚羥基比只有一個4-OH結(jié)構(gòu)的抗氧化性強,這與本研究的DPPH和FRAP結(jié)果一致,即C環(huán)沒有羥基且B環(huán)只有一個4′-OH的芹菜素、牡荊素和異牡荊素均表現(xiàn)出極低的抗氧化性。B環(huán)比山奈酚多一個3′-OH的槲皮素,其DPPH和FRAP值都約為山奈酚的2～3倍。

圖3 十種黃酮類物質(zhì)對HepG2細胞熒光強度-時間動力學曲線的影響Fig.3 Effects of ten flavonoids on fluorescence in HepG2 cells

然而,與DPPH和FRAP法相反,在ORAC法中當A環(huán)和C環(huán)相同,B環(huán)只有一個4′-OH的化合物的抗氧化性反而高于B環(huán)上含3′,4′-鄰二羥基的黃酮,如芹菜素、牡荊素和異牡荊素的抗氧化性分別高于木犀草素、紅草素和異葒草素;山萘酚的抗氧化性高于槲皮素。這與Tabart等[21]的報道相似,在他們的研究中分別采用了TEAC法、DPPH法和ORAC法對不同黃酮類化合物進行抗氧化性比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TEAC法和DPPH法中,槲皮素的抗氧化性高于山奈酚,但是在ORAC法中山奈酚的抗氧化性卻高于槲皮素。目前還沒有解釋這一現(xiàn)象的報道,這一差異可能與抗氧化機理有關(guān):前兩種方法中黃酮化合物的抗氧化性是分別基于電子轉(zhuǎn)移的自由基清除和氧化態(tài)的還原,而ORAC法是基于氫原子轉(zhuǎn)移的抗氧化劑與熒光探針競爭結(jié)合自由基的過程[22]。此外,溶劑體系的不同導(dǎo)致黃酮化合物的結(jié)構(gòu)差異可能是影響其抗氧化能力的原因之一:DPPH法采用的是有機溶劑體系,FRAP法采用的是酸性溶液體系(pH3.0),而ORAC法則是pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液體系,在前兩種方法中黃酮B環(huán)上的羥基氫不會發(fā)生解離,而在pH7.4的條件下,B環(huán)上有鄰二羥基的其中有一個氫可能會發(fā)生解離,而剩下的一個羥基就會跟鄰位的氧負離子形成氫鍵,導(dǎo)致其氫轉(zhuǎn)移能力下降,從而可能導(dǎo)致抗氧化能力有所下降,當然這一推論的證明需要黃酮上不同酚羥基的解離常數(shù)為依據(jù)。4種甙元中的槲皮素和山奈酚抗氧化性高于芹菜素和木犀草素,可見在ORAC法中C環(huán)3-OH作用高于B環(huán)的鄰二羥基。

三種化學抗氧化性結(jié)果也有共同點,如:槲皮素的抗氧化性高于木犀草素,山奈酚高于芹菜素,可見在A環(huán)和B環(huán)相同的情況下,C環(huán)含羥基的黃酮抗氧化性高于C環(huán)無羥基的化合物;再如金絲桃苷和蘆丁的抗氧化性低于槲皮素,說明當C環(huán)上的羥基被糖取代,形成O-連糖苷后會減弱其抗氧化性。郭春梅[12]等人通過Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生·OH,比較了黃酮類化合物對·OH的清除能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素對·OH的清除作用比蘆丁強,這與本文的結(jié)果相似。林親錄[13]等人認為黃酮類成苷后位阻增大是導(dǎo)致抗氧化能力降低的原因;陸曦[23]等人比較了四種黃酮類化合物及五種具有羥基的化合物對超氧自由基的清除能力,也發(fā)現(xiàn)槲皮素的抗氧化活性高于蘆丁。另外,葒草素和異葒草素的抗氧化性均高于木犀草素,牡荊素和異牡荊素的抗氧化性也高于甙元芹菜素,表明黃酮類化合物A環(huán)的C-連糖苷反而增加抗氧化性,這在ORAC法中表現(xiàn)得更為突出,因此A環(huán)C-連糖苷可能會對抗氧化性有促進作用,這可能是A環(huán)上C-苷取代會增加其鄰位及對位羥基的電子云密度,從而導(dǎo)致A環(huán)羥基的還原性增加。目前還很少有對這一類黃酮化合物的抗氧化性進行比較的報道。

2.3.2 細胞抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系分析 細胞抗氧化性(CAA)是測定抗氧化物質(zhì)通過細胞膜進入細胞內(nèi)清除細胞內(nèi)活性氧的能力。CAA法的結(jié)果中芹菜素、牡荊素和異牡荊素幾乎沒有細胞抗氧化性,說明黃酮C環(huán)和B環(huán)羥基對其細胞抗氧化性也具有顯著的影響,C環(huán)無羥基且B環(huán)只有一個羥基的物質(zhì)無細胞抗氧化活性,這與Wolfe[9]和Hofer[24]的報道一致。但本研究中C環(huán)有一個羥基且B環(huán)有兩個羥基的槲皮素,其細胞抗氧化性比B環(huán)、C環(huán)各有一個羥基的山奈酚以及只B環(huán)有兩個羥基的木犀草素都低。該結(jié)果與Hofer等[24]的報道一致,在他們的研究中采用了細胞抗氧化性和細胞磷脂抗氧化性測定方法比較了包括槲皮素、木犀草素和山奈酚在內(nèi)的黃酮化合物的抗氧化性,結(jié)果表明木犀草素和山奈酚的細胞抗氧化性遠高于槲皮素,與本文的結(jié)果相同,木犀草素略高于山奈酚。但是Wolfe等[9]的報道卻剛好相反,槲皮素表現(xiàn)出最好的抗氧化性,山奈酚緊隨其后。此外,在本研究中發(fā)現(xiàn)O-連糖苷對細胞抗氧化性的影響比較復(fù)雜,如甙元槲皮素強于單糖苷金絲桃苷而低于雙糖苷蘆丁。在Wolfe等[9]的報道中蘆丁沒有細胞抗氧化性,而在Tabart等[21]的研究中采用了血紅細胞進行細胞抗氧化性實驗,結(jié)果表明楊梅素蕓香苷的細胞抗氧化性大于其對應(yīng)的甙元楊梅素,這與我們實驗的結(jié)果槲皮素蕓香苷(蘆丁)的細胞抗氧化性高于槲皮素的結(jié)論相近。在本文的CAA實驗中還發(fā)現(xiàn),與化學抗氧化性不同,A環(huán)的C-連糖苷葒草素和異葒草素均低于其甙元木犀草素,有關(guān)A環(huán)C-連糖苷對其細胞抗氧化性的影響還鮮有報道。

3 結(jié)論

抗氧化能力是功能食品的標簽之一。然而,目前還沒有任何一種方法可以準確的評價出食品的抗氧化性,這就需要對抗氧化成分的構(gòu)效關(guān)系進行深入研究。本文采用三種化學抗氧化方法和細胞抗氧化方法,測定了十種黃酮類化合物的抗氧化活性,基于溶劑體系對黃酮結(jié)構(gòu)的影響和各自的反應(yīng)機理,由不同的化學抗氧化性測定結(jié)果得到的構(gòu)效關(guān)系既有共性,又有差異。與化學抗氧化方法相比,基于細胞的抗氧化測定方法更具有實際意義,但細胞抗氧化性強弱與樣品濃度、同質(zhì)膜的融合程度以及細胞透膜特性等密切相關(guān),實驗方法也較為復(fù)雜。與黃酮類化合物的化學抗氧化性報道相比,基于細胞的研究還很少,不同的研究中結(jié)果差異也較大,因此黃酮類化合物細胞抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系仍需更深入的探索。

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Comparison studies on antioxidant capacities of flavonoids by different assays and the structure-activity relationship implication

LIU Qing-qing,ZHANG Wei-na,LIU Qin*

(College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China)

The antioxidant activities of four flavonoids(apigenin,kaempferol,luteolin,quercetin)and their glycosides were studied by using three chemical assays(DPPH,FRAP and ORAC assays)and cellular antioxidant activity(CAA)method. Both DPPH and FRAP assays showed that apigenin and its glucosides with only one-OH on B ring but without C-OH showed extremely low antioxidant capacity. Flavonoids with 3′,4′-OH on B-ring showed significant higher antioxidant activity than those had only one 4′-OH when they had same structure of C ring. For example,luteolin and quercetin had higher antioxidant activity than that of apigenin and kaempferol,respectively. In the mean time,ORAC assay gave a contrary result. All three chemical assays showed that the antioxidant activities were decreased when C-3-OH was substituted by glycosyl,which suggested that 3-OH on C-ring also contributed to antioxidant capability of flavonoids. Antioxidant capabilities of flavonoids were increased when A-ring was glycosylated at 6 or 8 position and formed C-glycosides. CAA results showed that apigenin and its glycosides with only one OH on B ring but no C-OH had no cellular antioxidant activity. Luteolin with two-OH on B-ring but no C-3-OH showed higher antioxidant activity. Unlike those chemical methods,C-glycosylation on A ring decreased the CAA of its aglycone. The antioxidant activity effect of O-glycosylation on C-ring was more complicated compared with chemical assays.

flavonoids;chemical antioxidant activity;cellular antioxidant activity;structure-activity relationship

2016-07-04

劉慶慶(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：liuqq0419@163.com。

*通訊作者:劉琴(1968-)，女，博士，教授，研究方向：食品化學，E-mail：liuqin31@sina.com。

江蘇省高校自然科學研究重大項目( 11KJA550001) ;江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目。

TS201.2

A

1002-0306(2016)23-0109-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.012