沙棘籽粕原花青素制備、體外抗氧化及細(xì)胞活力評(píng)價(jià)

張佳嬋,王昌濤,孫寶國(guó),曲悠歌

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué),北京 100048;3.植物資源研究開發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京工商大學(xué),北京 100048;4.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心 北京工商大學(xué),北京 100048)

?

沙棘籽粕原花青素制備、體外抗氧化及細(xì)胞活力評(píng)價(jià)

張佳嬋1,2,王昌濤2,3,孫寶國(guó)2,4,*,曲悠歌3

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué),北京 100048;3.植物資源研究開發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京工商大學(xué),北京 100048;4.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心 北京工商大學(xué),北京 100048)

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了沙棘籽粕原花青素的提取方法,條件為80%乙醇,提取溫度35 ℃,液料比8∶1 mL/g,時(shí)間1.5 h,pH3.0,在該條件下的原花青素提取率為(97.31±0.48) mg/g沙棘籽粕;對(duì)提取得到的原花青素提取物進(jìn)行了DPPH自由基和羥自由基清除能力實(shí)驗(yàn),并分析得到IC50,發(fā)現(xiàn)沙棘籽粕原花青素提取物的DPPH自由基清除能力較維生素C強(qiáng);羥自由基清除能力較弱;MTT法測(cè)定了沙棘籽粕原花青素提取物對(duì)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞活力的抑制作用,分析得到24、48、72 h處理時(shí)間下提取物IC50分別為542.78、199.25、82.58 μg/mL。結(jié)論:沙棘籽粕提取物對(duì)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用,隨著劑量和時(shí)間的增加,呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。

沙棘籽粕原花青素,抗氧化,細(xì)胞活力

沙棘(HippophaerhamnoidesL.),主要存在于亞歐大陸,是我國(guó)西部生態(tài)治理的優(yōu)選植物。大量研究證實(shí)了沙棘具有抗炎、抗癌[1-3]等功效。沙棘籽粕是沙棘籽經(jīng)過(guò)脫油處理后的副產(chǎn)物,N A Ushakova等人[4]研究發(fā)現(xiàn)沙棘籽粕中含有較多纖維素、半纖維素等物質(zhì),一般作為飼料或廢棄物丟棄,造成了資源的浪費(fèi)。前期研究發(fā)現(xiàn)原花青素是沙棘籽粕中最主要的極性活性成分,且含量較高,若能將沙棘籽粕中的活性成分原花青素提取并加以利用,將顯著提高沙棘籽粕的利用價(jià)值,提高經(jīng)濟(jì)效益。

很多食源性的原花青素可以在日常生活中被人們所攝取,并且具有很強(qiáng)的生物活性,如降血糖[5]、抗癌[6]、預(yù)防心血管疾病[7]等。沙棘原花青素的功效作用也引起了少量研究者的重視:Heejin Kim[8]發(fā)現(xiàn)沙棘籽水提物具有潛在的預(yù)防皮膚光老化的功效;在C Widen[9]的研究中,沙棘具有比其他漿果更好的保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害的功效;Manimaran Manickam[10]還發(fā)現(xiàn)沙棘水提物還可以通過(guò)影響JAK/STAT信號(hào)通路來(lái)減輕神經(jīng)細(xì)胞免受缺氧損害。由于文獻(xiàn)中沙棘原花青素是從沙棘果實(shí)中提取得到,有別于沙棘籽粕原花青素的提取位置,可能含有不同種類或配比的原花青素,所以初步探索沙棘籽粕中的原花青素功能特性也具有一定的意義。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了沙棘籽粕原花青素的提取方法,并對(duì)提取后的原花青素粗提物進(jìn)行了化學(xué)抗氧化功效評(píng)價(jià)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探索了沙棘籽粕原花青素提取物對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力,以及對(duì)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞活力的抑制作用,本實(shí)驗(yàn)的完成為沙棘籽粕原花青素的更深一步的功效研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘籽粕 青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰?蘆丁、原花青素 中國(guó)藥品生物制品檢定所;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、鹽酸、鄰二氮菲 北京化工廠;抗壞血酸(分析純≥99.7%) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼)、胰酶(1∶250) 美國(guó)Sigma Aldrich公司;DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、PBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素 美國(guó)GIBCO生命技術(shù)公司;小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

BS2202S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DSHZ-300恒溫水浴振蕩器 江蘇省太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;2-16N型醫(yī)用高速離心機(jī) 湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司;Elx-808型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司;T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原花青素含量的測(cè)定 原花青素含量的測(cè)定方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[10],并做適當(dāng)修改。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確配制1 mg/mL濃度的原花青素-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液作為母液。分別量取0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 mL母液于6只離心管中,再分別量取4.75、4.5、4、3.5、3、2.5 mL甲醇溶液將6個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品補(bǔ)齊至5 mL。所得六種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。再取6只離心管,分稱取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL,各加入2.5 mL 3%香草醛-甲醇溶液及2.5 mL 30%硫酸的甲醇溶液。30 ℃水浴反應(yīng)20 min。測(cè)定500 nm下吸光度值。制定濃度與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用0.5 mL甲醇代替標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)操作,作為參比液。

樣品的測(cè)定:取待測(cè)樣品0.5 mL于離心管,分別加入2.5 mL 3%香草醛-甲醇溶液及2.5 mL 30%硫酸的甲醇溶液。30 ℃水浴反應(yīng)20 min。測(cè)定500 nm下吸光度值。對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中原花青素含量。

1.2.2 沙棘籽粕原花青素提取溶劑的選擇 固定提取溫度40 ℃、液料比6∶1 mL/g、自然pH(pH為5～5.5),提取時(shí)間2 h,轉(zhuǎn)速120 r/min,選擇文獻(xiàn)報(bào)道的常見(jiàn)[10]提取溶劑丙酮、甲醇、乙醇為研究對(duì)象,探討0、20%、40%、60%、80%、100%這六種濃度對(duì)提取率的影響。設(shè)置三組平行。

1.2.3 沙棘籽粕原花青素提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 液料比單因素實(shí)驗(yàn):設(shè)置液料比分別為6∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g,固定乙醇濃度為80%,提取溫度40 ℃,提取時(shí)間2.0 h,自然pH(pH為5～5.5),將提取液減壓抽濾后定容到100 mL容量瓶中,混合均勻后測(cè)定原花青素含量。設(shè)置三組平行。

溫度單因素實(shí)驗(yàn):將提取溫度分別設(shè)定為20、30、40、50、60 ℃,固定乙醇濃度80%,提取時(shí)間2.0 h,液料比6∶1 mL/g,自然pH(pH為5～5.5),將提取液減壓抽濾后定容到100 mL容量瓶中,混合均勻后測(cè)定原花青素含量。設(shè)置三組平行。

提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn):固定因素乙醇濃度80%,提取溫度40 ℃,液料比6∶1 mL/g,自然pH(pH為5～5.5)時(shí),提取時(shí)間分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h,將提取液減壓抽濾后定容到100 mL容量瓶中,混合均勻后測(cè)定原花青素含量。設(shè)置三組平行。

提取pH單因素實(shí)驗(yàn):固定因素乙醇濃度80%,提取溫度40 ℃,液料比6∶1 mL/g,提取時(shí)間2.0 h,提取pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,將提取液減壓抽濾后定容到100 mL容量瓶中,混合均勻后測(cè)定原花青素含量。設(shè)置三組平行。

1.2.4 沙棘籽粕原花青素乙醇提取工藝的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取考察的四個(gè)單因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì),按照正交設(shè)計(jì)表格(表1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并測(cè)定原花青素含量。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表
Table 1 Orthogonal factor level table

水平因素A溫度(℃)B液料比(mL/g)C時(shí)間(h)DpH1258∶1152523010∶1203033512∶12535

1.2.5 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[11],并做適當(dāng)修改。

取1.5 mL待測(cè)液加入到1.5 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液中,迅速混勻,室溫下避光靜置30 min后于517 nm下測(cè)吸光度值,記錄為A1。

取1.5 mL無(wú)水乙醇加入到1.5 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液中,迅速混勻,室溫下避光靜置30 min后于517 nm下測(cè)吸光度值,記錄為A2。

取1.5 mL 無(wú)水乙醇加入到1.5 mL待測(cè)液中,迅速混勻,室溫下避光靜置30 min后于517 nm下測(cè)吸光度值,記錄為A3。

DPPH自由基清除率的計(jì)算公式為:

清除率(%)=100%×(A2+A3-A1)/A2

1.2.6 羥自由基清除實(shí)驗(yàn) 羥自由基清除實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12-13],并做適當(dāng)修改。取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液于試管中,依次加入1 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH7.40)和0.5 mL蒸餾水,充分混勻后,加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液(FeSO4),混勻后,加入0.5 mL 0.01%雙氧水(H2O2),于37 ℃水浴60 min后,在536 nm測(cè)其吸光值,所得數(shù)據(jù)為損傷管吸光度A損傷。未損傷管以0.5 mL蒸餾水代替損傷管中的0.5 mL 0.01%雙氧水,操作方法同損傷管,可測(cè)得536 nm未損傷管的吸光度值A(chǔ)未損傷。樣品管以0.5 mL樣品代替損傷管中的0.5 mL蒸餾水,操作方法同損傷管,可測(cè)得536 nm樣品管中的吸光度A樣品。

按照下式計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率:

清除率I(%)=(A樣品-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100

1.2.7 粗提原花青素凍干粉的制備 采用正交實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行原花青素的提取,對(duì)所得原花青素進(jìn)行冷凍干燥,條件為-80 ℃,0.03 mbar,48 h。由此得到沙棘籽粕原花青素粉末。

1.2.8 粗提原花青素的抗氧化活性 將粗提原花青素凍干粉配制不同濃度的粗提原花青素溶液,對(duì)不同濃度原花青素溶液分別進(jìn)行DPPH自由基和羥自由基清除率實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16培養(yǎng)于含10%新生牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中,以0.05%胰酶消化傳代。

1.2.10 MTT法檢測(cè)粗提原花青素對(duì)小鼠B16細(xì)胞活力的影響 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[14],并做適當(dāng)修改。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B16細(xì)胞以0.05%胰酶消化、細(xì)胞培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100 μL、5000個(gè)細(xì)胞,過(guò)夜后每孔加入100 μL含不同濃度樣品的培養(yǎng)液或空白對(duì)照組培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)設(shè)置調(diào)零組、細(xì)胞對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組粗提原花青素培養(yǎng)液濃度分別為454.45、90.91、45.45、9.09、4.55 μg/mL,每組至少6個(gè)平行孔。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),分別處理24、48、72 h。常規(guī)方法加入5 mg/mL MTT溶液處理,DMSO溶解,37 ℃孵育10 min,測(cè)定490 nm下吸光度值。

細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組-調(diào)零組)/(細(xì)胞對(duì)照組-調(diào)零組)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘籽粕主要成分測(cè)定

表2為沙棘籽粕主要成分及活性物質(zhì)含量表,依照國(guó)標(biāo)GB/T 18868-2002《飼料中水分、粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、賴氨酸、蛋氨酸快速測(cè)定 近紅外光譜法》測(cè)定沙棘籽粕中的粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪含量,分別為17.90±0.47、11.20±0.78、6.74±0.78 g/100 g干物質(zhì);依照GB/T 5009.88-2008《食品中膳食纖維的測(cè)定》測(cè)定沙棘籽粕總膳食纖維含量,為(33.20±1.47) g/100 g干物質(zhì)。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),沙棘籽粕纖維類物質(zhì)含量較多,高達(dá)45%。此外,還含有其他未知成分約31 g/100 g干物質(zhì)。

表2 沙棘籽粕主要成分含量
Table 2 Chemical compounds of seabuckthorn seed residues

項(xiàng)目含量(g/100g干物質(zhì))粗脂肪674±078粗蛋白質(zhì)1790±047粗纖維1120±078總膳食纖維3320±147

2.2 提取溶劑的篩選

丙酮、乙醇、甲醇是常用的活性成分提取溶劑,三者均可不同程度的滲透植物細(xì)胞,使原花青素溶出。圖1顯示不同提取溶劑在不同濃度下提取原花青素的結(jié)果。丙酮、乙醇、甲醇隨著溶劑濃度的逐漸升高(0%～80%范圍),均有利于原花青素的提取,當(dāng)100%純?nèi)軇┨崛r(shí),僅有甲醇的提取率較高,乙醇和丙酮下降迅速,且以丙酮下降幅度最大。該結(jié)果與紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐奶崛15]結(jié)果略有不同,彭芳剛在研究紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐奶崛」に嚂r(shí),同樣考察了該三種提取溶劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在一定范圍內(nèi),均隨著濃度的升高而提取效果增強(qiáng),但是濃度大于80%時(shí),提取效果驟然下降;但是與本論文結(jié)果相異的是,丙酮的提取效果為最好。這可能是由于研究對(duì)象的不同,沙棘籽粕的主要物質(zhì)及結(jié)構(gòu)與紅蓮?fù)馄げ町愝^大,故與溶劑的作用機(jī)制不同。因此,本論文同時(shí)考慮到甲醇毒性較高,且乙醇為溶劑提取原花青素的得率也已達(dá)到80 mg/g,處于較高水平,所以選擇80%乙醇為提取溶劑,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 提取溶劑及濃度對(duì)原花青素含量的影響Fig.1 Effect of extraction solutions and concentration on proanthocyanidin content

2.3 多種因素對(duì)沙棘籽粕原花青素提取效果的影響

2.3.1 提取時(shí)間對(duì)沙棘籽粕原花青素提取效果的影響 圖2顯示為不同提取時(shí)間對(duì)沙棘籽粕原花青素的提取效果的影響,由結(jié)果可以看出,提取時(shí)間在2 h時(shí),已達(dá)到最高水平,隨后時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)不會(huì)提高原花青素的含量,因此選擇2 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間對(duì)原花青素含量的影響Fig.2 Effect of extraction time on proanthocyanidin content注:字母表示原花青素含量的差異性;字母不同表示差異顯著(p<0.05)，圖3～圖5同。

2.3.2 提取pH對(duì)沙棘籽粕原花青素提取效果的影響 圖3為不同提取pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)對(duì)沙棘籽粕原花青素的提取效果的影響,隨著pH的升高,提取效果下降,這可能是由于原花青素含有較多的酚羥基,在酸性條件下更有助于保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。彭芳剛[15]在研究紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨貢r(shí),也選擇pH3.0為研究條件,其認(rèn)為酸性條件下有利于原花青素的溶出。所以本項(xiàng)目選擇pH3.0為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

圖3 提取pH對(duì)原花青素含量的影響Fig.3 Effect of extraction pH on proanthocyanidin content

2.3.3 提取溫度對(duì)沙棘籽粕原花青素提取效果的影響 本項(xiàng)目探討了不同提取溫度對(duì)原花青素提取效果的影響,隨著提取溫度的升高,分子運(yùn)動(dòng)速度加快,滲透、擴(kuò)散以及溶解的速度提高,一般活性成分的提取率也隨之增加[15]。該規(guī)律可以解釋提取溫度<30 ℃時(shí),原花青素提取含量升高的現(xiàn)象。但是,隨著溫度的升高,由于原花青素不穩(wěn)定,使提取效果下降[16],因此選擇30 ℃為后續(xù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件。

圖4 提取溫度對(duì)原花青素含量的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on proanthocyanidin content

2.3.4 液料比對(duì)沙棘籽粕原花青素提取效果的影響 圖5為不同液料比(mL/g)對(duì)原花青素提取效果的影響。圖5可知,液料比在10∶1、15∶1、20∶1、25∶1時(shí)均保持較高的DH,且水平之間無(wú)顯著性差異。所以選取液料比為10∶1,作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

圖5 液料比對(duì)原花青素含量的影響Fig.5 Effect of the ratio of liquorto material on proanthocyanidin content

2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化沙棘籽粕原花青素提取工藝條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別對(duì)溫度、液料比、時(shí)間、提取pH進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析表如表3所示。四個(gè)因素對(duì)沙棘籽粕原花青素提取效果的影響為:A>D>C>B(溫度>提取pH>時(shí)間>液料比)。最佳提取因素組合為:A3B1C1D2。因此,沙棘籽粕提取原花青素的最優(yōu)工藝為提取溶劑80%乙醇,提取溫度35 ℃、液料比8∶1、時(shí)間1.5 h、pH3.0。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析表
Table 3 Orthogonal Test Results

實(shí)驗(yàn)號(hào)A溫度(℃)B液料比(mL/g)C時(shí)間(h)D提取pH原花青素含量(mg/g)1111148.732122255.493133360.734212372.795223160.306231287.357313296.158322383.569332161.96K154.9872.5673.2157.00K273.4866.4563.4179.66K380.5670.0172.3972.36R25.586.119.8022.67

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證
Table 4 Verification Results of Orthogonal Test

實(shí)驗(yàn)條件沙棘籽粕原花青素提取實(shí)驗(yàn)液料比(mL/g)8∶1提取溫度(℃)35提取時(shí)間(h)1.5pH3.0乙醇濃度(%)80提取量(mg/g)97.31±0.48

2.5 優(yōu)化條件的結(jié)果驗(yàn)證

將以上優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),提取結(jié)果為(97.31±0.48) mg/g(表4),表明正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的工藝條件可行。

2.6 抗氧化活性研究

常用體外抗氧化測(cè)定方法可分為4類:活性氧自由基清除能力;基于氫原子轉(zhuǎn)移(HAT)的檢測(cè)方法;基于 SET 反應(yīng)機(jī)制的抗氧化實(shí)驗(yàn)方法;金屬離子螯合法[12]。基于不同的抗氧化機(jī)理以及實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件,本課題選擇了兩種實(shí)驗(yàn)機(jī)理(基于活性氧自由基清除能力和基于SET反應(yīng)機(jī)制)的自由基清除方法對(duì)所得樣品進(jìn)行測(cè)定。圖6、圖7分別為不同濃度原花青素凍干粉對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除能力的結(jié)果。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)比了兩者的抗氧化性區(qū)別,從圖6對(duì)DPPH的結(jié)果來(lái)看,沙棘籽粕原花青素凍干粉表現(xiàn)出較高的清除能力,且隨著濃度的增加,清除能力呈遞增趨勢(shì),通過(guò)計(jì)算提取物IC50為0.11 mg/mL,維生素C的IC50為0.25 mg/mL;而清除羥自由基的能力較低。馬翠蘭在藍(lán)莓葉片藍(lán)莓葉片原花青素清除自由基能力的研究中發(fā)現(xiàn),藍(lán)莓葉片原花青素不僅可以顯著清除DPPH自由基,也具有羥自由基清除能力,且以維生素C為對(duì)照,其羥自由基清除能力高于維生素C[17]。由此可見(jiàn),推測(cè)原因可能是原花青素的組成成分及結(jié)構(gòu)的差異也會(huì)造成其抗氧化性能的不同。本項(xiàng)目所得的沙棘籽粕原花青素凍干粉,具有較強(qiáng)的基于SET反應(yīng)機(jī)制的自由基清除能力。

圖6 不同濃度原花青素提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging rates of proanthocyanidin freeze-dried powder

圖7 不同濃度原花青素提取物對(duì)羥自由基的清除能力Fig.7 OH free radical scavenging rates of proanthocyanidin freeze-dried powder

2.7 沙棘籽粕原花青素對(duì)B16細(xì)胞活性的研究

本實(shí)驗(yàn)用不同濃度沙棘籽粕原花青素凍干粉處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞,處理時(shí)間分別為24、48、72 h,結(jié)果見(jiàn)圖8。三種處理?xiàng)l件下樣品刺激B16細(xì)胞的IC50結(jié)果見(jiàn)表5。由圖8所示,三種處理時(shí)間下,小鼠B16細(xì)胞活力均隨著樣品濃度的降低呈上升趨勢(shì),說(shuō)明較高濃度的沙棘籽粕原花青素對(duì)B16細(xì)胞有一定的抑制作用。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞耐受相同濃度的樣品能力下降:24 h處理時(shí)間,B16細(xì)胞活力為50%時(shí),原花青素含量為542.78 μg/mL,48 h時(shí),IC50為199.25 μg/mL,72 h下,細(xì)胞活力在50%時(shí)的IC50低至82.58 μg/mL。

圖8 不同濃度原花青素提取物對(duì)B16細(xì)胞活力的影響Fig.8 B16 Cell viability of proanthocyanidin freeze-dried powder注:A:處理細(xì)胞24 h;B:處理細(xì)胞48 h;C:處理細(xì)胞72h。

項(xiàng)目處理時(shí)間(h)IC50(μg/mL)12454278248199253728258

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以副產(chǎn)物沙棘籽粕為研究對(duì)象,優(yōu)化沙棘籽粕原花青素的提取條件,并初步分析沙棘籽粕原花青素的抗氧化功效,同時(shí)進(jìn)行了對(duì)B16細(xì)胞的抑制活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沙棘籽粕原花青素具有清除DPPH自由基的功效,清除效果優(yōu)于維生素C。72 h作用時(shí)間處理B16細(xì)胞的IC50為82.58 μg/mL(即82.58 mg/L),高于文獻(xiàn)報(bào)道蓮房原花青素對(duì)B16細(xì)胞的半數(shù)抑制率32.4 mg/L[18],說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所得沙棘籽粕原花青素粗品比蓮房原花青素對(duì)B16細(xì)胞的刺激程度較低;本實(shí)驗(yàn)沙棘籽粕原花青素24 h作用時(shí)間處理B16細(xì)胞的IC50為542.78 μg/mL,低于文獻(xiàn)報(bào)道的楊梅葉原花青素的IC50,文獻(xiàn)報(bào)道楊梅葉原花青素在50 mg/mL時(shí)得細(xì)胞活力為68.28%[19]。這又揭示了本實(shí)驗(yàn)所得沙棘籽粕原花青素比楊梅葉原花青素對(duì)B16細(xì)胞的刺激程度強(qiáng)。因此,為了更全面和透徹的分析本實(shí)驗(yàn)所得樣品的安全性和功效性,需進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

[1]Suryakumar G,Gupta A.Medicinal and therapeutic potential of Sea buckthorn(HippophaerhamnoidesL.)[J].Journal of Ethnopharmacology,2011,138:268-278.

[2]Wani T A,Wani S W,Ahmad M,et al.Bioactive profile,health benefits and safety evaluation of sea buckthorm(Hippophae rhamnoides L.):A review[J].Cogent Food and Agriculture,2016,2:1128519

[3]Wolfgang H,Peter S.Analysis of proanthocyanidins[J]. Molecular Nutrition & Food Research. 2008,52:1381-1398.

[4]Ushakova N A,Brodskii E S,Kozlova A A,et al.Anaerobic solid-phase fermentation of plant substrates by Bacillus subtilis

[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2007,45(1):61-67.

[5]Zhang H,Yang Y,Ma C,et al. Structures and antioxidant and intestinal disaccharidase inhibitory activities of A-type proanthocyanidins from peanut skin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(37):8814-8820.

[6]Serra A T,Rocha J,Sepodes B,et al. Evaluation of cardiovascular protective effect of different apple varieties-correlation of response with composition[J]. Food Chemistry,2012,135(4):2378-2386.

[7]Nishizuka T,Fujita Y,Sato Y,et al. Procyanidins are potent inhibitors of LOX-1:a new player in the French Paradox[J]. Proceedings of the Japan Academy. Series B,Physical and Biological Sciences,2011,87(3):104-108.

[8]Kim H,Cho H,Seo Y K,et al. Inhibitory Effects of Sea Buckthorn(HippophaerhamnoidesL.)Seed on UVB-induced Photoaging in Human Dermal Fibroblasts[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering,2012,17:465-474.

[9]Widen C,Coleman M D,Renvert S,et al. Protection of human erythrocytes against oxidative stress by berries[J]. Journal of Berry Research,2012,2:159-167.

[10]Manickam M,Tulsawani R. Survival Response of Hippocampal Neurons under Low Oxygen Conditions Induced by Hippophae rhamnoides is Associated with JAK/STAT Signaling[J]. Plos One,2014,9(2):e87694.

[11]孫蕓,谷文英.硫酸-香草醛法測(cè)定葡萄籽原花青素含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè).2003,29(9):43-46.

[12]張佳嬋,謝婭霏,虞旦,等.玫瑰花及花渣中黃酮類物質(zhì)的提取及其抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2014,(22):226-230.

[13]劉文穎,徐亞光,任瑋.三文魚皮膠原肽體外抗氧化活性研究[J].食品科技,2010,35(12):86-89.

[14]林菁,彭華毅.黃癸素誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2010,26(12):1630-1634.

[15]彭芳剛,李綺麗,吳衛(wèi)國(guó).響應(yīng)面法優(yōu)化紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐奶崛」に囇芯縖J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(6):1349-1354,1315.

[16]史經(jīng)略,張安寧,王傳榮.響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄籽中原花青素提取[J].食品研究與開發(fā),2011,32(10):187-192.

[17]劉靜.藍(lán)莓葉片原花青素的提取、分離及抗氧化活性研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2014.

[18]段玉清,周密,張海暉,等.蓮房原花青素對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞的抑制作用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2009,44(2):103-106.

[19]傅瑜.楊梅葉原花色素的結(jié)構(gòu)鑒定以及對(duì)黑色素生成和細(xì)胞凋亡的作用研究[D].杭州:浙江大學(xué),2015.

Technological conditions,antioxidant activities in vitro and cell viability of the proanthocyanidins extracted from seabuckthorn(Hippophae rhamnoides L.)seed residues

ZHANG Jia-chan1,2,WANG Chang-tao2,3,SUN Bao-guo2,4,*,QU You-ge3

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China; 2.Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development,School of Science of Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 3.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 4.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering of Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

The optimal conditions of proanthocyanidins extracted from seabuckthorn(HippophaerhamnoidesL.)seed residues were obtained by orthogonal test,on the basis of one factor tests. The optimal condition of ethanol extraction was ethanol concentration 80%,temperature 35 ℃,liquid to solid ratio 8∶1 mL/g,extraction time 1.5 h,pH3.0. Under this condition,proanthocyanidins was 97.31±0.48 mg/g seabuckthorn(HippophaerhamnoidesL.)seed residues. Antioxidant activities were tested,using crude extract lyophilized power. Antioxidant activities of proanthocyanidins extracted from seabuckthorn(HippophaerhamnoidesL.)seed residues were investigated with the method of scavenging hydroxyl and DPPH. IC50was calculated. Results indicated that the proanthocyanidin extracts had higher antioxidant activity than vitamin C on the scavenging ability of DPPH. The ability on scavenging hydroxyl was low. Methods MTT assay was employed to determine the cell viability of proanthocyanidin extracts in B16 cells. The IC50was 542.78,199.25 and 82.58 μg/mL when B16 cells was exposed for 24,48,and 72 h,respectively.It was suggested that the B16 cell viability followed the dose-and time-dependent manner.

proanthocyanidins extracted from sea buckthorn(HippophaerhamnoidesL.)seed residues;antioxidant activity;cell viability

2016-05-16

張佳嬋(1987-)，女，博士生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：xiaochan8787@163.com。

*通訊作者:孫寶國(guó)(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品香料與風(fēng)味化學(xué)，E-mail：sunbg@btbu.edu.cn。

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310132)；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201410019)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)23-0103-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.011