聚球藻7002藻藍(lán)蛋白的分離純化研究

李思?jí)?高風(fēng)正,曾名湧

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

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聚球藻7002藻藍(lán)蛋白的分離純化研究

李思?jí)?高風(fēng)正,曾名湧*

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

本文研究了聚球藻7002藻藍(lán)蛋白的分離純化工藝,為提高聚球藻7002藻藍(lán)蛋白的純度和提取率提供一定技術(shù)指導(dǎo)。采用組織搗碎法、超聲波法、反復(fù)凍融法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎提取藻藍(lán)蛋白,比較了不同破壁法提取藻藍(lán)蛋白的純度和總蛋白提取率,采用響應(yīng)面法確定了最佳破壁條件,通過(guò)硫酸銨鹽析、羥基磷灰石層析法提純?cè)逅{(lán)蛋白,對(duì)結(jié)果進(jìn)行SDS電泳鑒定。實(shí)驗(yàn)顯示反復(fù)凍融法破壁效果最佳,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定了最佳破壁條件為菌體濃度3.53 mg/mL、凍融次數(shù)6次、解凍溫度37 ℃、最佳鹽析濃度為硫酸銨55%,經(jīng)羥基磷灰石層析后藻藍(lán)蛋白純度可達(dá)3.79。最終本實(shí)驗(yàn)得到了分離純化聚球藻7002藻藍(lán)蛋白的最佳工藝方法。

聚球藻7002,藻藍(lán)蛋白,反復(fù)凍融,響應(yīng)面優(yōu)化,分離純化

微藻是一種光合自養(yǎng)微生物,是生產(chǎn)藥品、食品高價(jià)值生物活性物質(zhì)和生物燃料的細(xì)胞“工廠”[1]。藍(lán)細(xì)菌聚球藻在海洋浮游植物中占有優(yōu)勢(shì)組分的地位。聚球藻7002(Synechococcussp.PCC7002)是一種單細(xì)胞藍(lán)藻生物,是一類超微型(0.5～2 μm)球粒狀光合自養(yǎng)原核生物[2],是海洋微藻的重要組成部分,全球碳循環(huán)的主要參與者和初級(jí)生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者之一[3]。聚球藻 7002(Synechococcussp.PCC7002)是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞倍增時(shí)間最短的藍(lán)細(xì)菌,是發(fā)酵生產(chǎn)海洋活性物質(zhì)的理想生物反應(yīng)器。本文對(duì)聚球藻7002進(jìn)行了成分測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%以上,是獲得海洋活性蛋白質(zhì)的理想原料。

藻藍(lán)蛋白(C-Phycocyanin,C-PC)是藻類中一種重要生理活性的色素蛋白,它常見(jiàn)于藍(lán)藻中,是藻膽蛋白中的一種。藻藍(lán)蛋白在藻體中以藻膽蛋白體的形式存在,藻膽蛋白體由多種藻膽蛋白及連接蛋白或多肽組成。藻膽蛋白是強(qiáng)熒光的色素-蛋白絡(luò)合物,是藻體中重要的捕光色素蛋白。目前的研究發(fā)現(xiàn),藻藍(lán)蛋白包含一個(gè)蛋白和一個(gè)發(fā)色團(tuán),蛋白是由相對(duì)分子量分別在18 ku和20 ku的α和β亞基組成,其單體(αβ)分子共含有3個(gè)發(fā)色團(tuán),分別位于α亞基的Cys84和β亞基的Cys84,Cys155。α和β亞基通過(guò)分子間的各種相互作用力先形成單體(αβ),單體之間借助連接多肽的作用再聚合成(αβ)3和(αβ)6。藻藍(lán)蛋白的亞基主要以三聚體和六聚體形式存在,此外還有二聚體和比六聚體聚集度更高的聚集體[4]。藻藍(lán)蛋白作為天然色素蛋白在藥物和食品領(lǐng)域以及免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方面有重要應(yīng)用。大量體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其通過(guò)驅(qū)除自由基從而表現(xiàn)出抗炎活性[5-6],研究還發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗癌活性。此外,藻藍(lán)蛋白具有較高的促紅細(xì)胞生成素活性,有刺激骨髓造血的功效。

目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于藻藍(lán)蛋白的研究主要集中在螺旋藻,其分離純化方法主要有以下幾種:硫酸銨鹽析與多次柱層析結(jié)合、等電點(diǎn)沉降法、十二烷基苯磺酸鈉處理與柱層析結(jié)合分離法、氯化鉀溶菌酶聯(lián)合處理法或凍融法、分段梯度鹽析與柱層析結(jié)合分離法、雙水相萃取與離子交換層析結(jié)合分離法等[7]。關(guān)于聚球藻7002藻藍(lán)蛋白提取分離純化研究相對(duì)匱乏,本文以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)得到的聚球藻7002藻粉為原料,對(duì)藻藍(lán)蛋白進(jìn)行提取純化,尋找聚球藻7002藻藍(lán)蛋白的最優(yōu)提取工藝,以期為聚球藻7002開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

聚球藻7002干粉 聚球藻7002(Synechococcussp. PCC 7002)由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙進(jìn)東院士惠贈(zèng)。聚球藻7002培養(yǎng)于優(yōu)化后的Medium A中,并在培養(yǎng)基中添加1 g/L半乳糖,以照明日光燈做光源全光照于光生物反應(yīng)器中培養(yǎng),培養(yǎng)8 d到達(dá)對(duì)數(shù)期后收集藻粉冷凍干燥儲(chǔ)存。

硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、冰醋酸、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、羥基磷灰石 均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TGL-20B型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;Power Wave XS2型酶標(biāo)儀 Gene Company Limited;PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;JY92-2D 型超聲波細(xì)胞粉碎儀 上海安亭科學(xué)儀器廠;DK-420 型電熱水浴鍋 上海第二分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚球藻7002的培養(yǎng)及藻粉的獲取 挑取聚球藻7002接種于優(yōu)化好的 Medium A[8]液體培養(yǎng)基中,并添加1 g/L半乳糖,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH7.5,裝瓶量30%,搖速 150 r/min,溫度32 ℃,光照強(qiáng)度光強(qiáng)100 μE/(m2·s),以照明日光燈做光源全光照培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后收集并冷凍干燥以獲取優(yōu)質(zhì)藻粉。

1.2.2 聚球藻7002蛋白質(zhì)總量測(cè)定 利用凱氏定氮法測(cè)定聚球藻7002中的總蛋白含量。

1.2.3 提取液中蛋白含量測(cè)定 通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的最佳破碎方法對(duì)聚球藻7002藻粉進(jìn)行破碎,離心獲取上清液即為提取液。采用福林酚法對(duì)提取液進(jìn)行蛋白含量測(cè)定,按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,設(shè)置三組平行實(shí)驗(yàn),以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白的質(zhì)量濃度(0、25、50、100、150、200、250 μg/mL)為橫坐標(biāo),OD640值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,作為定量的依據(jù)。

1.2.4 細(xì)胞破碎方法

1.2.4.1 組織搗碎法破碎聚球藻7002 稱取一定質(zhì)量的聚球藻7002干粉,加入10 mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液使藻體溶液濃度達(dá)到2 mg/mL,在4 ℃條件下將組織搗碎機(jī)按轉(zhuǎn)10 s,停20 s,重復(fù)搗碎40次,取出藻體溶液在4 ℃下10000 r/min,離心15 min,取上清測(cè)定吸光值(A280、A620、A650)。

1.2.4.2 不同超聲功率破碎聚球藻7002 按1.2.4.1制備藻體溶液,并等體積分裝在21個(gè)相同的離心管中,用超聲波破碎儀冰浴超聲藻體溶液,將功率分別設(shè)置為50、100、200、300、400、500、600 W,工作10 s,間歇5 s,超聲時(shí)間為20 min。4 ℃下10000 r/min離心15 min,取上清測(cè)定吸光值(A280、A620、A650)。

1.2.4.3 反復(fù)凍融法破碎聚球藻7002 按1.2.4.1制備藻體溶液,攪拌均勻后在-20 ℃冰箱中冷凍90 min,30 ℃的恒溫水浴鍋中溶解,反復(fù)凍融6次。4 ℃下10000 r/min離心15 min,取上清測(cè)定吸光值(A280、A620、A650)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),分別考察不同菌體濃度、凍融次數(shù)、解凍溫度對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和總蛋白提取率的影響。

1.2.5.1 菌體濃度對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響 固定凍融次數(shù)為6次,解凍溫度30 ℃,菌體濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL的條件下提取聚球藻7002藻藍(lán)蛋白。

1.2.5.2 凍融次數(shù)對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響 固定菌體濃度為2 mg/mL,解凍溫度為30 ℃,凍融次數(shù)分別為2、3、4、5、6、7、8次的條件下提取聚球藻7002藻藍(lán)蛋白。

1.2.5.3 解凍溫度對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響 固定菌體濃度為2 mg/mL,凍融次數(shù)為6次,解凍溫度分別為10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的條件下提取聚球藻7002藻藍(lán)蛋白。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)采用Design Expert8.0軟件中的Box-behnken design(BBD)設(shè)計(jì)原理[9]設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取菌體濃度、凍融次數(shù)、解凍溫度3個(gè)因素作為實(shí)驗(yàn)因素,以藻藍(lán)蛋白純度和總蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),以期獲得最優(yōu)破碎條件[10],實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面分析因素與水平
Table 1 Factors and level of the response surface methodology

因素水平-101A菌體濃度(mg/mL)1537560B凍融次數(shù)(次)406080C解凍溫度(℃)250350450

1.2.7 硫酸銨鹽析法 實(shí)驗(yàn)證明,硫酸銨分步鹽析法可以顯著提高藻藍(lán)蛋白純度[11],在響應(yīng)面優(yōu)化后的細(xì)胞破碎條件下提取藻藍(lán)蛋白得到藍(lán)色上清液,將凍融所得藍(lán)色上清液采用10%～60%梯度飽和硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析,飽和硫酸銨溶液梯度設(shè)置如下:10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%。4 ℃過(guò)夜,4 ℃下1000 r/min離心15 min收集沉淀并用低濃度磷酸鹽緩沖溶液溶解后測(cè)吸光度(A280、A620、A650)。

1.2.8 藻藍(lán)蛋白純化及電泳鑒定

1.2.8.1 HA柱層析純化聚球藻7002藻藍(lán)蛋白 將1.2.7中的溶解液在4 ℃進(jìn)行超濾濃縮脫鹽后,采用經(jīng)10 mmol/L(pH7.0)磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡的羥基磷灰石(HA)柱進(jìn)行層析[12]。在洗脫過(guò)程中不斷增加磷酸緩沖液的離子強(qiáng)度(用10、20、50、100、200 mmol/L,pH7.0磷酸鹽緩沖液,并加0.1 mol/L NaCl洗脫),洗脫速度控制在0.7 mL/min,收集峰尖部分[13],立即進(jìn)行光譜測(cè)定,再將620 nm處有特征吸收峰的藻藍(lán)蛋白洗脫液合并,最后超濾濃縮脫鹽。

1.2.8.2 SDS-PAGE電泳 采用垂直板不連續(xù)電泳系統(tǒng),分離膠濃度為15%,濃縮膠濃度為5%。樣品在濃縮膠中電泳電壓為 80 V,進(jìn)入分離膠后電壓為120 V,剝膠后,以0.1%考馬斯亮藍(lán) R-250染色,用30%甲醇、10%乙酸的脫色液脫色。

1.2.9 藻藍(lán)蛋白分析方法及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 藻藍(lán)蛋白純度參照Herrera等[14]的方法。藻藍(lán)蛋白濃度以Soni[15]推薦的公式計(jì)算。如下所示:

式中:P為藻藍(lán)蛋白純度;[PC]為藻藍(lán)蛋白濃度;V為提取液體積(mL);k1為藻藍(lán)蛋白提取液稀釋倍數(shù);m為藻粉質(zhì)量;k2為藻粉蛋白質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以上實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定三次,利用Design-Expert 8.0和SPSS19.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.0022X+0.0741,R2=0.9978。式中Y為OD640值,X為溶液中蛋白質(zhì)含量(μg/mL)。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of the chlorella protein

2.2 組織搗碎法和凍融法的破碎效果

組織搗碎法和凍融法對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和總蛋白提取率的影響如表2所示,從表中可以看出,組織搗碎法提取的藻藍(lán)蛋白提取率和純度較低,原因是聚球藻7002藻體微小,在組織搗碎過(guò)程中藻體不能完全均勻接觸組織搗碎機(jī)導(dǎo)致藻體細(xì)胞破碎率低下,蛋白質(zhì)提取率較低。組織搗碎過(guò)程中由于機(jī)械做工產(chǎn)熱使得藻體溫度升高,當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃[16],藻藍(lán)蛋白易變性使其純度降低,凍融法可以充分接觸藻體細(xì)胞且蛋白質(zhì)不易變性,綜上所述凍融法破碎藻體效果好于組織搗碎法。

表2 組織搗碎法和凍融法對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和總蛋白提取率的影響
Table 2 The effect of Tissue-trituration method and thawing method to the purity and production of C-PC

方法C-PC純度蛋白提取率(%)組織搗碎法031±0051123±023凍融法042±0022445±012

2.3 超聲波破碎法效果

采用超聲波法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎時(shí),不同超聲功率對(duì)破碎效果的影響如圖2所示。

圖2 超聲破碎法對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白的純度和蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic method on the purity and production of C-PC注:不同小寫(xiě)字母代表差異性顯著(p<0.05)。

由圖2可以看出隨著超聲波功率的增加,蛋白的溶出率增加,功率為400 W時(shí),繼續(xù)提高超聲功率對(duì)破碎細(xì)胞的作用不大,蛋白質(zhì)提取增幅顯著下降(p<0.05);另一方面,隨著超聲波功率增加,破碎細(xì)胞液溫度也在增加,容易引起蛋白變性,造成藻藍(lán)蛋白純度下降。當(dāng)功率達(dá)到400 W時(shí),藻藍(lán)蛋白純度明顯下降(p<0.05)。

綜合表2和圖2可知,對(duì)于超聲功率而言,對(duì)細(xì)胞破碎具有一定的影響。超聲功率越大,它所產(chǎn)生的超聲波越強(qiáng),對(duì)細(xì)胞的破壞性也越大。從結(jié)果看,也符合這一規(guī)律。隨著超聲功率的加強(qiáng),提取液中藻藍(lán)蛋白的含量也有增加的趨勢(shì);但超聲波的熱效應(yīng)亦在不斷增強(qiáng),可能會(huì)造成局部蛋白的變性[17]。凍融法既可以得到純度較高的藻藍(lán)蛋白,蛋白提取率也顯著高于組織搗碎法,比較而言凍融法細(xì)胞破碎和藻藍(lán)蛋白提取的綜合效果最好。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 菌體濃度對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響 凍融法破碎細(xì)胞的原理是藻體在凍結(jié)過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)外的液態(tài)水形成冰晶體,造成體積膨大,對(duì)藻體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用,使其通透性加大,內(nèi)容物流出。因此加水量對(duì)細(xì)胞壁膜有影響。菌體濃度對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響如圖3所示,可以看出菌體濃度對(duì)蛋白提取率有較大影響,對(duì)藻藍(lán)蛋白純度影響較小(p>0.05)。在菌體濃度較低時(shí),蛋白提取率隨著菌體濃度增大而顯著提高(p<0.05),在菌體濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí),蛋白提取率達(dá)到最高,繼續(xù)增加菌體濃度,蛋白提取率反而顯著下降(p<0.05)。這是因?yàn)榫w濃度較小時(shí),溶液的黏度較大,分子擴(kuò)散速度低,提取率小,隨著菌體濃度提高,溶液中蛋白濃度降低,使更多的蛋白質(zhì)從藻體中釋放出來(lái),提取率升高。當(dāng)菌體濃度達(dá)到一定值后,蛋白質(zhì)提取率變化幅度很小,是因?yàn)榇藭r(shí)溶液中蛋白質(zhì)濃度與藻體中蛋白質(zhì)濃度相當(dāng),使得藻體內(nèi)外蛋白質(zhì)的濃度差消失,蛋白質(zhì)的溶出趨于平衡[18],因此,提取率幾乎不再變化。隨著菌體濃度增大,聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度從0.42下降到0.36,這是因?yàn)榫w濃度的增大導(dǎo)致所需實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間加長(zhǎng)容易引起蛋白質(zhì)可逆或不可逆變性,但蛋白純度變化不明顯(p>0.05),綜合考慮,菌體濃度以2.5 mg/mL為宜。

圖3 菌體濃度對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響Fig.3 The effect of concentration of bacteria on the purity and protein production of C-PC in Synechococcus sp.PCC 7002

2.4.2 凍融次數(shù)對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響 每次凍融易生成細(xì)小冰晶體的地方不一樣,即在細(xì)胞內(nèi)外形成冰晶的部位是不同的,這會(huì)對(duì)細(xì)胞不同部位的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞,因而多次凍融能使破碎效果提高。由圖4可知,增加凍融次數(shù)有助于藻藍(lán)蛋白的溶出,蛋白提取率隨著凍融次數(shù)的增加而增大,同時(shí)藻藍(lán)蛋白的純度也隨之提高。凍融4次后,蛋白提取率增加趨于平緩,增加幅度不顯著(p>0.05),凍融6次后,藻藍(lán)蛋白純度顯著下降(p<0.05),這是由于凍融反復(fù)時(shí)間長(zhǎng)了,胞內(nèi)的蛋白酶分解了部分蛋白。綜合破碎效果和破碎時(shí)間及凍融成本,凍融循環(huán)次數(shù)以6次為宜。

圖4 凍融次數(shù)對(duì)聚對(duì)球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響Fig.4 The effect of cycles of freezing and thawing on the purity and protein production of C-PC in Synechococcus sp.PCC 7002

2.4.3 解凍溫度對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響 由圖5可知,隨著融化溫度的增加,藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率都在顯著升高(p<0.05),當(dāng)溫度超過(guò)一定范圍后,藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率出現(xiàn)明顯下降。分析其原因,反復(fù)凍融破壞了細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu),增加了細(xì)胞膜的通透性,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的水反復(fù)結(jié)冰、融化,形成的冰晶越來(lái)越大,加劇了冰晶對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用[19]。一定范圍內(nèi)的溫度升高能夠加速冰晶的溶脹速度,提高藻體細(xì)胞的破碎效果,但當(dāng)溫度超過(guò)35 ℃時(shí),藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率出現(xiàn)明顯下降(p<0.05)。因此,解凍溫度為35 ℃為宜。

圖5 解凍溫度對(duì)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的影響Fig.5 The effect of thawing temperature on the purity and protein production of C-PC in Synechococcus sp.PCC 7002

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,對(duì)菌體濃度(A)、凍融次數(shù)(B)、解凍溫度(C)三個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),按照表1因素的水平編碼,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果
Table 3 Box-Behnken central composite design matrix and corresponding experimental results

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABC藻藍(lán)蛋白純度蛋白提取率(%)110-10.37±0.01116.81±0.622-1010.31±0.02321.43±0.213-1100.42±0.01520.52±0.3240000.45±0.03123.33±0.3550110.29±0.02818.73±0.466-1010.37±0.00622.57±0.24701-10.35±0.01219.46±0.3981-100.34±0.02819.79±0.6390000.43±0.02624.11±0.52100000.40±0.00523.56±0.19110-1-10.29±0.01819.32±0.22120-110.24±0.01418.27±0.43130000.45±0.00724.16±0.51141010.35±0.00322.37±0.16150000.42±0.05124.18±0.4216-1-100.37±0.02718.71±0.56171100.39±0.01920.75±0.33

2.5.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design Expert8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合,得到的回歸方程模型為:藻藍(lán)蛋白純度=0.44+0.054A+0.025B-13.88C-0.22AB+0.032AC-3.79BC+0.046A2-0.054B2-0.084C2;蛋白提取率(%)=18.95-13.34A+0.17B+4.30C-0.35AB+5.49AC+0.08BC-9.02A2-2.89B2-2.03C2。藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的回歸方程及偏回歸系數(shù)方差分析結(jié)果分別見(jiàn)表4和表5。

由表4、表5可以看出,兩個(gè)方程的p值<0.01,失擬項(xiàng)均大于0.05,說(shuō)明這兩個(gè)模型的回歸方程顯著,失擬項(xiàng)不顯著,方程模型可用。R2分別為0.9462、0.9108,說(shuō)明方程的線性關(guān)系良好,能較好地反映各因素與響應(yīng)值變化的關(guān)系,可用于聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率的理論預(yù)測(cè)。藻藍(lán)蛋白純度回歸方程中B、C、B2、C2對(duì)藻藍(lán)蛋白純度影響顯著。

蛋白提取率回歸方程中C、AC、B2、C2對(duì)蛋白提取率影響顯著。通過(guò)響應(yīng)面的數(shù)字最優(yōu)組合分析得到細(xì)胞破碎的最佳條件為:菌體濃度3.53 mg/mL,凍融次數(shù)6次,解凍溫度37 ℃。預(yù)測(cè)值分別為:藻藍(lán)蛋白純度0.44,蛋白提取率為24.62%。

表4 藻藍(lán)蛋白純度回歸方程的方差分析
Table 4 Analysis of variance in regression of the purity of C-PC

2.5.3 響應(yīng)面分析及驗(yàn)證 兩因素之間的交互作用見(jiàn)圖6、圖7。響應(yīng)面等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著[20-21]。由圖6可知,菌體濃度和解凍溫度的交互作用對(duì)蛋白純度有一定影響。由圖7可知,菌體濃度和解凍溫度的交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白得率提取率有著顯著影響,固定菌體濃度時(shí),隨著解凍溫度的升高,藻藍(lán)蛋白的得率先升高后降低,固定解凍溫度時(shí),隨著菌體濃度的升高,藻藍(lán)蛋白得率先升高后降低。

圖6 菌體濃度和解凍溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度的交互作用Fig.6 The interactive effects of the concentration of bacteria and the thawing temperature on the purity of C-PC

圖7 菌體濃度和解凍溫度對(duì)蛋白提取率的交互作用Fig.7 The interactive effects of the concentration of bacteria and the thawing temperature on the protein production

表5 蛋白提取率回歸方程的方差分析
Table 5 Analysis of variance in regression of the production of protein

項(xiàng)目自由度平方和均方F值p顯著性回歸模型98233915103600028??A115415417402281B111511513002914C162266275000290?AB17168E-0067168E-0068119E-00609978AC115931593180500038??BC100260026002908696A2115415417502275B2135093509397400004??C2117421742197400030??殘差7618088失擬項(xiàng)3556185119601182純誤差4062015總和168851

注:**極顯著(p<0.01),* 表示顯著(p<0.05)。

按最優(yōu)組合方案中的提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,測(cè)得藻藍(lán)蛋白純度0.47,蛋白提取率為25.17%,相對(duì)誤差分別為0.03%和0.55%。進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)學(xué)回歸模型的準(zhǔn)確性。

2.6 硫酸銨鹽析法

鹽析現(xiàn)象的發(fā)生是由于高濃度的鹽結(jié)合了大量的水,降低了水的活度,并且脫去蛋白質(zhì)分子表面的水化層,加強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子間的直接作用。鹽析法是常用的沉淀蛋白質(zhì)的方法,其具有不易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的優(yōu)勢(shì)[22]。如圖8所示,藻藍(lán)蛋白純度和得率隨著硫酸銨飽和度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在飽和度為45%以下時(shí),總蛋白鹽析隨鹽飽和濃度增加的效果明顯。飽和度45%～55%時(shí),蛋白析出效果穩(wěn)定。而當(dāng)飽和度超過(guò)55%時(shí),蛋白得率以及純度略有下降,原因是在較高的鹽濃度下,蛋白質(zhì)分子表面的水化層被硫酸銨脫去,加強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子之間的直接作用,引起了部分變性。在硫酸銨飽和度為55%時(shí)純度顯著提高至0.79(p<0.05),藻藍(lán)蛋白得率顯著提高到0.62%(p<0.05)。由圖可知,藻藍(lán)蛋白提取液經(jīng)過(guò)一步鹽析后純度提高了一倍。因此,硫酸銨鹽析時(shí)以55%的飽和度為宜。

圖8 硫酸銨飽和度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和得率的影響Fig.8 The effect of ammonium sulfate saturation to the purity and production of C-PC

2.7 藻藍(lán)蛋白純化及電泳鑒定

2.7.1 HA柱層析純化聚球藻7002藻藍(lán)蛋白 如圖9所示,一定濃度的藻藍(lán)蛋白經(jīng)過(guò)羥基磷灰石層析柱后,出現(xiàn)5個(gè)峰。峰1為穿過(guò)組分,為粗藻藍(lán)蛋白提取液中的雜質(zhì)蛋白、核酸等雜質(zhì),目標(biāo)蛋白組分主要集中在峰2、峰3,因?yàn)榻?jīng)過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)在620 nm有最大吸收峰且其純度為A620/A280=3.79,峰4和峰5的洗脫組分經(jīng)過(guò)收集后檢測(cè)其A620/A280=2.18。所以目標(biāo)蛋白主要集中在峰2和峰3。將提取得到的藻膽蛋白經(jīng)過(guò)收HA柱層析后,得到了藥品純級(jí)別的藻藍(lán)蛋白[23]。羥基磷灰石(HAP)是一種磷酸鈣晶體,具有好的生物相容性[24]。羥基磷灰石吸附技術(shù)對(duì)于蛋白質(zhì),酶,核酸等生物大分子的分離和純化具有良好的選擇性。使用該技術(shù)往往能呈現(xiàn)良好的分離性能。而且它價(jià)格低廉,用它作為色譜填充料,可作為制備色譜,具有易于放大的優(yōu)勢(shì)。

圖9 藻藍(lán)蛋白經(jīng)HA柱的層析峰圖Fig.9 HA elution profile of C-PC

2.7.2 SDS-PAGE電泳 如圖10所示,SDS-PAGE蛋白電泳顯示兩條帶,在11 ku和22 ku間,是藻藍(lán)蛋白的α、β亞基,與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的α亞基的分子量13～20 ku,β亞基的分子量14～24 ku相一致[25],且與藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品條帶接近,這證明了純化后的蛋白質(zhì)是藻藍(lán)蛋白。由電泳圖也可清晰看到,純化后的藻藍(lán)蛋白有兩個(gè)明顯的條帶,而電泳級(jí)別的藻藍(lán)蛋白一般只有一個(gè)條帶,所以本次純化的藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到藥品級(jí)但尚未達(dá)到電泳純級(jí)別[27]。

圖10 聚球藻7002藻藍(lán)蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.10 SDS-PAGE of the purified phycocyanin from Synechococcus sp.PCC 7002注:1為純化后的聚球藻7002藻藍(lán)蛋白;2為藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品;3為marker。

3 結(jié)論

聚球藻在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種活性物質(zhì)[26],藻藍(lán)蛋白是其中重要的活性物質(zhì),藻藍(lán)蛋白的提取方法很多,本文討論了組織搗碎法、反復(fù)凍融法、超聲波破碎法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,超聲波破碎法雖然可以顯著提高藻藍(lán)蛋白的提取率,但超聲中產(chǎn)生的高溫易使藻藍(lán)蛋白變性從而降低藻藍(lán)蛋白純度。組織搗碎法雖然操作簡(jiǎn)便但其破碎聚球藻7002效果差,藻藍(lán)蛋白提取率較低。反復(fù)凍融法通過(guò)細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和剩余細(xì)胞液鹽濃度的增高引起溶脹,使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破碎,藻膽體內(nèi)的藻藍(lán)蛋白溶出,不僅保證了藻藍(lán)蛋白在低溫下有較好的穩(wěn)定性,使其純度達(dá)到了0.42,提取率達(dá)到了24.45%,且其操作簡(jiǎn)便,生產(chǎn)成本較低,可以規(guī)?；糯笊a(chǎn)。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了反復(fù)凍融法的最佳破壁條件。聚球藻7002反復(fù)凍融的最佳破壁條件為:菌體濃度3.53 mg/mL、凍融次數(shù)6次、解凍溫度37 ℃,在此條件下提取聚球藻7002藻藍(lán)蛋白可使藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到0.47,提取率達(dá)到25.17%,相對(duì)誤差分別為0.03%和0.55%。建立了兩個(gè)分別以聚球藻7002藻藍(lán)蛋白純度和蛋白提取率為目標(biāo)值,以菌體濃度、凍融次數(shù)、溶解溫度為因子的數(shù)學(xué)模型,在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)聚球藻7002藻藍(lán)蛋白的純度和蛋白提取率。

本文通過(guò)硫酸銨一步鹽析法確定了最佳硫酸銨飽和度為55%,通過(guò)硫酸銨鹽析后藻藍(lán)蛋白純度提高了1倍,將藻藍(lán)蛋白粗提液經(jīng)過(guò)羥基磷灰石柱層析后得到了純度為3.79的藥品級(jí)(食品級(jí)>0.7,藥品級(jí)>3.0和試劑級(jí)>4.0)[25]藻藍(lán)蛋白。樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳顯示的兩個(gè)清晰條帶進(jìn)一步驗(yàn)證了其為藻藍(lán)蛋白。硫酸銨一步鹽析法結(jié)合羥基磷灰石層析法簡(jiǎn)化了藻藍(lán)蛋白繁雜的純化步驟。其成本低、耗能低、操作較簡(jiǎn)便,具有可以規(guī)模放大化的優(yōu)勢(shì)。

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Study on extraction and purification of C-phycocyanin inSynechococcussp.PCC 7002

LI Si-meng,GAO Feng-zheng,ZENG Ming-yong*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to improve the purity and production of C-phycocyanin(C-PC)inSynechococcussp.PCC 7002,extraction and purification of C-phycocyanin inSynechococcussp.PCC 7002 was investigated. Tissue-trituration method,cycle of freezing and thawing method and ultrasonic method were applied and compared to the effection on the purity and production of C-phycocyanin. Response surface methodology(RSM)was used to optimize the best cell-disruption conditions. Futher purification was performed by means of ammonium sulphate precipitation and hydroxyapatite(HA)chromatography. The purified protein was examined through SDS-PAGE. The results showed that cycle of freezing and thawing method was the optimal cell-disruption method by the RSM experiment,the best cell-disruption conditions were that the concentration of bacteria was 3.53 mg/mL,the cycles of freezing and thawing was 6 times,the thawing temperature was 37 ℃,the best concentration of salting out was 55% ammonium sulfate,the purity of C-phycocyanin reached 3.79 through hydroxyapatite chromatography. The optimal method of extraction and purification of phycocyanin fromSynechococcussp.PCC 7002 was achieved.

Synechococcussp.PCC 7002;phycocyanin;cycle of freezing and thawing;response surface methodology;extraction and purification

2016-05-30

李思?jí)?1991-)，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品高值化利用，E-mail：478367302@qq.com。

*通訊作者:曾名湧(1965-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品高值化利用，E-mail：mingyz@ouc.edu.cn。

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20120132110022)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013GGE29003)。

TS254

A

1002-0306(2016)23-0096-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.010