常壓室溫等離子體技術(shù)誘變選育鲅魚(yú)抗氧化肽發(fā)酵菌株

艾冰花, 艾麗花, 李秉鈞, 馮俊榮, 韓龔文, 于本淑

(1. 煙臺(tái)大學(xué) 海洋學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005; 2. 煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005; 3. 龍口市水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 山東 龍口 265700; 4. 山東省水生生物資源養(yǎng)護(hù)管理中心, 山東 煙臺(tái) 264003)

常壓室溫等離子體技術(shù)誘變選育鲅魚(yú)抗氧化肽發(fā)酵菌株

艾冰花1, 艾麗花2, 李秉鈞1, 馮俊榮1, 韓龔文3, 于本淑4

(1. 煙臺(tái)大學(xué) 海洋學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005; 2. 煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005; 3. 龍口市水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 山東 龍口 265700; 4. 山東省水生生物資源養(yǎng)護(hù)管理中心, 山東 煙臺(tái) 264003)

鲅魚(yú)(Spanish mackerel)加工后的廢棄物富含蛋白質(zhì), 為了提高蛋白質(zhì)的利用率并減少環(huán)境污染,可以采用微生物發(fā)酵的方法酶解這部分蛋白質(zhì)制取抗氧化活性肽。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)篩選出一株芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Hy-2, 以其發(fā)酵水產(chǎn)加工廢棄物得到了具有較高抗氧化性的產(chǎn)物。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)物的抗氧化性, 作者以該株產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌Hy-2為出發(fā)菌, 采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變的方法篩選出1株突變菌Hy-23, 以鲅魚(yú)加工后的廢棄物為原料, 接種該突變菌株進(jìn)行發(fā)酵, 得到了具有一定抗氧化活性的發(fā)酵產(chǎn)物, 酶解物總抗氧化活性提高了12.4%。經(jīng)遺傳穩(wěn)定性測(cè)定, 該芽孢桿菌突變株在傳代8次之后其遺傳穩(wěn)定性仍然良好。

常壓室溫等離子體; 蛋白酶; 抗氧化活性; 遺傳穩(wěn)定性

天然抗氧化劑抗氧化效率高、對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用, 已成為研究的熱點(diǎn)[1]。由于海洋生物源蛋白的種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陸地生物源蛋白, 其蘊(yùn)藏的活性肽片段也多種多樣[2]。因此, 使用海洋水產(chǎn)動(dòng)物加工廢棄物制備抗氧化肽可以提高蛋白質(zhì)的利用率, 也增加了原料的產(chǎn)值。常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma, ARTP)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種等離子體源, 其主要成分是活性離子,與生物大分子和細(xì)胞作用效果明顯, ARTP誘變技術(shù)操作方便, 產(chǎn)生突變的多樣性大, 對(duì)處理材料損傷較輕, 安全性高, 已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了30種以上微生物的突變, 成為高效的微生物基因組突變新方法[3-7]。作者采用ARTP誘變的方法篩選出了一株能有效降解鲅魚(yú)(Spanish mackerel)蛋白, 且酶解物具有一定抗氧化活性的菌株Hy-23, 接種該菌的發(fā)酵產(chǎn)物總抗氧化活性提高了12.4%。研究結(jié)果為以后發(fā)酵制取抗氧化肽提供了一定微生物學(xué)基礎(chǔ)[8]。

1 材料與方法

1.1 原料與供試菌株

鲅魚(yú)粉: 鲅魚(yú)加工后的邊角料, 不包含頭, 鰭和內(nèi)臟, 經(jīng)絞碎, 干燥, 有機(jī)溶劑脫脂后烘干并過(guò)80目篩網(wǎng), 蛋白質(zhì)含量75.07%, 脂肪含量15.90%。

蛋白酶產(chǎn)生菌Hy-2。該菌在室溫下于鲅魚(yú)加工廢棄物中篩選, 具有一定水解鲅魚(yú)蛋白的蛋白酶活力。

1.2 主要儀器與設(shè)備

常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)(ARTP), ARTP-IIS型(北京思清源生物科技有限公司); 臺(tái)式高速離心機(jī), H1650-W型(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);數(shù)顯光照振蕩培養(yǎng)箱, 250HG型(金壇市精達(dá)儀器制造廠)?？梢?jiàn)分光光度計(jì), V-1100D型(上海美譜達(dá)儀器有限公司); 立式壓力蒸汽滅菌器, LDZM-40KCS型(上海申安醫(yī)療器械廠)等。

1.3 培養(yǎng)基與試劑

參考艾冰花等[9]的配方稍作修改。

酪素固體培養(yǎng)基: 蛋白胨1.0%、葡萄糖0.1%、氯化鈉0.5%、氯化鈣0.01 %、L-酪氨酸0.01%、瓊脂2.2%、干酪素0.5%, pH 6.6。

試劑: 牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2CO3、三氯乙酸、干酪素、L-酪氨酸、福林酚等; 總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株Hy-2生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

參考艾冰花等[9]的試驗(yàn)方法和結(jié)果。

1.4.2 ARTP誘變育種步驟

使用無(wú)菌生理鹽水制備的菌懸液作為ARTP系統(tǒng)的處理對(duì)象。優(yōu)先采用對(duì)數(shù)期細(xì)胞, 為保證處理的均一性, 菌濃度不宜太高, 一般為106～108個(gè)/mL。本實(shí)驗(yàn)中菌懸液濃度為1.25×107個(gè)/mL。

參考范新蕾等[10]的參數(shù)設(shè)置, 在超凈臺(tái)內(nèi), 將載玻片置于酒精燈外焰灼燒30 s, 待冷卻后放到已滅菌的培養(yǎng)皿中, 取10 μL菌液均勻涂布在載片表面。將裝有樣品載片的培養(yǎng)皿移至ARTP誘變育種儀操作室, 用無(wú)菌鑷子將載片放到對(duì)應(yīng)凹槽。調(diào)節(jié)手動(dòng)旋轉(zhuǎn)樣品載臺(tái)旋鈕, 使載片與等離子體發(fā)生器射流出口間距約為2 mm; 設(shè)定功率為120 W、氣量為10 L/min,處理時(shí)間設(shè)定完畢后開(kāi)始處理樣品。全部樣品處理完畢, 用無(wú)菌鑷子將載片分別放至裝有1mL無(wú)菌溶液的EP管中。將EP管置于振蕩器上振蕩1 min, 把附著在載片上的微生物洗脫到無(wú)菌溶液中, 形成新的菌懸液。最后, 對(duì)處理過(guò)的菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋, 取100 μL稀釋液涂布培養(yǎng)皿, 培養(yǎng)計(jì)數(shù)。計(jì)算致死率。

1.4.3 蛋白酶活力初選

按照最佳照射時(shí)間處理菌懸液后, 將菌懸液涂布到酪素固體培養(yǎng)基上, 28℃生長(zhǎng)24 h后, 挑選菌落較大的或者透明水解圈直徑與菌落直徑比值(HE值)大的菌落, 作為總抗氧化性復(fù)篩的菌株。

1.4.4 抗氧化活性復(fù)篩

將蛋白酶活力初選得到的菌以2%的接種量接種于總抗氧化活性復(fù)篩培養(yǎng)基中, 28℃搖瓶發(fā)酵, 根據(jù)經(jīng)驗(yàn), 取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液, 沸水浴滅酶10 min后, 10 000 r/min, 離心10 min, 取上清液測(cè)定發(fā)酵液總抗氧化活性。

總抗氧化活性的測(cè)定使用總抗氧化能力測(cè)定試劑盒。機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì), 能使Fe3+還原成Fe2+, 后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)和物, 通過(guò)比色可測(cè)出其抗氧化能力的高低。按照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行加樣, 取樣量為0.2 mL。計(jì)算公式為

式中, MT-AOC為總抗氧化能力(U); A為測(cè)定OD值; A0為對(duì)照OD值; V1為反應(yīng)液總量(mL); V2為取樣量(mL); N為樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù); V3為發(fā)酵液體積(mL)。

1.4.5 遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將正突變株接種于蛋白酶初選培養(yǎng)基上, 連續(xù)傳代8次[11], 用每一次傳代的菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn), 均測(cè)定酶解物總抗氧化活性。

根據(jù)遺傳穩(wěn)定性測(cè)定的結(jié)果, 確定遺傳穩(wěn)定性較好的突變株, 使用該突變株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn), 使用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)發(fā)酵液總抗氧化活性進(jìn)行單因素方差分析, 進(jìn)一步驗(yàn)證數(shù)據(jù)的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Hy-7生長(zhǎng)曲線

如圖1所示, 菌株Hy-2的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為12 h～20 h,因此選擇生長(zhǎng)14 h的菌即對(duì)數(shù)中前期的細(xì)胞做ARTP誘變[12]。

圖1 菌株Hy-2生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of bacteria Hy-2

2.2 ARTP誘變時(shí)間的選擇

由圖2可以看出, 隨著照射時(shí)間的增加, ARTP誘變的致死率增加。根據(jù)現(xiàn)代育種理論, 致死率達(dá)到90%～95%范圍時(shí), 產(chǎn)生正突變的幾率較高[13]。因此選擇ARTP誘變的時(shí)間為120 s, 此時(shí)的致死率為91%。稀釋倍為105時(shí), 菌落數(shù)大小合適, 菌落水解圈清晰可見(jiàn), 因此ARTP誘變的條件為等離子體照射120s, 稀釋倍數(shù)為105。

圖2 菌株Hy-2在不同時(shí)間ARTP照射下的致死率Fig. 2 Lethal rate of bacteria Hy-2 at different times under ARTP

2.3 蛋白酶活力初選

根據(jù)菌落大小以及HE值篩選出9個(gè)突變株, 其HE值如表1所示。其中菌株Hy-22, Hy-25, Hy-26, Hy-27, Hy-29的HE值較出發(fā)菌Hy-2大, 菌株Hy-21, Hy-23, Hy-24, Hy-28的HE值雖然較出發(fā)菌小, 但其菌落直徑明顯比較大[14]。由于這9株突變菌雖具有一定的產(chǎn)酶能力, 但在以鲅魚(yú)加工廢棄物蛋白為底物時(shí), 它們分解出來(lái)的肽的抗氧化性各不相同, 要選擇能夠水解鲅魚(yú)蛋白, 且水解物具有較高抗氧化活性的菌株則需要進(jìn)一步做水解物總抗氧化活性復(fù)篩。因此選擇這9株突變菌株接種于菌種傳代保藏培養(yǎng)基中做下一步篩選。

表1 9個(gè)突變株蛋白酶活力初選結(jié)果Tab.1 HE of nine mutants in the preliminary selection

2.4 總抗氧化活性復(fù)篩

分別接種9株蛋白酶活力初選得到的菌株于種子液培養(yǎng)基中, 30℃搖瓶培養(yǎng)26 h作為復(fù)篩的種子液, 以2%的接種量將9個(gè)突變株種子液接種于總抗氧化活性復(fù)篩培養(yǎng)基中。搖瓶發(fā)酵48 h后, 取各自的發(fā)酵液離心(10 000 r/min, 10 min)澄清后測(cè)定總抗氧化活性。結(jié)果如表2所示, 只有7個(gè)突變株的總抗氧化活性比出發(fā)菌高, 選擇總抗氧化性增加率大于10%的菌株可以確定為正突變, 分別為Hy-1, Hy-2, Hy-3號(hào)菌株。

下一步需要對(duì)這3株突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測(cè)定, 以確保其在傳代的過(guò)程中其產(chǎn)酶是穩(wěn)定的。

表2 9個(gè)突變株總抗氧化活性復(fù)篩結(jié)果Tab. 2 Total antioxidant activity of nine mutants in the second screening

2.5 遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

3株突變株的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖3所示:在連續(xù)傳代8次中, 菌株Hy-21發(fā)酵的水解物總抗氧化性增加率始終不高, 與篩選時(shí)的增加率10.4%相差較大, 且在第七次傳代中出現(xiàn)了負(fù)值。菌株Hy-22發(fā)酵的水解物總抗氧化性增加率在八次傳代中與復(fù)篩時(shí)的增加率相比, 數(shù)值的波動(dòng)較大。菌株Hy-23發(fā)酵的水解物總抗氧化性增加率在八次傳代中與復(fù)篩時(shí)的增加率相比數(shù)值差別不大, 且數(shù)值的穩(wěn)定性較好, 增加率為11.6%～13.6%(排除了異常值8.7%), 增加率波動(dòng)在6.4%～9.6%, 波動(dòng)不超過(guò)10%。

突變株Hy-23的單因素方差分析結(jié)果如表3所示: P=0.095(＞0.05), 說(shuō)明8次傳代過(guò)程中, 發(fā)酵液的總抗氧化活性變化不顯著。說(shuō)明Hy-23號(hào)突變菌的遺傳穩(wěn)定性較好, 可以作為最終的ARTP誘變育種的突變株。

圖3 3個(gè)突變株遺傳穩(wěn)定性結(jié)果Fig. 3 Genetic stability results for three mutant strains

對(duì)比艾冰花等[9]的結(jié)果, 正突變菌往往是菌落直徑較出發(fā)菌大的, 相比HE值對(duì)正突變的貢獻(xiàn)率,菌落直徑可能起到更大的作用。說(shuō)明經(jīng)過(guò)突變后, 正突變菌生長(zhǎng)可能更為迅速, 產(chǎn)酶更加活躍, 這一點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

表3 突變株Hy-23單因素方差分析結(jié)果Tab. 3 Results of the single-effect analysis of variance of mutant Hy-23

3 討論

雖然ARTP誘變技術(shù)是一種新型的誘變技術(shù),然而利用該技術(shù)已經(jīng)取得了不少成果。柏中中等[15]利用ARTP誘變技術(shù)篩選獲得了一株D-乳酸高發(fā)酵菌株, 其D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)率比出發(fā)菌提高了36.3%。通過(guò)ARTP技術(shù)對(duì)拜氏梭菌(Clostriadium beijerinckii)進(jìn)行誘變, 其誘變株丁醇產(chǎn)量提高10%, 丙酮/丁醇/乙醇產(chǎn)量提高24%以上[16]。薛剛等[17]利用ARTP誘變技術(shù)選育出一株高產(chǎn)蛋白酶菌株, 蛋白酶活力是出發(fā)菌的1.56倍。

與艾冰花等[9]利用紫外誘變選育抗氧化肽發(fā)酵菌株的結(jié)果相對(duì)比, 前者利用兩次紫外誘變得到發(fā)酵產(chǎn)物總抗氧化活性提高了10.2%, 后者只利用一次ARTP誘變即獲得總抗氧化性提高12.4%的發(fā)酵產(chǎn)物。由此可以推測(cè), ARTP誘變技術(shù)作為一種新型的誘變技術(shù)可以在一定程度上克服長(zhǎng)期使用紫外誘變產(chǎn)生的抗性缺陷。沈小靜等[4]利用常壓室溫等離子體射流誘變(ARTP)和紫外照射對(duì)紅霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行復(fù)合誘變, 得到4株產(chǎn)量明顯提高的突變菌株, 4株菌的平均發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌株提高25.2%。由此可以推測(cè), 本研究今后可以采用紫外誘變結(jié)合ARTP誘變選育抗氧化活性肽的發(fā)酵菌株, 可期待獲得性能更優(yōu)良的菌株。

本研究前期探索了發(fā)酵產(chǎn)物的不同多肽濃度對(duì)DPPH自由基的清除率, 對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制率以及對(duì)亞油酸自氧化的抑制率, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)多肽濃度與三者之間均存在較好的線性關(guān)系, 因此可以說(shuō)明發(fā)酵產(chǎn)物為抗氧化活性肽。

4 結(jié)論

通過(guò)等離子體誘變, 得到了可以水解鲅魚(yú)加工廢棄蛋白的芽孢桿菌突變株, 利用該突變菌發(fā)酵得到的發(fā)酵液總抗氧化活性提高了12.4%, 具有較高的工業(yè)化應(yīng)用潛力, 對(duì)鲅魚(yú)加工廢棄蛋白資源的充分利用和天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)也具有一定的意義。由于傳統(tǒng)誘變的方法的反復(fù)使用, 使得其作用于微生物時(shí)具備了一定的抗性。等離子體誘變技術(shù)作為一種新興有效的誘變方法可以在一定程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的缺陷。研究結(jié)果也表明利用ARTP誘變技術(shù)能夠取得較滿意的結(jié)果。本研究后續(xù)還需要對(duì)突變株Hy-23進(jìn)行分子水平的研究, 分析其發(fā)酵性能提高的內(nèi)在原因。

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Received: Nov. 9, 2015

A mutant strain of Spanish mackerel antioxidant peptide fermentation obtained by atmospheric and room temperature plasma

AI Bing-hua1, AI Li-hua2, LI Bing-jun1, FENG Jun-rong1, HAN Gong-wen3, YU Ben-shu4
(1. School of Ocean, Yantai University, Yantai 264005, China; 2. School of Life Science, Yantai University, Yantai 264005, China; 3. Longkou Aquaculture Technology Extending Stations, Longkou 265700, China; 4. Shandong Hydrobios Resources Conservation and Management Center, Yantai 264003, China)

Atmospheric and room temperature plasmas(ARTP); protease; antioxidant activity; hereditary stability

The processed waste of Spanish mackerel is rich in proteins. Antioxidant active peptide preparation via microorganism fermentation can efficiently utilize these proteins and reduce the environmental pollution caused by S. mackerel processed waste. One strain of Bacillus Hy-2 was obtained using the processed waste of aquatic products as the substrate; this resulted in the production of protein hydrolysates with high antioxidant activity. The antioxidant activity of protein hydrolysates was further improved via mutation of the original strain of protease producing Bacillus Hy-2 using atmospheric and room temperature plasmas. A strain of Bacillus Hy-23 with a strong hereditary stability was screened from these mutants; this strain continued to allow a stable enzyme production even after eight generations. Using waste proteins obtained from S. mackerel production as the substrate and an inoculating mutant strain Hy-23, the fermentation process allowed the production of protein hydrolysates with a 12.4% increase in antioxidant activity.

Q933

A

1000-3096(2016)11-0028-06

10.11759//hykx 20151109002

(本文編輯: 譚雪靜)

2015-11-09;

2016-02-26

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012GHY11515)

[Foundation: Science and Technology Development Projects of Shandong Province, No.2012GHY11515]

艾冰花(1990-), 女, 河南澠池人, 碩士, 主要從事水生生物學(xué)和微生物學(xué)研究, 電話: 13356903651, E-mail: 963007166@ qq.com; 李秉鈞, 通信作者, 教授, E-mail: li6234307@163.com