重組犬瘟熱病毒F-H融合基因乳酸菌的構(gòu)建及表達(dá)

蘇鳳艷，李哲，李艷芝，王春鳳，曾范利

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省伊通滿族自治縣畜牧工作總站 吉林 伊通 130700；3.吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心 吉林 長(zhǎng)春 130118)

重組犬瘟熱病毒F-H融合基因乳酸菌的構(gòu)建及表達(dá)

蘇鳳艷1，李哲1，李艷芝2，王春鳳3，曾范利1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省伊通滿族自治縣畜牧工作總站 吉林 伊通 130700；3.吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心 吉林 長(zhǎng)春 130118)

為了構(gòu)建重組犬瘟熱病毒(CDV)F-H融合基因工程乳酸菌，采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)技術(shù)擴(kuò)增CDV F-H融合基因。將F-H融合基因亞克隆至穿梭載體pSIP409多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建pSIP-F-H表達(dá)重組子，并電轉(zhuǎn)化至植物乳桿菌NC8感受態(tài)細(xì)胞中。利用SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)F-H融合蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，成功地?cái)U(kuò)增了CDV F-H融合基因，構(gòu)建了pSIP-F-H重組表達(dá)質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)化至乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)表明，重組乳酸桿菌表達(dá)了分子量約為62.96 ku的F-H融合蛋白，且該蛋白能與CDV陽(yáng)性抗體反應(yīng)，具有反應(yīng)原性。

犬瘟熱病毒；F-H融合基因；乳酸桿菌；表達(dá)

犬瘟熱系由副粘病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)引起的高度接觸性傳染病[1]。自1809年發(fā)現(xiàn)CD以來(lái),該病已給經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)、養(yǎng)犬業(yè)、野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)、動(dòng)物園觀賞業(yè)造成了巨大的損失[2]。且隨著CDV的變異、動(dòng)物對(duì)流行病因素的適應(yīng)，CDV易感宿主的范圍有擴(kuò)大的趨勢(shì)，流行趨勢(shì)由散在發(fā)生趨勢(shì)向群發(fā)趨勢(shì)發(fā)展，臨床癥狀也越來(lái)越復(fù)雜，其危害也越來(lái)越大，單純依靠傳統(tǒng)疫苗免疫不能徹底防制犬瘟熱的流行與發(fā)生[3]，有必要研制新型的基因工程疫苗來(lái)防控疾病的暴發(fā)。

CDV由基質(zhì)蛋白(M)、核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、血凝蛋白(H)、融合蛋白(F)和大蛋白(L)6種結(jié)構(gòu)蛋白組成[4]，其中H和F兩種糖蛋白組成病毒囊膜表面纖突，CDV通過(guò)H蛋白吸附到細(xì)胞表面的受體上，起細(xì)胞趨向作用，而F蛋白介導(dǎo)病毒與感染細(xì)胞、感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞間融合，使病毒具有在宿主體內(nèi)擴(kuò)散的能力，是感染性病毒粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞所必需的，且可能介導(dǎo)病毒感染[5]。具有中和作用的抗H蛋白抗體和抑制細(xì)胞融合的抗F蛋白抗體，在抗CDV感染的機(jī)制中發(fā)揮重要作用，是機(jī)體的主要保護(hù)性抗原，是目前制備CDV亞單位疫苗或合成疫苗的首選抗原[6-7]。因此，本研究以穿梭載體pSIP409為工具，構(gòu)建可表達(dá)CDV F-H基因的重組基因工程乳酸菌，為進(jìn)一步研究基因重組乳酸桿菌的免疫效果及免疫保護(hù)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 大腸桿菌乳酸菌穿梭質(zhì)粒載體pSIP409和植物乳桿菌NC8由印度卡馬拉杰大學(xué)Anbazhagan.K高級(jí)研究員惠贈(zèng)，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)王春鳳教授保存。菌株E.coliBL21和DH 5α由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室保存。pMD-18T-CDVF和pMD-18T-CDVH重組克隆質(zhì)粒由本研究室構(gòu)建。

1.2 工具酶和主要試劑 DNA Marker、EcoRⅠ、HandⅢ、T4 DNA連接酶、PCR試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品； DNA凝膠回收試劑盒為杭州維特潔生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為上海生物化學(xué)研究所產(chǎn)品。兔抗犬瘟熱陽(yáng)性血清由中國(guó)農(nóng)科院左家特產(chǎn)研究所惠贈(zèng)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。PVDF轉(zhuǎn)移膜為Gleman公司產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 為了擴(kuò)增CDV的F -H融合基因,共設(shè)計(jì)了2對(duì)4條引物。根據(jù)犬瘟熱病毒F和H基因設(shè)計(jì)特異性引物P1和P2、P3和P4。引物 P1引入EcoRI 酶切位點(diǎn)，引物 P2引入一段由高親水性氨基酸(Gly-Pro-Gly-Pro-Gly )編碼基因GCCCGGACCCGGACC組成的linker；引物 P3引入與P2互補(bǔ)的linker，引物P4引入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

F-Linker上游引物P1: ATTAGAATTCCTTAGGTATTATACTGAGT

F-Linker下游引物P2：GCCCGGACCCGGACCAGAGCGCCTAACCGTCTGAA

Linker-H上游引物P3: GGTCCGGGTCCGGGCACACCTATGGATCATGTTGAG

Linker-H下游引物P4：CATTAAGCTTTTAACGGTTACATGAGA

1.4 犬瘟熱病毒H基因、F基因和F-H融合基因的擴(kuò)增與純化 分別以克隆質(zhì)粒pMD18T-CDVF和pMD18T-CDVH質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增用于構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體的F和H基因片段。

F-Linker反應(yīng)體系：模板1μL ，上游引物0.5 μL，下游引物0.5μL，2×Master Mix 12.5μL，ddH2O 10.5μL，總體系25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃熱變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

Linker-H反應(yīng)體系：模板1 μL ，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，總體系25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃熱變性30 s，58.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

F-H融合基因PCR反應(yīng)體系：F-Linker回收產(chǎn)物0.4 μL，Linker-H回收產(chǎn)物0.6 μL，F(xiàn)-Linker上游引物P1 0.5 μL，Linker-H下游引物P4 0.5 μL，2×Master Mix 12.5 μL，dd H2O 10.5 μL，總體積25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物采用DNA片段純化試劑盒純化。

1.5 克隆載體pMD18-F-H重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 將純化的F-H融合基因與pMD-18T Simple Vector進(jìn)行連接，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD18-F-H。并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH 5α，涂布于含Amp 的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，將陽(yáng)性菌株用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切重組質(zhì)粒的鑒定。

1.6 乳酸菌表達(dá)載體pSIP-F-H的構(gòu)建與鑒定 將重組克隆質(zhì)粒pMD18-F-H和乳酸菌表達(dá)載體pSIP-409分別以EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，利用凝膠回收純化試劑盒分別回收F-H基因和pSIP-409片段，以T4 DNA 連接酶于16 ℃連接過(guò)夜,次日轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中。

挑取含em 200 mg/mL LB平板上8～12 h內(nèi)生長(zhǎng)的疑似陽(yáng)性菌落,分別接種于含em的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,180～200 rpm搖床過(guò)夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒,進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.7 植物乳桿菌NC8的電轉(zhuǎn)化 取5 μL重組質(zhì)粒pSIP-F-H加入200μL乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕混勻,移入預(yù)冷的電擊杯中冰上靜止5min, 調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)化儀電壓為2.0 kV和6 ms,進(jìn)行電擊。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后,取出電擊杯冰上靜止5 min,將轉(zhuǎn)化物移至800 μL的MRS液體培養(yǎng)基(含0.5 mol/L庶糖)中,30℃靜止厭氧培養(yǎng)3 h。取150 μL菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基(含em 200 mg/mL),30℃靜止厭養(yǎng)培養(yǎng)24-36 h。挑選生長(zhǎng)良好的單菌落,接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基(含em 200 mg/mL)中,30℃靜止厭氧培養(yǎng)過(guò)夜,乘勝小量質(zhì)粒提取試劑盒提取乳酸菌質(zhì)粒,并進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定, 陽(yáng)性質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.8 CDV F-H蛋白的表達(dá)檢測(cè)

1.8.1 重組乳酸菌SDS-PAGE檢測(cè) 將重組乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基(含em 200 mg/mL)中,30℃靜止厭氧培養(yǎng)至OD600約等于0.3時(shí),添加誘導(dǎo)肽SppIP進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后3和6 h取菌液超聲裂解進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。同法處理空載體pSIP-409乳酸菌培養(yǎng)作為對(duì)照。

1.8.2 重組乳酸菌的Western blot分析 經(jīng)SDS-PAGE電泳后的表達(dá)產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，取出PVDF膜置于封閉液中，37℃封閉1 h。封閉結(jié)束后，以洗滌緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次3 min。加入犬瘟熱多克隆抗血清，37℃感作1 h，以洗滌緩沖液洗滌PVDF膜5次，每次3 min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37℃感作1 h，以洗滌緩沖液洗滌PVDF膜5次，每次3 min。加入新配制的DAB顯色液，37℃避光顯色。

3 結(jié)果

3.1 F-Linker、 Linker-H 和F-H融合基因的擴(kuò)增結(jié)果 以克隆質(zhì)粒pMD18T-CDVF和pMD18T-CDVH質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增得到了約860 bp的F-Linker基因(圖1A)、約850 bp的Linker-H基因(圖1B)、約1700 bp的F-H融合基因(圖1C)，與預(yù)期擴(kuò)增的基因大小一致。

3.2 重組克隆質(zhì)粒pMD18-F-H的PCR 和酶切鑒定結(jié)果 以重組質(zhì)粒pMD18-F-H為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了約1700 bp的基因片段，與預(yù)期大小相符(圖2)。經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，得到了約2700 bp的pMD18-T線性片段和大小約為 1700 bp的目的片段，結(jié)果表明，該融合基因已經(jīng)連接到克隆質(zhì)粒 pMD-18T Simple vector 上(圖2)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2000(自上而下：2000,1000,750,500,250,100 bp)圖1 F-Linker、Linker-H和F-H融合基因的擴(kuò)增結(jié)果

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000(自上而下：2000,1000,750,500,250,100 bp)1.pMD18-F-H EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定 2. pMD18-F-H PCR鑒定圖2 重組克隆質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

3.3 重組乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒 pSIP-F-H和pSIP-IL-F-H的鑒定結(jié)果 以重組乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒 pSIP-F-H為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了約1700 bp的基因片段(圖3A)，與預(yù)期大小相符。經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，得到了pSIP409線性片段和大小約為 1700 bp的目的片段(圖3B)，初步表明，融合基因已經(jīng)連接到乳酸菌表達(dá)載體pSIP409上。陽(yáng)性重組乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒 pSIP-F-H送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與水貂源CDV F-H基因序列比對(duì)結(jié)果完全一致，沒(méi)有出現(xiàn)缺失、移位、錯(cuò)配及突變現(xiàn)象，證實(shí)成功地構(gòu)建了重組乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒pSIP-F-H。

3.4 重組融合表達(dá)載體在大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 在E.coliBL21(DE3)中，重組表達(dá)質(zhì)粒pSIP-F-H由SppIP誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒在E.coliBL21 中出現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)的融合蛋白大小約為62.96 ku(圖4A),與預(yù)測(cè)大小相符。

為了進(jìn)一步鑒定表達(dá)產(chǎn)物，將表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以犬瘟熱多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，聯(lián)苯胺(DAB)為底物，進(jìn)行western-blot分析，在62.96 ku(圖4B)處分別有一條明顯的蛋白印跡帶，表明經(jīng)大腸桿菌表達(dá)后，表達(dá)產(chǎn)物依然具有與CDV 抗血清結(jié)合的免疫反應(yīng)性。3.5 重組融合表達(dá)載體在乳酸菌中誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 重組表達(dá)質(zhì)粒pSIP-F-H在乳酸菌NC8中經(jīng)SppIP誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒在乳酸菌中出現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)的融合蛋白約為62.96 ku(圖5A),與預(yù)測(cè)大小相符。

M. 250bp DNA Ladder Marker(自下而上：250、500、750、1000、1500、2250、3000、4500 bp)1. pSIP-F-H PCR鑒定 2. pSIP-F-H EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定圖3 重組乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

1. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4)；2，3. pSIP-F-H在大腸桿菌BL21中表達(dá)產(chǎn)物；4.空載體pSIP-409在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)前產(chǎn)物；5.空載體pSIP-409在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)后產(chǎn)物；6.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(180、135、100、75、63、48、35、25、17)；7.pSIP-F-H在大腸桿菌BL21中表達(dá)產(chǎn)物圖4 大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

為了進(jìn)一步鑒定表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以犬瘟熱多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，聯(lián)苯胺(DAB)為底物，進(jìn)行western-blot分析，在62.96 ku(圖5B)處有一條明顯的蛋白印跡帶，表明經(jīng)乳酸桿菌表達(dá)后，表達(dá)產(chǎn)物依然具有與CDV 抗血清結(jié)合的免疫反應(yīng)性。

1，2. pSIP-F-H在乳酸桿菌NC8中表達(dá)產(chǎn)物； 3.空載體pSIP-409在乳酸桿菌NC8中誘導(dǎo)前的產(chǎn)物；4. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(180、135、100、75、63、48、35、25、17)；5.空載體pSIP-409在乳酸桿菌NC8中誘導(dǎo)后的產(chǎn)物；6. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4) ；7. pSIP-F-H在乳酸桿菌NC8中表達(dá)產(chǎn)物 圖6 乳酸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

4 討論

隨著毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的不斷擴(kuò)大，集約化、密集程度越來(lái)越高，犬瘟熱成為嚴(yán)重威脅毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的疾病之一。盡管我國(guó)在毛皮動(dòng)物犬瘟熱的診斷和防制上也做了大量的卓有成效的工作，研制成功了犬瘟熱弱毒疫苗和滅活苗，在全國(guó)范圍內(nèi)大面積推廣，并取得了明顯的經(jīng)濟(jì)效益。但是，在實(shí)際生產(chǎn)中，犬瘟熱仍時(shí)有暴發(fā)[8-10]，尤其近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)許多地區(qū)頻頻出現(xiàn)免疫毛皮動(dòng)物爆發(fā)犬瘟熱的報(bào)道[11-12]。由于毛皮動(dòng)物犬瘟熱發(fā)病日趨嚴(yán)重，生產(chǎn)上迫切需要有效的防治技術(shù)，急需開(kāi)展深入研究并研制高效的防制技術(shù)，有效控制犬瘟熱的發(fā)生與流行。

乳酸菌作為機(jī)體胃腸道菌群中的益生菌，可調(diào)節(jié)胃腸道常菌群，保持胃腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，且菌體本身含有的多種成分亦有強(qiáng)大的益生功能[13]，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，菌體表達(dá)的外源蛋白不需要純化即可與菌體一起服用，是目前較理想的轉(zhuǎn)化或表達(dá)系統(tǒng)[14-15]。目前乳酸菌作為遞呈肽類、低聚糖和核酸等生物分子載體的研究日益成熟，乳酸菌已成為運(yùn)載功能分子的重要工具，在介導(dǎo)消化道局部免疫，進(jìn)而影響全身免疫具有重要作用[16]。胡靜濤等[17]構(gòu)建了重組鵝源新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸桿菌，SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明，構(gòu)建的HN基因重組乳酸菌可表達(dá)與HN蛋白大小相符的條帶，而且該表達(dá)蛋白可與NDV陽(yáng)性抗體發(fā)生反應(yīng)，具有反應(yīng)原性。蘇君鴻等[18]以乳酸桿菌為載體構(gòu)建了豬傳染性胃腸炎病毒S基因A、D抗原位點(diǎn)DNA疫苗，具有益生性與免疫預(yù)防的雙重功效。本研究以CDV的H基因和F基因?yàn)檠芯繉?duì)象,采用SEQ-PCR技術(shù)擴(kuò)增CDV的F-H融合基因，成功構(gòu)建了CDV F-H基因的重組質(zhì)粒pSIP-F-H，電擊轉(zhuǎn)入乳酸桿菌NC8中構(gòu)建重組乳酸工程菌，SDS-PAGE和Western-blot分析結(jié)果證實(shí)，該重組菌能夠表達(dá)CDV的F-H融合蛋白，且該表達(dá)蛋白可與CDV的多克隆抗體反應(yīng)，具有免疫原性，這一研究結(jié)論與胡靜濤、蘇群鴻等研究結(jié)果一致，即重組乳酸工程菌可作為候選疫苗進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

本研究將疫苗的免疫預(yù)防作用與乳酸桿菌的益生作用有機(jī)結(jié)合起來(lái), 將水貂源犬瘟熱病毒F基因與H基因融合在一起，構(gòu)建了含有F基因和H基因的重組乳酸工程菌，為以乳酸桿菌為載體的新型疫苗系統(tǒng)的研發(fā)以及動(dòng)物疾病的預(yù)防提供新的思路。

[1] 夏咸柱.養(yǎng)犬大全[M].吉林:吉林人民出版社,1993:549-553．

[2] 劉繼紅.犬瘟熱病毒的研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué),2007,17(1-2):144-149．

[3] 陳秀.犬瘟熱流行病學(xué)調(diào)查與防制措施[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2012,39(12):169-172.

[4] Sidhu M S,Husar W,Cook S D,etal.Canine distemper terminal and intergenic non-protein coding nucleotide sequence: completion of the entire CDV genome sequence[J].Virology,1993,193(1):66-72．

[5] Wild T F,Fayolle I,Beauverger P,etal.Measles virus fusion: role of the cysteine-rich region of the fusion glycoprotein[J].J Virol,1994,68(11):7546-7548．

[6] Hirayama N,Senda M,Nakashima N,etal.Protective effects of monoclonal antibodies against lethal canine distemper virus infection in mice[J].J Gen Virol,1991,72(11):2827-2830．

[7] Obeid O E,Partrdus C D,Howard C R,etal.Protection against morbillivirus-induced encephalitis by immunization with a rational designed synthetic peptide vaccine containing B- and T-cell epitopes from the fusion protein of meals virus[J].J Gen Virol,1995,69(3):1420-1428．

[8] 王聰,邴啟政,張熒,等.水貂犬瘟熱流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)2013,40(4):198-201.

[9] 楊麗,徐廣賢,段相國(guó),等.犬瘟熱病毒的分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2016,46(2):228-231.

[10]孫彥剛,趙建軍,史寧,等.狐源犬瘟熱病毒的分離鑒定及H基因遺傳變異分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2016,38(3):206-210.

[11]王琦,張永光.犬瘟熱免疫失敗原因與對(duì)策[J].新農(nóng)業(yè),2015(11):52-53

[12]劉秉璽,張彥雙.淺談狐犬瘟熱免疫失敗原因及相應(yīng)防制措施[J].吉林畜牧獸醫(yī),2015(1):59-60.

[13]黃皓,胡珊,梁衛(wèi)驅(qū),等.乳酸菌微膠囊制劑的功能性與穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)食品添加劑,2016(4):90-93.

[14]蔡若鵬,楊桂連,王春鳳.口服重組乳酸菌的藥用研究與應(yīng)用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2014,49(22):1973-1977.

[15]任大勇,李昌,秦艷青，等.乳酸菌益生功能及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志,2011,45(2):47-50.

[16]劉曉銳,張曉紅,吳潔.乳酸乳球菌在疫苗遞呈載體中的應(yīng)用[J].藥物生產(chǎn)技術(shù),2014,21(1):75-80.

[17]胡靜濤,郭衍冰,楊文濤,等.重組鵝源新城疫病毒HN基因乳酸菌的構(gòu)建[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2015,45(12):1242-1246.

[18]蘇君鴻,李云崗,陳樹(shù)林,等.以乳酸桿菌為載體的豬傳染性胃腸炎病毒S基因A、D抗原位點(diǎn)DNA疫苗的構(gòu)建[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(8):19-23.

(編輯：陳希)

Construction and Expression of RecombinantLactobacillusContaining F-H Fusion Gene of Canine Distemper Virus from Mink

SU Feng-yan1,LI Zhe1,LI Yan-zhi2,WANG Cun-feng3,ZENG Fan-li1

(1.CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changcun130118,China;2.AnimalHusbandryWorkStationofYtongManzhuAutonomousCountyinJilinProvince,Jinlin,Ytong130700,China;3.ResearchCenterofAnimalProbioticsEngineeringinJilinProvince,Changcun130118,China)

In order to constructLactobacilluscontaining a F-H fusion gene of canine distemper virus(CDV), the F-H fusion gene was amplified by gene splicing by overlap extension PCR(SOE-PCR).The F-H fusion gene was sub-cloned into shuttle carrier pSIP409 to construct a recombinant plasmid(named as pSIP-F-H).Then the recombinant plasmid pSIP-F-H was elec-transformed intoLactobacillusplantarumcompetence cells. SDS-PAGE and Western-blot were used to detect the expression of F-H fusion protein. In results, the F-H fusion gene of CDV was amplified successfully. The recombinant plasmid pSIP-F-H was constructed and elc-transformed intoLactobacillusplantarumcompetence cells successfully. Results of SDS-PAGE and Western-blot showed that recombinantLactobacillusexpressed a fusion protein (nearly 62.96 ku in size) and the protein can react with CDV positive antibody.

canine distemper virus; F-H fusion gene;Lactobacillus; expression

吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130206039NY)

蘇鳳艷，博士,教授,從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疾病防治方面研究。E-mail:sufy110@163.com

2016-07-29

A

1002-1280 (2016) 09-0015-07

S852.6