嗜水氣單胞菌雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

高智玲，紀 雪，郭學(xué)軍，陳 萍，劉彥晶，劉 軍，祝令偉，周 偉，馮書章，孫 洋

嗜水氣單胞菌雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

高智玲1,2，紀 雪1，郭學(xué)軍1，陳 萍2，劉彥晶3，劉 軍1，祝令偉1，周 偉1，馮書章1，孫 洋1

目的 建立快速準確檢測致病性嗜水氣單胞菌的雙重?zé)晒舛縋CR方法。方法針對嗜水氣單胞菌的16S rDNA和氣溶素基因aerA的序列設(shè)計特異性引物及TaqMan探針，優(yōu)化雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件，并結(jié)合常規(guī)PCR方法及分離培養(yǎng)鑒定對臨床樣品進行檢測和對比驗證。結(jié)果熒光定量PCR反應(yīng)體系對質(zhì)粒標準品的敏感性為10拷貝/反應(yīng)，是常規(guī)PCR檢測方法的100倍；該方法檢測12種其他種屬細菌時未出現(xiàn)假陽性；對實際樣品的檢測結(jié)果其敏感性同樣高于普通PCR，定量檢測目的基因的拷貝數(shù)與樣品中目的菌的分離率成正比。結(jié)論本方法敏感性高，特異性好，可用于致病性嗜水氣單胞菌感染的診斷、疾病防控及流行病學(xué)研究。

嗜水氣單胞菌；熒光定量PCR；檢測；應(yīng)用

Supported by the National Science and Technology Major Project of China (No. 2013ZX10004-217-002) and the Scientific and Technological Development Project of Jilin Province (Nos. 20140101032JC and 20150101110 JC) Corresponding author: Sun Yang, Email: sunyang10@hotmail.com

嗜水氣單胞菌是一種革蘭氏陰性桿菌，可從水、魚、無脊椎動物、土壤及食物中分離出來，往往與其他疾病關(guān)聯(lián)而發(fā)生繼發(fā)性感染[1]。近年來，由于其對人類及水生動物的潛在致病性而備受世界關(guān)注。對于人類，嗜水氣單胞菌可以引發(fā)多種疾病，從輕微的胃腸、傷口感染到危及生命的敗血癥及壞死性筋膜炎[2]，對于魚類，可引發(fā)出血病、紅鰭病及敗血癥等疾病。目前，嗜水氣單胞菌所引起的疾病已成為威脅我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[3]。因此，建立一種快速、準確的診斷方法顯得尤為重要。實時熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的一種新技術(shù)，與普通PCR相比，具有自動化程度高、快速、敏感、特異性好的特點[4]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，例如細胞因子[5]、基因表達[6]、病毒篩選[7]和細菌病原體檢測[8]等。本研究旨在建立基于TaqMan探針的雙重實時熒光定量PCR方法，可同時完成嗜水氣單胞菌的快速檢測及毒力確認，為預(yù)防和監(jiān)測致病性嗜水氣單胞菌病的流行提供有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品 嗜水氣單胞菌質(zhì)控菌株ATCC7966、大腸桿菌DH5α及特異性檢測所用菌株均為本實驗室保存。魚類樣品采集于長春周邊養(yǎng)魚場及水產(chǎn)市場。

1.2 主要試劑與儀器 PCR擴增預(yù)混液Premix PrimeSTAR HS、T4 DNA連接酶、DL2000 DNA Marker及PMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；熒光定量PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。實時定量PCR擴增儀(ABI StepOne Plus)，核酸蛋白檢測儀(Quawell Q5000)。

1.3 引物及探針的設(shè)計及合成 參考文獻[9]，針對嗜水氣單胞菌屬特異性16S rDNA基因片段，合成了引物和TaqMan探針，報告基團為FAM，淬滅基團為TAMRA。同時用Premier 5.0生物軟件針對嗜水氣單胞菌氣溶素基因設(shè)計特異性引物和探針，報告基團為VIC，淬滅基團為BHQ1。引物、探針由invitrogen公司合成(表1)。

表1 引物及探針序列

Tab.1 Sequences of primers and probes

Primer/probeSequences(5′-3′)Productsize(bp)AH16SrDNA?FGGCCTTGCGCGATTGGATAT103AH16SrDNA?RGTGGCTGATCATCCTCTCAGAAH16SrDNA?PFAM?CAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGG?TAMRAAHaerA?FGCTCCAAGATCCCGGTGAAG146AHaerA?RGCGGTTGTCCGGATGGGTATAHaerA?PVIC?CGAGCTCTACAAGGCTGACATCTCCT?BHQ1

1.4 質(zhì)粒標準品模板的制備 以ATCC7966基因組DNA為模板，擴增嗜水氣單胞菌16S rDNA基因特異性片段和氣溶素基因片段，凝膠回收試劑盒回收擴增的目的片段，與pMD18-T載體連接，分別轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆提取質(zhì)粒，作為熒光定量PCR模板。

1.5 雙重TaqMan實時熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃，1s；60 ℃，20s，40個循環(huán)。設(shè)立陰性對照(去離子水)。分別以0.3 μL、0.5 μL、0.7 μL的引物及探針進行反應(yīng)(各條引物、探針使用液均為10 μmol/L)，以確定最佳引物濃度及探針濃度。

1.6 標準曲線的建立 重組質(zhì)粒以核酸蛋白檢測儀測定核酸濃度，根據(jù)重組質(zhì)粒的堿基數(shù)計算分子質(zhì)量，換算單位體積拷貝數(shù)。將質(zhì)粒標準品10倍梯度稀釋(109拷貝/μL～100拷貝/μL)，分別取2 μL作為模板進行熒光定量PCR擴增，進而建立標準曲線。

1.7 特異性試驗 以不同種屬(嗜水氣單胞菌ATCC7966、殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、豬霍亂弧菌，肺炎克雷伯菌、不動桿菌、鏈球菌、及嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌)細菌基因組DNA為模板，進行雙重嗜水氣單胞菌TaqMan熒光定量PCR擴增，同時設(shè)陰性對照，鑒定其特異性。

1.8 重復(fù)性試驗 以3個不同濃度的2種質(zhì)粒標準品(107copies/μL、105copies/μL及103copies/μL)為模板，進行熒光定量PCR重復(fù)性試驗。

1.9 敏感性試驗 將109～100 copies/μL的質(zhì)粒標準品進行雙重TaqMan熒光定量PCR，并同時進行普通PCR，比較2種方法的檢出限，確定敏感性指標。

1.10 實際樣品的檢測 73份淡水魚鰓拭子及腸道內(nèi)容物樣品懸液以細菌基因組提取試劑盒抽提DNA制備模板，雙重TaqMan熒光定量PCR進行檢測，同時以普通PCR方法擴增。參考文獻[10]方法，73份樣品進行致病性嗜水氣單胞菌的分離培養(yǎng)及鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 雙重TaqMan實時熒光定量PCR最佳反應(yīng)體系的確定 經(jīng)過對退火溫度、模板、引物和探針的濃度進行優(yōu)化，確定雙重TaqMan 熒光定量PCR 20 μL反應(yīng)體系的最佳組成為：Premix Ex Taq 10 μL，ROX 2 μL，引物、探針各0.5 μL，ddH2O 3 μL，模板2 μL。

2.2 標準曲線的建立 以優(yōu)化的熒光定量PCR方法對梯度稀釋的質(zhì)粒標準品進行擴增，建立熒光定量PCR標準曲線(圖1)，16S rDNA基因及Aero基因擴增方程式分別為y=-3.393x+38.879和y=-3.19x+38.567，相關(guān)系數(shù)R2達到0.998及1。

圖1 熒光定量PCR標準曲線Fig.1 Standard curves of fluorescence quantitative PCR

2.3 特異性檢測 沙門氏菌、腸球菌和大腸桿菌等其他種屬細菌的擴增結(jié)果均為陰性，僅嗜水氣單胞菌呈現(xiàn)良好的擴增曲線，證明了該雙重?zé)晒舛縋CR方法的特異性。

2.4 重復(fù)性試驗 3個梯度的質(zhì)粒標準品重復(fù)擴增4次，雙重?zé)晒舛縋CR擴增曲線重疊性好，Ct值誤差不到1個循環(huán)，變異系數(shù)(CV)在0.18%～0.55%之間，具有較高的可重復(fù)性，保證了檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性(表2)。

表2 熒光定量PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

Tab.2 Results of reproducibility test

Copies/μLTargetGenesCTValues1234xsCV(%)10716s12．4112．2612．2712．3312．320．060．49A12．8012．7212．8712．9112．830．070．5510516s19．8919．8120．0219．7619．870．100．50A20．5520．5020．3820．3720．450．080．3910316s27．7227．7028．0027．9127．830．130．47A28．3528．3728．2628．2728．310．050．18

2.5 敏感性試驗 結(jié)果表明雙重?zé)晒舛縋CR對2種目的基因的最低檢測限均為10拷貝(圖2)，而常規(guī)PCR的最低檢測限為103拷貝(圖3)。

2.6 實際樣品檢測結(jié)果 熒光定量PCR檢測嗜水氣單胞菌陽性率為97.26%(71/73)，氣溶素基因陽性率為79.45%(58/73)；普通PCR檢測嗜水氣單胞菌陽性率為72.60%(53/73)，氣溶素基因陽性率為20.55%(15/73)。其中熒光定量PCR檢測陰性樣品普通PCR方法檢測也為陰性，普通PCR檢測陽性樣品熒光定量PCR檢測同樣為陽性。以致病性嗜水氣單胞菌選擇性培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)并進行生化鑒定，73份樣品有15份分離到致病性嗜水氣單胞菌，均為熒光定量PCR檢測陽性樣品，陰性樣品未分離到致病性嗜水氣單胞菌。

1: 109copies；2：108copies；3：107copies，以此類推1: 109copies；2: 108copies；3: 107copies, and so on.圖2 雙重?zé)晒舛縋CR的敏感性檢測Fig.2 Sensitivity analysis of fluorescence quantitative PCR

1～10孔的模板濃度依次為109～100 copies；M：100bp Marker；N：陰性對照1-10: 109-100 copies; M: 100bp Marker; N: Negative control.圖3 雙重常規(guī)PCR的敏感性檢測Fig.3 Sensitivity analysis of ordinary PCR

3 討 論

水產(chǎn)品的安全問題越來越受到全社會的關(guān)注，嗜水氣單胞菌作為水產(chǎn)品中的常見菌，在水生環(huán)境中廣泛分布，根據(jù)其毒力差異，可分為致病性菌株和非致病性菌株。致病性菌株可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動物，輕可引起皮膚感染及腹瀉，重者引起敗血癥，是一種典型的人獸共患病病原菌。目前，由于致病性嗜水氣單胞菌引起水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的頻發(fā)及人感染病例日漸增多，該菌的檢測及防治變得愈加重要。

熒光定量PCR技術(shù)兼?zhèn)浜怂岣咝U增和精確定量等優(yōu)點，且假陽性率低、重復(fù)性好，與普通PCR相比具有明顯的優(yōu)勢。本研究使用Premix Ex TaqTM預(yù)混酶替代了前期實驗中的Ex Taq Hot Star、10×buffer和dNTP等試劑，使繁瑣的加樣過程變得簡單、快速，并且降低了操作過程中污染的機率。建立的的熒光定量PCR方法對沙門氏菌、腸球菌、大腸桿菌等12種其他屬的菌株進行檢測，結(jié)果均為陰性，證明該方法對致病性嗜水氣單胞菌具有很好的特異性，且敏感性高，最低檢測限達到普通PCR方法的100倍。

該方法能夠?qū)嶋H樣品的核酸提取物進行直接檢測，使得檢測結(jié)果更加快速、準確，同時能判定樣品中目的菌的數(shù)量。在樣品中目的菌較少的情況下，常規(guī)的分離培養(yǎng)難以獲得陽性結(jié)果。實際樣品的檢測及分離鑒定結(jié)果表明，所有分離株均來源于熒光定量PCR陽性樣品，且aerA基因拷貝數(shù)高的樣品目的菌的分離率較高，進一步驗證了本方法的實用性。本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法可用于致病性嗜水氣單胞菌感染的診斷、疾病防控及流行病學(xué)研究。

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Establishment and application of a duplex real-time fluorescence quantitative PCR assay for detection ofAeromonashydrophila

GAO Zhi-ling1,2, JI Xue1, GUO Xue-jun1, CHEN Ping2, LIU Yan-jing3, LIU Jun1,ZHU Ling-wei1, ZHOU Wei1, FENG Shu-zhang1, SUN Yang1

(1.InstituteofMilitaryVeterinary,AMMS,theKeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun130122,China;2.CollegeofFoodScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;3.TheAffiliatedHospital,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130021,China)

To establish a method of duplex real-time fluorescence quantitative PCR assay for detectingAeromonashydrophilaand pathogenicA.hydrophilasimultaneously, two sets of primers and TaqMan probes were designed based on the sequences of the 16S rDNA and aerolysin (aerA) gene. Then the method was constructed and optimized. The specificity, sensitivity and reproducibility of the method were tested, and the clinic samples were detected. Results showed the sensitivity of the duplex real-time TaqMan PCR assay for testing of recombinant plasmids was 10 copies per reaction, which was 100 times higher than ordinary PCR method. No specific amplification was presented when twelve species of other bacteria genera were tested. The detection results of clinic samples showed that the sensitivity was also higher than that of ordinary PCR. And the gene copy numbers of quantitative detection were proportional to the rate separation. The method was highly sensitive, specific and practical, and could be used for the diagnosis, disease prevention and control and epidemiologic study of pathogenicA.hydrophila.

Aeromonashydrophila; fluorescent quantitative PCR; detection; application

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.016

國家科技部傳染病重大專項(No.2013ZX10004-217-002)和吉林省科技計劃項目(No.20140101032JC，20150101110JC)聯(lián)合資助

孫 洋，Email: sunyang10@hotmail.com

1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，長春 130122； 2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130118； 3. 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021

S852.61；R378

B

1002-2694(2016)12-1126-05

2016-05-01；

2016-07-22