槐耳清膏抑制小鼠模型人胃癌MKN-45細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

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槐耳清膏抑制小鼠模型人胃癌MKN-45細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

張?jiān)X1程向東2徐志遠(yuǎn)2呂 航2杜義安3湯加寧1羅華榮4

目的研究槐耳清膏對(duì)人胃癌MKN-45細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。方法采用BALB/c裸鼠建立人胃癌MKN-45細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，隨機(jī)分為槐耳清膏組、空白對(duì)照組，每組20只。建模后，每5天測(cè)量裸鼠荷瘤并計(jì)算腫瘤相對(duì)體積（RTV）；用藥5周后處死裸鼠，Real-time qPCR檢測(cè)腫瘤組織Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin和VEGF表達(dá)水平。結(jié)果槐耳清膏組末次測(cè)得的足墊瘤RTV為（662.75±450.66）mm3，明顯小于空白對(duì)照組的（1611.85±611.83）mm3（P＜0.01）?；倍甯嘟M淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率8/20（40%）與對(duì)照組15/20（70%）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?；倍甯嘟M腫瘤組織Wnt、β-catenin、N-cadherin和VEGF的△CT值分別為（11.36±1.32）、（11.31±1.76）、（12.82±2.22）、（13.22±1.52），均高于對(duì)照組的（9.48±2.07）、（9.37±1.88）、（7.74±2.64）、（11.04±1.61），而E-cadherin的△CT值（8.26±2.39）低于對(duì)照組的（10.64± 1.48）（P＜0.05）。結(jié)論 槐耳清膏可抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞在裸鼠上的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與抗血管生成和阻礙上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程有關(guān)。

裸鼠；槐耳清膏；人胃癌MKN-45細(xì)胞；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

KEY WORDSnude mice;trametes robiniophila;human gastric cancer cell line MKN-45;lymphatic metastasis; EMT

胃癌（gastric cancer，GC）是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第二大常見(jiàn)原因，僅僅2012年估計(jì)全球范圍內(nèi)就有新發(fā) 951,600例和723100死亡病例[1]。目前早期發(fā)生的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是胃癌預(yù)后不佳的主要原因，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是主要轉(zhuǎn)移擴(kuò)散途徑之一。所以有必要尋找一種有效抑制胃癌轉(zhuǎn)移的治療方法，降低胃癌的轉(zhuǎn)移及死亡?；倍且环N在中國(guó)已經(jīng)使用了將近1600年的藥用真菌，而近幾十年才發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤特性，并逐漸應(yīng)用于腫瘤的輔助治療之中。研究[2-4]表明，槐耳可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制血管生成、增加化療療效及免疫系統(tǒng)功能。盡管槐耳的抗腫瘤特性已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但至今相關(guān)的研究成果仍是相當(dāng)有限，且其確切的抗腫瘤機(jī)制仍是未知的。本實(shí)驗(yàn)采用將人胃癌MKN-45細(xì)胞系接種于裸鼠足墊皮下，建立胃癌裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，并用槐耳多糖提取物灌胃方式對(duì)其進(jìn)行治療，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及治療效果，旨在為槐耳對(duì)抗胃癌生長(zhǎng)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移治療提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株 4～6周齡BALB/c無(wú)胸腺裸鼠40只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證 [SCXK（滬）2013-6016]。人胃癌MKN-45細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液和胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；槐耳清膏（啟東蓋天力藥業(yè)有限公司）溶于生理鹽水中，配成200mg/mL，20μm濾膜過(guò)濾除菌，4℃保存待用；RNA提取試劑盒（AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit，LOT：148052230，德國(guó)QIAGEN公司）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（LOT：AK5102，日本TaKaRa公司）；SYBR染料法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（LOT：AK6406，日本TaKaRa公司）。

1.3 主要儀器 37℃恒溫細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司，型號(hào)B5060EU）；生物安全柜（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)Forma Class II，A2）；倒置相差顯微鏡（德國(guó)LEICA公司，型號(hào)DM2000）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司，型號(hào)RM2235）；臺(tái)式高速離心機(jī)（力新儀器，型號(hào)Neofuge 23R）；臺(tái)式點(diǎn)動(dòng)離心機(jī)（其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)LX-200）；Real-time qPCR儀器（美國(guó)Applied Biosystems公司，7900HT Fast Real-time PCR System）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 接種細(xì)胞培養(yǎng)及準(zhǔn)備 人胃癌MKN-45細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用PBS洗滌細(xì)胞去除殘留培養(yǎng)基，再用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化后用PBS制成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，濃度為5×107/mL，制備好的細(xì)胞懸液于冰水浴中保存，于30min內(nèi)進(jìn)行接種。

2.2 胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立 無(wú)菌條件下，取上述MKN-45細(xì)胞懸液，50μL/只接種于裸鼠右下肢足墊，觀察人胃癌MKN-45細(xì)胞在裸鼠足墊生長(zhǎng)和成瘤及轉(zhuǎn)移情況。

實(shí)驗(yàn)分組：將建模后的40只裸鼠隨機(jī)分成為槐耳清膏組[槐耳清膏5g/（kg·2d）灌胃]、空白對(duì)照組[生理鹽水0.5mL/2d灌胃]，每組各20只。

2.3 腫瘤體積測(cè)量 建模2周后，每5天測(cè)量并記錄接種MKN-45細(xì)胞足墊大小變化，計(jì)算足墊瘤相對(duì)體積（relative tumor volume，RTV）=πxyz/6（x為長(zhǎng)度，y為寬度，z為厚度）。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移觀察：連續(xù)給藥5周后處死足墊成瘤的裸鼠，解剖腘窩淋巴結(jié)，經(jīng)常規(guī)病理HE染色，判斷是否存在轉(zhuǎn)移，以轉(zhuǎn)移數(shù)/成功建模數(shù)計(jì)算淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。

2.4 Real-time qPCR檢測(cè)足墊瘤組織中相關(guān)mRNA表達(dá) 留取實(shí)驗(yàn)裸鼠的足墊瘤組織，用RNA試劑盒提取其總RNA，用紫外分光光度計(jì)在260和280nm處測(cè)吸光度D值，計(jì)算RNA含量和純度，按cDNA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取3μgRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引物均由生工生物股份有限公司合成，其中β-Actin為內(nèi)參照，見(jiàn)表1。用Real-time qPCR方法檢測(cè)上述相關(guān)mRNA的表達(dá)量，反應(yīng)體系（20μL）：SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2x）10μL，上下游引物各 0.8μL，cDNA模板 2μL，ROX Reference Dye（50x）0.4μL，dH2O6μL。PCR反應(yīng)條件：95℃，30sec；40個(gè)循環(huán)：95℃，3sec；60℃，30sec。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Real-time qPCR引物序列

3 結(jié) 果

3.1 槐耳清膏抑制裸鼠模型的腫瘤生長(zhǎng) 通過(guò)觀察胃癌細(xì)胞MKN-45足墊種植裸鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)變化來(lái)評(píng)估槐耳的抗腫瘤效應(yīng)。對(duì)照組足墊瘤RTV增長(zhǎng)速率明顯高于實(shí)驗(yàn)給藥組，末次測(cè)得槐耳清膏組的足墊瘤RTV為（662.75±450.66）mm3，明顯小于空白對(duì)照組的RTV（1611.85±611.83）mm3（P＜0.01），見(jiàn)表2。此外，槐耳組裸鼠的活躍度明顯好于對(duì)照組，而體質(zhì)量及進(jìn)食量無(wú)明顯差異。

表2 兩組小鼠建模后足墊瘤相對(duì)體積變化（RTV）（±s）

表2 兩組小鼠建模后足墊瘤相對(duì)體積變化（RTV）（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01

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3.2 槐耳清膏抑制腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 于建模后5周處死裸鼠并解剖腘窩，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）；留取腘窩淋巴結(jié)組織進(jìn)行常規(guī)病理HE染色檢測(cè)，判斷其轉(zhuǎn)移情況見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移如表3所示，槐耳組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率（40%）與對(duì)照組（70%）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 兩組小鼠腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（只）

3.3 Real-time qPCR測(cè)定足墊瘤組織相關(guān)mRNA表達(dá) mRNA的表達(dá)水平以相對(duì)表達(dá)量△CT值進(jìn)行分析，即△CT=CT目的-CT內(nèi)參。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組足墊瘤組織中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、VEGF的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)在給予槐耳清膏灌胃治療后的足墊腫瘤組織中Wnt、β-catenin、N-cadherin、VEGF的△CT值均高于對(duì)照組，而E-cadherin的△CT值低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表4。這些結(jié)果表明槐耳清膏可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)阻礙EMT相關(guān)進(jìn)程，進(jìn)而抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

表4 兩組小鼠相關(guān)mRNA熒光定量△CT值比較（±s）

表4 兩組小鼠相關(guān)mRNA熒光定量△CT值比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

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4 討論

槐耳清膏是藥用真菌槐耳的提取物，其主要活性成分是多糖蛋白，含多種氨基酸及微量元素，已廣泛用于臨床的抗腫瘤治療中，但其確切的機(jī)制尚未完全清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)槐耳清膏灌胃方式作用于人胃癌MKN-45細(xì)胞的裸鼠模型，檢測(cè)其種植瘤大小變化及腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，本研究發(fā)現(xiàn)槐耳清膏可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠上的生長(zhǎng)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，明確其抗腫瘤作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李立新等[5]所做的槐耳清膏對(duì)荷瘤裸鼠肝癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的抑制作用一致。

血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件[6]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是腫瘤細(xì)胞分泌的這一種細(xì)胞因子，其通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移及新生血管形成在腫瘤的血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用[7-8]。對(duì)組織標(biāo)本的Real-time qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，VEGF的表達(dá)明顯受到抑制，我們判斷槐耳清膏可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，進(jìn)而抑制腫瘤支持血管的生成，限制了腫瘤進(jìn)一步的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程[9]。大量研究表明，多種信號(hào)通路參與腫瘤的EMT過(guò)程，如Wnt、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β）、Notch信號(hào)通路等[10-12]。在腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程中，緊密連接蛋白ZO-1（zonula occluden-1）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）等上皮標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，波形蛋白（vimentin）、N型鈣黏蛋白（N-cadherin）等間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，使上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞失去其細(xì)胞極性,疏松細(xì)胞間的連接，胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重組。這一系列的改變導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的黏附能力下降，進(jìn)而增加遷移運(yùn)動(dòng)能力，使得腫瘤細(xì)胞更易于脫離原有位置，發(fā)生侵襲或隨血行、淋巴等途徑轉(zhuǎn)移到體內(nèi)遠(yuǎn)隔部位，重新定位于新的器官或組織，最終導(dǎo)致腫瘤的多發(fā)轉(zhuǎn)移。本研究表明，經(jīng)槐耳清膏灌胃治療后，其腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率存在明顯差異，且Real-time qPCR檢測(cè)表明腫瘤組織中Wnt、β-catenin、N-cadherin這些相關(guān)mRNA的表達(dá)減少，而E-cadherin增加。當(dāng)Wnt信號(hào)明顯受到抑制時(shí)，β-catenin無(wú)法累積進(jìn)入核內(nèi)，從而降低EMT相關(guān)靶基因的激活，分別降低N-cadherin和升高E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞之間粘附能力，阻礙腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程，降低腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。

本研究對(duì)于臨床出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者應(yīng)用槐耳治療提供了一定的依據(jù)，但是由于研究中的細(xì)胞種類單一，不足以代表所有類型腫瘤的情況，故仍需進(jìn)一步擴(kuò)大細(xì)胞類型來(lái)深入探討槐耳清膏對(duì)不同腫瘤的影響。

總之，槐耳清膏在裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型中對(duì)人胃癌MKN-45細(xì)胞在裸鼠上的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用，且可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路干預(yù)EMT相關(guān)進(jìn)程，這些結(jié)果都提示槐耳清膏對(duì)于出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者存在一定的療效。

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（收稿：2015-09-20 修回：2015-10-13）

Trametes Robiniophila Restrains the Growth and Metastasis of Gastric Cancer Cell Line MKN-45 in Mice

ZHANG Yuansu1,CHENG Xiangdong2,XU Zhiyuan2,LV Hang2,DU Yian3,TANG允ia'ning1,LUO Huarong4.1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Gastrointestinal Surgery,Zhejiang Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China;3 Department of Abdominal Surgery,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022),China;4 Department of Pathology,Zhejiang Taizhou Hospital,Taizhou(317000),China

ObjectiveTo study the effects of trametes robiniophila on the growth and metastasis of human gastric cancer cell MKN-45 in nude mice,and to explore the mechanism.MethodsBALB/c nude mice were inoculated with MKN-45 cells to establish the lymph node metastasis model of human gastric carcinoma.After the model was successfully established,40 mice were randomly divided into control group and trametes robiniophila group（n=20 in each group）.After the mass formed,the caliper was used to measure the tumor size every 5 days. The relative tumor volume（RTV）was calculated.After 5 weeks,the nude mice were killed for determination of Wnt,beta-catenin,N-cadherin,VEGF mRNA expression by Real-time qPCR.ResultsAfter 5 weeks of drugs intervention,the RTV in trametes robiniophila group were less than that in control group（662.75±450.66mm3 vs 1611.85±611.83mm3,P＜0.01）.The lymph node metastasis rate of trametes robiniophila group was 8/20（40%）,lower than that in control group 15/20（75%）（P＜0.05）.Compared with control group,the△CT value of Wnt,β-catenin, N-cadherin,and VEGF in trametes robiniophila groupwere higher（11.36±1.32 vs 9.48±2.07，11.31±1.76 vs 9.37± 1.88，12.82±2.22 vs 7.74±2.64，13.22±1.52 vs 11.04±1.61）,the△CT value of E-cadherin were lower（8.26±2.39 vs 10.64±1.48）,with all P＜0.05.ConclusionTrametes robiniophila can inhibit the growth and lymphatic metastasis of human gastric cancer in nude mice,which might be related with anti-angiogenesis and setting the epithelialmesenchymal transition（EMT）process back.

浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)研究計(jì)劃（No.2012ZZ002）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.20131279004719）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2015ZA090）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（杭州 310053）；2.浙江省中醫(yī)院胃腸外科（杭州 310006）；3浙江省腫瘤醫(yī)院腹部外科（杭州 310022）；4浙江省臺(tái)州醫(yī)院病理科（臺(tái)州 317000）

程向東，Tel：13968032995；E-mail：abcsurg@gmail.com