赤霉素高產(chǎn)菌株選育及其固態(tài)發(fā)酵研究進(jìn)展

武文竹，陳俊英，白 凈，常 春

(鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001)

赤霉素高產(chǎn)菌株選育及其固態(tài)發(fā)酵研究進(jìn)展

武文竹，陳俊英*，白 凈*，常 春

(鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001)

目前，工業(yè)大規(guī)模赤霉素生產(chǎn)采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，但存在成本高、能耗大、環(huán)境不友好等突出問題。選育赤霉素高產(chǎn)菌株是提高赤霉素產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的重要手段。同時，固態(tài)發(fā)酵技術(shù)以其獨(dú)特優(yōu)勢在近30 a來重獲關(guān)注，赤霉素固態(tài)發(fā)酵研究因此取得很大進(jìn)展。綜述了赤霉素產(chǎn)生菌的單一誘變、復(fù)合誘變、原生質(zhì)體誘變手段，以及篩選穩(wěn)定高產(chǎn)突變株的方法，總結(jié)了赤霉素固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基種類以及固態(tài)發(fā)酵控制條件，并展望赤霉素固態(tài)發(fā)酵的巨大潛力。

赤霉素； 菌株選育； 誘變； 固態(tài)發(fā)酵; 發(fā)酵培養(yǎng)基； 發(fā)酵條件

赤霉素(gibberellins)是植物五大激素之一[1]，廣泛存在于綠色植物體內(nèi)。研究表明，部分真菌、細(xì)菌、藻類也能代謝產(chǎn)生赤霉素，但其在微生物體內(nèi)的生理作用尚不清楚[2]。赤霉素是一類以赤霉素烷為基本骨架的化合物的總稱，目前已確定136種結(jié)構(gòu)，按發(fā)現(xiàn)順序分別命名為GA1～GA136[3]。大部分赤霉素不具有生物調(diào)節(jié)作用，只有少數(shù)結(jié)構(gòu)如GA3、GA4、GA7、GA9等具有生物活性。GA3是應(yīng)用最廣泛的一種赤霉素，在西方也被稱為赤霉酸(gibberellic acid)，我國俗稱“九二0”，具有打破植物休眠期、促進(jìn)莖的生長、對種子催芽、誘導(dǎo)開花、促進(jìn)無籽果實(shí)發(fā)育等作用[2-4]，在農(nóng)林、園藝、種茶業(yè)、啤酒工業(yè)中均有極大應(yīng)用價值[5-6]。GA4和GA7的混合物(GA4+7)主要用于蘋果種植業(yè)，具有疏果、提高單果質(zhì)量、防止果裂和果銹的作用[7]。目前，GA3已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，GA4+7、GA9的應(yīng)用范圍也逐漸擴(kuò)大。

從植物體中直接提取或從微生物代謝產(chǎn)物中分離均可獲得少量赤霉素，因成本高、產(chǎn)量低而無法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)的誕生促使赤霉素生產(chǎn)向工業(yè)化發(fā)展，并擴(kuò)大了赤霉素的應(yīng)用范圍。日本研究者首先采用表層發(fā)酵技術(shù)，在發(fā)酵15～30 d，獲得40～60 mg/L赤霉素產(chǎn)物[8]。Corey和Mander先后用化學(xué)方法人工合成了GA3[9]。20世紀(jì)40年代，美英兩國設(shè)計出一套用于青霉素工業(yè)生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，并引入通氣攪拌技術(shù)，從而建立了深層液態(tài)發(fā)酵技術(shù)(submerged fermentation，縮寫SmF)[10]。目前，GA3的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)主要采用此技術(shù)，但SmF下游提取濃縮工藝及發(fā)酵廢液處理的成本難以降低，限制了GA3生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，阻礙了GA3的擴(kuò)大使用。因此人們開始研究降低GA3生產(chǎn)成本的方法，包括選育新型高產(chǎn)菌株、采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)及細(xì)胞固定化技術(shù)、優(yōu)化發(fā)酵過程及下游提取工藝等?；谇叭搜芯砍晒?，綜述了赤霉素生產(chǎn)菌株誘變選育手段以及固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)赤霉素的研究進(jìn)展，探討了固態(tài)發(fā)酵條件對赤霉素產(chǎn)量的影響，以期為赤霉素固態(tài)發(fā)酵研究提供參考。

1 菌株選育

天然菌株的赤霉素產(chǎn)量往往較低，Gordon將野生型赤霉菌株雜交，獲得了產(chǎn)赤霉素種類和產(chǎn)量均不同的雜交菌株，由此拉開赤霉菌選育工作的序幕。隨后，Phinney和Spector在此基礎(chǔ)上進(jìn)行赤霉素生物合成和遺傳途徑的研究時，得到了一種特殊菌株，它能大量合成GA4、GA7、GA9，但不能合成GA1、GA3[11]。此后，研究者開始采用雜交、理化誘變等手段，對赤霉素合成代謝途徑進(jìn)行深入研究，并對菌株進(jìn)行遺傳改良。在進(jìn)行遺傳途徑研究時，國外研究者獲得許多遺傳途徑缺失的突變株，只有個別菌株可用于赤霉素生產(chǎn)。我國于20世紀(jì)60年代選育出“蘇白”，70年代由上?！熬哦?”菌種選育協(xié)作組選育出“4303”，它們成為當(dāng)時國內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)的主要菌株[12]。但從歷史上看，選育出的穩(wěn)定高產(chǎn)菌株數(shù)量仍屈指可數(shù)。20世紀(jì)70年代后，原生質(zhì)體制備、再生與融合技術(shù)用于真菌育種方面逐漸趨于成熟，一些研究者將其用于赤霉素高產(chǎn)菌株育種，近年來，也有將新型基因工程技術(shù)用于誘變育種的報道。目前，用于赤霉素工業(yè)的菌類主要是串珠鐮刀菌(F.moniliforme)和藤倉赤霉菌(G.fujikuroi)。一些細(xì)菌也能代謝產(chǎn)生赤霉素，如早期發(fā)現(xiàn)的固氮螺菌和根瘤菌，以及新發(fā)現(xiàn)的木醋桿菌、草螺桿菌和芽孢桿菌[13]。但細(xì)菌產(chǎn)赤霉素的研究仍限于實(shí)驗(yàn)室研究階段，將細(xì)菌用于工業(yè)生產(chǎn)的案例未見報道。

1.1 誘變手段

早期誘變育種大多采用單一誘變劑，獲取高產(chǎn)突變株的效果并不十分理想，但這些突變菌株對于研究赤霉素合成途徑作用重大(表1)。后來，研究者將激光誘變用于微生物育種，其具有操作簡單、菌株變異率高、死亡率小等優(yōu)點(diǎn)，誘變效果優(yōu)于一般理化誘變劑，但激光的種類、照射時長對試驗(yàn)結(jié)果會產(chǎn)生較大影響。

表1 赤霉素產(chǎn)生菌的單一誘變

注：UV.紫外線；NTG.亞硝基胍。下同。

鑒于單一誘變效果不佳，研究者開始嘗試采用復(fù)合誘變手段，并取得一定成效(表2)。早期復(fù)合誘變對象是菌體懸浮液或小孢子，但由于赤霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株皆為喪失產(chǎn)孢能力的多核多細(xì)胞菌絲型[18]，菌體細(xì)胞壁在一定程度上削弱了誘變效果。20世紀(jì)90年代起，先通過原生質(zhì)體技術(shù)獲得菌體裸露的原生質(zhì)體，再用誘變劑直接處理原生質(zhì)體，這種誘變手段明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的誘變手段，也能夠解決傳統(tǒng)誘變后菌株傳代產(chǎn)量不穩(wěn)定的問題(表3)。除了物理誘變、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體誘變等方法外，運(yùn)用基因工程技術(shù)改造赤霉菌DNA也能夠獲得高產(chǎn)菌株。莊木坤[11]將透明顫菌血紅蛋白基因vgb導(dǎo)入赤霉菌的染色體組中，vgb的表達(dá)使得在限氧條件下，該菌株的赤霉素產(chǎn)量明顯提高。

表2 赤霉素產(chǎn)生菌的復(fù)合誘變

注：DES.硫酸二乙酯。

表3 赤霉素產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體誘變

1.2 篩選與傳代

赤霉菌經(jīng)誘變處理后得到大量突變株，利用菌株抗性進(jìn)行篩選是一種有效手段，酶活性也可作為篩選條件。篩選出高產(chǎn)突變株后要經(jīng)過傳代培養(yǎng)以檢驗(yàn)其高產(chǎn)穩(wěn)定性。2005年，張金兒等[27]將經(jīng)NTG誘變處理的6028菌株原生質(zhì)體涂布在含有2 000 μg/mL氯霉素的致死再生培養(yǎng)基平板上，獲得了大量氯霉素抗性突變株，其中赤霉素產(chǎn)量高于出發(fā)菌的陽性率達(dá)20%。從中選育出的7106# 高產(chǎn)菌株在20 t發(fā)酵罐中的產(chǎn)素能力比出發(fā)菌株提高7.58%，在60 t罐中提高9.36%，且該菌株經(jīng)連續(xù)5次傳代試驗(yàn)，產(chǎn)素能力無明顯變化。王衛(wèi)等[21]和廖海兵等[22]分別采用特比萘芬抗性和制霉菌素篩選法初篩出抗性高產(chǎn)菌株。2010年，王衛(wèi)等[28]以脂肪酶活性為初篩指標(biāo)，從添加3%豆油的培養(yǎng)基中篩選出菌株GL-2，其產(chǎn)赤霉素能力比菌株978# 在全淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)素能力提高了1.2倍，經(jīng)10次連續(xù)傳代，赤霉素產(chǎn)量穩(wěn)定。

2 赤霉素固態(tài)發(fā)酵

固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation，縮寫SSF)歷史悠久，古代的中國杜康酒、日本清酒、印度豆豉以及西方奶酪的制作均采用固態(tài)發(fā)酵。20世紀(jì)80年代起，國內(nèi)外對赤霉素固態(tài)發(fā)酵(圖1)進(jìn)行了大量研究，主要包括：(1)固態(tài)發(fā)酵法與液體發(fā)酵法的對比；(2)不同培養(yǎng)基成分、營養(yǎng)因素、培養(yǎng)條件對GA3產(chǎn)量的影響；(3)菌體生長模型的研究及固態(tài)發(fā)酵設(shè)備創(chuàng)新和優(yōu)化等。Bandelier等[29]研發(fā)了一種實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵無菌反應(yīng)器，每千克培養(yǎng)基可產(chǎn)生3.0 kg GA3，比液態(tài)培養(yǎng)基的產(chǎn)物產(chǎn)量高出6.7倍。目前，有報道稱印度GA3的生產(chǎn)大多采用的是基于大型碟狀發(fā)酵罐的深層固態(tài)發(fā)酵法，但存在操作困難，且溶氧和濕度難以控制等問題[11]，而我國大規(guī)模GA3生產(chǎn)仍采用深層液體發(fā)酵法，短期內(nèi)固態(tài)發(fā)酵代替深層液體發(fā)酵的可能性不大，但其發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

圖1 GA3固態(tài)發(fā)酵流程

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基

培養(yǎng)基優(yōu)化是赤霉素固態(tài)發(fā)酵的研究熱點(diǎn)。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基有2種類型：一種是以農(nóng)作物、農(nóng)副產(chǎn)業(yè)殘渣等天然材料作培養(yǎng)基底物；另一種是采用惰性介質(zhì)作為底物浸入營養(yǎng)液中[30]，前者使用較為廣泛，后者主要用于實(shí)驗(yàn)室單因素研究及發(fā)酵動力學(xué)研究。Gelmi等[31]使用離子交換樹脂作為赤霉菌的惰性載體進(jìn)行赤霉素固態(tài)發(fā)酵，同時研究了發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的吸收情況。赤霉素固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基種類十分廣泛(表4)。這些天然材料往往是由纖維素、木質(zhì)素、淀粉等構(gòu)成的大分子結(jié)構(gòu)，其作為固體底物不僅提供微生物所需營養(yǎng),還起到維持培養(yǎng)基固體形態(tài)、固定菌體、吸附營養(yǎng)的作用。使用前要進(jìn)行干燥、研磨、篩濾、脫毒等預(yù)處理，以減少其自身理化因素的影響，提高發(fā)酵利用率。Kumar等[32]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)碳源含量相當(dāng)時，用玉米粉、小麥粉和水稻麩作為發(fā)酵基質(zhì)，GA3的產(chǎn)量比液體深層發(fā)酵高1.6倍，再進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，所得最高GA3產(chǎn)量比優(yōu)化前提高2.9倍。大量文獻(xiàn)證實(shí)，以農(nóng)作物或農(nóng)副產(chǎn)品、食品工業(yè)殘渣進(jìn)行固體發(fā)酵，菌株生長良好，赤霉素產(chǎn)量提高，能耗小，其經(jīng)濟(jì)性明顯優(yōu)于液態(tài)發(fā)酵技術(shù)。

表4 赤霉素固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基類型

注：DMB.固態(tài)分批補(bǔ)料發(fā)酵物。

國內(nèi)外研究者對赤霉素固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化進(jìn)行了大量研究，包括碳源、氮源種類及配比，無機(jī)鹽種類及濃度，維生素、氨基酸、微量元素等，這些因素對赤霉素發(fā)酵效價的影響已基本清楚。研究表明：當(dāng)培養(yǎng)基的初始葡萄糖含量高于20%時會抑制赤霉素的合成；赤霉菌在對數(shù)生長階段大量消耗碳源、氮源、磷酸鹽，只有當(dāng)培養(yǎng)基中氮源被耗盡時赤霉素才開始合成；在一定范圍內(nèi)，赤霉素產(chǎn)量隨著氮源濃度的增加而提高，但當(dāng)達(dá)到最佳值后，產(chǎn)量隨氮源濃度升高而急劇減少[4,16,40]。固態(tài)培養(yǎng)基中的底物既是碳源也是氮源，其天然成分也能提供某些無機(jī)鹽和微量元素[5,40]，一般情況下，不需要額外添加微量元素，無機(jī)鹽添加情況有所不同。Machado等[8]在咖啡豆莢培養(yǎng)基中添加FeSO4和(NH4)2SO4，赤霉素固態(tài)發(fā)酵效價高于添加KH2PO4和MgSO4，可能是由于咖啡豆莢本身含有這些礦物鹽，再次添加導(dǎo)致濃度過高而產(chǎn)生抑制作用。儲修云等[41]研究表明，微量元素添加劑能使赤霉素含量提高約20%。

在發(fā)酵過程中間歇地加入某些培養(yǎng)基成分，稱為分批補(bǔ)料發(fā)酵(fed-batch fermentation)或半分批培養(yǎng)(semi-batch culture)。分批補(bǔ)料能夠自發(fā)地控制加入營養(yǎng)物的濃度和速率，從而克服底物抑制、代謝產(chǎn)物反饋抑制、細(xì)胞高聚集作用和糖效應(yīng)，而達(dá)到延長生產(chǎn)期、提高產(chǎn)量的目的[42]。印度人用濕麥麩發(fā)酵GA3時間歇補(bǔ)料，GA3生產(chǎn)期延長，產(chǎn)量提高了18.2%，優(yōu)于固態(tài)分批培養(yǎng)[43]。江瀾等[44]發(fā)現(xiàn)，相同條件下，固態(tài)分批補(bǔ)料發(fā)酵赤霉素產(chǎn)量為液態(tài)發(fā)酵的3～4.7倍。目前，固態(tài)分批補(bǔ)料發(fā)酵已成功用于GA3的生產(chǎn)。

2.2 發(fā)酵條件

微生物發(fā)酵的理化條件已經(jīng)確定，但由于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的非流動特性使得固態(tài)發(fā)酵條件與液體發(fā)酵有所不同。固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)的傳熱傳質(zhì)過程十分復(fù)雜，涉及氣固、液固、氣液間的傳遞，傳統(tǒng)液體發(fā)酵的檢測手段和控制手段難以應(yīng)用，這也是其無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用的最主要原因。除了溫度、pH值、通氣量、水活性、接種類型、接種量以外，固態(tài)培養(yǎng)基顆粒大小、初始含水率、高壓滅菌時間等對固態(tài)發(fā)酵影響巨大[33]。

2.2.1 初始含水率 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中無游離水存在，因此配制培養(yǎng)基時的初始含水率對微生物生長代謝有重要影響。通常固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)含水率應(yīng)高于12%[30]，水分過低菌體生長停止、營養(yǎng)物不易擴(kuò)散、酶穩(wěn)定性降低且基質(zhì)膨脹；水分過高則導(dǎo)致顆粒結(jié)塊、通氣不暢和染菌。赤霉素固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水率通常在50%～80%。Kumar等[33]研究認(rèn)為，赤霉素固態(tài)發(fā)酵初始含水率在50%時GA3固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量最高。Satpute等[35]用層生鐮刀菌NCIM1105在木豆莢上發(fā)酵赤霉素，當(dāng)初始含水率由55%增長到70%時，GA3產(chǎn)量迅速增大。Rodrigues等[34]則選擇75%～80%的初始含水率。

2.2.2 基底顆粒度 固體顆粒間的空隙為菌體提供生長環(huán)境，同時吸附營養(yǎng)物質(zhì)供菌體生長，空氣通過空隙流動向菌體供氧，因此固體顆粒的大小對發(fā)酵效果影響很大。固體顆粒比表面積越大，越利于菌體附著和營養(yǎng)物積累，由此要使粒度減??；但粒度過小必然造成空隙率降低，影響培養(yǎng)基通氣效果，阻礙傳熱傳質(zhì)。Satpute等[35]采用(1/4～1/8)″、(1/8～1/14)″、(1/14～1/24)″(1″=2.54 cm)不同顆粒大小的木豆莢培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)(1/8～1/14)″是最優(yōu)尺寸，這與Kumar等[45]的試驗(yàn)結(jié)果相符。近年來，赤霉素固態(tài)發(fā)酵研究中使用的培養(yǎng)基顆粒尺寸多為0.8～2 mm。

2.2.3 通氣 赤霉菌的生長與赤霉素的合成都需要消耗氧氣，因此固態(tài)發(fā)酵過程中必須保證培養(yǎng)基通氣良好。但研究表明，通氣過量也會導(dǎo)致菌體生長過快以及赤霉素合成停止，而另一種代謝產(chǎn)物脂肪酸積累[46]。赤霉素固態(tài)發(fā)酵常采用靜態(tài)淺盤發(fā)酵罐和柱形發(fā)酵罐，并在培養(yǎng)基中打眼，以增大通氣量。一般不采用攪拌來增加溶氧量，除非發(fā)酵基質(zhì)和菌體能夠承受葉片攪拌產(chǎn)生的剪切力作用[47]。

2.2.4 滅菌時間 由于固態(tài)培養(yǎng)基中的天然材料以及潮濕環(huán)境易使雜菌滋生，因此接種前的滅菌工作對赤霉素發(fā)酵過程至關(guān)重要。滅菌操作在一定程度上對培養(yǎng)基有改性作用，從而影響GA3的產(chǎn)量。Kumar等[33]研究了滅菌溫度為121 ℃、滅菌時長在15～75 min的GA3產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)時長為45 min時，GA3最終產(chǎn)量略微升高。之后的研究中大多采用這一滅菌條件。

2.2.5 溫度和pH值 赤霉素固態(tài)發(fā)酵中的溫度和pH值難以測量和調(diào)控，這是其規(guī)?；瘧?yīng)用的一大難題。目前，GA3固態(tài)發(fā)酵研究中常采用的溫度是25～30 ℃，初始pH值為3.5～5.8。固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵是要及時移除發(fā)酵熱，以保證發(fā)酵過程中溫度的穩(wěn)定性，同時要解決代謝產(chǎn)生局部pH值過高的問題。對固態(tài)發(fā)酵過程中的溫度、pH值調(diào)控還需依賴研發(fā)新型固態(tài)發(fā)酵設(shè)備，從而解決傳熱傳質(zhì)不均的問題。

3 小結(jié)與展望

選育穩(wěn)定高產(chǎn)的赤霉素菌株并采用固態(tài)發(fā)酵，是解決目前赤霉素液體發(fā)酵生產(chǎn)成本較高的有效手段。利用先進(jìn)基因工程技術(shù)獲得新型高產(chǎn)赤霉菌株，將為降低生產(chǎn)成本帶來新的可能。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)用于赤霉素生產(chǎn)具有許多優(yōu)勢：(1)所得發(fā)酵產(chǎn)物赤霉素濃度高，為分離濃縮帶來便利；(2)發(fā)酵過程以及下游操作能耗低；(3)發(fā)酵過程是在發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)進(jìn)行，不會產(chǎn)生高濃度的碳源和氮源抑制，同時高濃度的發(fā)酵產(chǎn)物不會對發(fā)酵過程產(chǎn)生遏制；(4)固態(tài)發(fā)酵操作簡單，設(shè)備體積小。結(jié)合固態(tài)發(fā)酵技術(shù)在食品工業(yè)、制酶工業(yè)中應(yīng)用成功的經(jīng)驗(yàn)，固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)赤霉素極有可能為赤霉素工業(yè)帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益。但赤霉素固態(tài)發(fā)酵存在諸多瓶頸問題：重要理化參數(shù)難以控制、無菌條件難以維持、難以實(shí)現(xiàn)傳熱傳質(zhì)均勻化。目前來看，其短期內(nèi)代替深層液體發(fā)酵的可能性不大。研發(fā)新型固態(tài)發(fā)酵設(shè)備，提高檢測手段靈敏度是解決這一問題的關(guān)鍵。

[1] 熊國勝，李家洋，王永紅.植物激素調(diào)控研究進(jìn)展[J].科學(xué)通報，2009，54(18)：2718-2733.

[2] B?mke C,Tudzynski B.Diversity，regulation，and evolution of the gibberellin biosynthetic pathway in fungi compared to plants and bacteria[J].Phytochemistry，2009，70：1876-1893.

[3] Rodrigues C，Vandenberghe L P S，de Oliverira J，etal.New perspectives of gibberellic acid production：A review[J].Critical Reviews in Biotechnology，2012，32(3)：263-273.

[4] Brückner B，Blechschmidt D.The gibberellin fermentation[J].Critical Reviews in Biotechnology，1991，11：163-192.

[5] Kumar P K R，Lonsane B K.Microbial production of gibberellins：State of the art[J].Adv Appl Microbiol，1989，28：124-129.

[6] 王貞,孫治強(qiáng),任子君.復(fù)合型植物生長調(diào)節(jié)劑對番茄果實(shí)生長及品質(zhì)的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,42(2):176-179.

[7] 周純，林盛華，李武興，等.CPPU、GA4+7+BA對蘋果果實(shí)發(fā)育及生理效應(yīng)的調(diào)節(jié)[J].山西果樹，2004(2)：11-12.

[8] Machado C M M，Soccol C R，de Oliveira B H,etal.Gibberellic acid production by solid state fermentation in coffee husk[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2002，102：179-191.

[9] 潘鑫復(fù)，趙河.赤霉素合成的研究進(jìn)展[J].有機(jī)化學(xué)，1990(2)：97-105.

[10] 李艷.發(fā)酵工程原理及技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2010:5-8.

[11] 莊木坤.赤霉素高產(chǎn)菌株改造與發(fā)酵研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007：1-54.

[12] 上?！熬哦?”菌種選育協(xié)作組.微生物學(xué)術(shù)育種討論會文集[C].上海：科學(xué)出版社，1975：11-17.

[13] Bottini R，Cassán F，Piccoli P.Gibberellin production by bacteria and its involvement in plant growth promotion and yield increase[J].Appl Microbiol Biotechnol，2004，65：497-503.

[14] 俞大紱，李季倫，羅國光，等.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)的赤霉素研究工作(簡報)[J].植物生理學(xué)通訊，1964，3(3)：53-54,29.

[15] Bearder J R，Mac Millan J，Wels M，etal.Position of the block for gibberellin biosynthesis in mutant B1-41a ofGibberellafujikuroi[J].Phytochemistry，1974，13：911-917.

[16] Candau R，Avalos J，Cerdá-Olmedo E.Gibberellins and carotenoids in the wild type and mutants ofGibberellafujikuroi[J].Applied and Environmental Microbiology，1991，57：3378-3382.

[17] 趙炎生，錢海倫，肖燦鵬，等.赤霉素產(chǎn)生菌的激光誘變育種研究[J].激光生物學(xué)報，1997，6(4)：1198-1201.

[18] 張文宣，趙南，張金兒，等.赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體理化誘變-定向篩選模型的建立與應(yīng)用[J].化學(xué)與生物工程，2012，29(1)：66-69.

[19] 錢海倫，肖燦鵬，張瑞坤.赤霉素產(chǎn)生菌的誘變育種[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，1991，22(4)：218-220.

[20] 趙炎生，肖燦鵬，蘇寶亮.赤霉素產(chǎn)生菌的激光、化學(xué)復(fù)合誘變育種研究[J].激光生物學(xué)報，1997，6(4)：1202-1208.

[21] 王衛(wèi)，黎繼烈，黃衛(wèi)文，等.利用特比萘芬抗性篩選赤霉素高產(chǎn)菌株及相關(guān)發(fā)酵特性的研究[J].微生物學(xué)通報，2014，41(9)：1837-1842.

[22] 廖海兵，雷文，徐永華.利用制霉菌素抗性篩選赤霉素高產(chǎn)菌株[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2015(2)：1.

[23] 余卿，覃紅，汪育同，等.赤霉素產(chǎn)生菌～#85104菌株原生質(zhì)體的形成再生和紫外光對原生質(zhì)體誘變條件的研究[J].微生物學(xué)雜志，1987，7(2)：1-5.

[24] 李武軍，鄭幼霞，王洪洲，等.赤霉素產(chǎn)生菌藤倉赤霉原生質(zhì)體的形成和再生[J].真菌學(xué)報，1992，11(3)：221-228 .

[25] 李武軍，鄭幼霞.赤霉素產(chǎn)生菌——藤倉赤霉菌融合重組的研究[J].微生物學(xué)報，1995，35(4)：271-274.

[26] 朱江萍，張文宣，張金兒，等.應(yīng)用60Co輻射誘變選育赤霉酸GA3高產(chǎn)菌株的研究[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2012，11(1)：33-35，42.

[27] 張金兒，朱江萍，劉義雄，等.從氯霉素抗性突變株篩選赤霉素高產(chǎn)菌株[J].中國抗生素雜志，2005，30(5)：301-303.

[28] 王衛(wèi)，李忠海，黎繼烈，等.以脂肪酶為指標(biāo)篩選赤霉素高產(chǎn)菌株的研究[J].工業(yè)微生物，2011,41(1)：51-55.

[29] Bandelier S，Renaud R，Durand A.Production of gibberellic acid by fed batch solid state fermentation in an aseptic pilot scale reactor[J].Proc Biochem，1997，32：141-145.

[30] Krishna C.Solid-state fermentation systems—An overview[J].Critical Reviews in Biotechnology，2005，25：1-30.

[31] Gelmi C，Pérez-Correa R，González M，etal.Solid substrate cultivation ofGibberellafujikuroion an inert support[J].Process Biochemistry，2000，35：1227-1233.

[32] Kumar P K R，Lonsane B K.Gibberelic acid by solid-state fermentation：Consistent and improved yields[J].Biotechnol Bioeng，1987，30：267-271.

[33] Kumar P K R，Lonsane B K.Solid state fermentation： Physical and nutritional factors influencing gibberellic acid production[J].Appl Microbiol Biotechnol，1990，34：145-148.

[34] Rodrigues C，Souza Vandenberghe L P，Teodoro J，etal.A new alternative to produce gibberellic acid by solid state fermentation[J].Braz Arch Biol Technol，2009，52：181-188.

[35] Satpute D，Sharma V，Murarkar K.Solid-state fermentation for production of gibberellic acid using agricultural residues[J].International Journal of Environment and Pollution，2010，43：201-213.

[36] Pastrana L M，González M P，Torrado A，etal.A fed-batch culture model for improved production of gibberellic acid from a waste medium[J].Biotechnology Letters，1995，17：263-268.

[37] 楊加華，肖志壯.赤霉素固體發(fā)酵營養(yǎng)模型[J].煙臺大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與工程版)，1994(4)：26-28.

[38] 江瀾，馮有勝.赤霉素的固態(tài)分批補(bǔ)料培養(yǎng)技術(shù)及其分離提取工藝研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2001，26(3)：323-328.

[39] 李明森，韓延雷，趙祥穎，等.菌株GLV-85產(chǎn)赤霉素固體發(fā)酵條件的研究[J].山東食品發(fā)酵，2012(1)：3-8.

[40] Borrow A，Brown S，Jefferys E G，etal.The kinetics of metabolism ofGibberellafujikuroiin stirred culture[J].Canadian Journal of Microbiology，1964，10：407-444.

[41] 儲修云，印天壽，唐玉華．微量元素添加劑促進(jìn)赤霉素分泌及赤霉素速測技術(shù)研究[J].廣東微量元素科學(xué)，1995，2(6)：1-7.

[42] Minihane B J.Fed-batch fermentations[J].Biotech Adv，1986，4：207.

[43] Kumar P K R，Lonsane B K.Immobilized growing cells ofGibberellafujikuroiP3 for production of gibberellic acid and pigment in batch and semi continuous culture[J].Appl Microbiol Biotechnol，1988，28：537-542.

[44] 江瀾，馮有勝，邱昭惠.赤霉素的固態(tài)分批補(bǔ)料發(fā)酵與傳統(tǒng)的液態(tài)發(fā)酵比較試驗(yàn)[J].渝州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1999，16(2)：69-72.

[45] Kumar P K R，Lonsane B K.Extraction of gibberellic acid from dry mouldy bran produced under solid-state fermentation[J].Process Biochemisty，1987，10：138-143.

[46] Vass R C，Jefferys E G.Gibberellinc acid，in-economic microbiology：Secondary products of metabolism[M].London:Academic Press，1979：421-433.

[47] Krishna C，Pandey A，Mohandas A.Microbial phytases[M]//Concise encyclopedia on bioresource technology.USA：Haworth Press，2004:569-576.

Research Progress in Selection of High-yielding Strains and Solid-state Fermentation for Gibberellins Production

WU Wenzhu,CHEN Junying*,BAI Jing*,CHANG Chun

(School of Chemical Engineering and Energy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)

Submerged fermentation is a main method for gibberellins production in modern large-scale industry,which has some shortages of costs,energy consumption and environmental pollution as well.Screening high-yielding strains for gibberellins production has been an essential method for yield improvement and costs reduction.Moreover,solid-state fermentation technology that regained focuses in past 30 years due to its unique advantages has been widely used in fermentation field,and great progress has been made in gibberellins production by solid state fermentation.The paper reviews screening work for gibberellins high-yielding strains in history,including mutation methods of simplex mutation,complex mutation and protoplast mutation,as well as screening principles,summarizes the culture media and culture conditions in solid-state fermentation of gibberellins,and forecasts the potentiality of gibberellins production by solid state fermentation.

gibberellins； strains screening； mutation; solid-state fermentation; culture medium; culture conditions

2015-11-30

鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目(141PPTGG409)

武文竹(1992-)，女，河南洛陽人，在讀碩士研究生，研究方向：生物化工過程及設(shè)備。 E-mail:997530923@qq.com

*通訊作者：陳俊英(1972-)，女，河南開封人，副教授，博士，主要從事生化設(shè)備強(qiáng)化及生物質(zhì)資源化利用的研究。 E-mail:chenjy@zzu.edu.cn 白 凈(1975-)，男，河南駐馬店人，副教授，博士，主要從事生物質(zhì)能源工藝研究。E-mail:baijing@zzu.edu.cn

S482.8;TQ920.6

A

1004-3268(2016)07-0001-06