草莓炭疽病菌鑒定技術(shù)規(guī)程

張麗勍 段 可 袁聯(lián)國(guó) 姚全林 姚麗英 倪秀紅 高清華*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海市設(shè)施園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 201403；2上海市奉賢區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 201400；3上海金瓶蔬果專業(yè)合作社，青浦區(qū) 201711；4上海市金山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 201500；5上海市浦東新區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 201201）

草莓炭疽病菌鑒定技術(shù)規(guī)程

張麗勍1段 可1袁聯(lián)國(guó)2姚全林3姚麗英4倪秀紅5高清華1*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海市設(shè)施園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 201403；2上海市奉賢區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 201400；3上海金瓶蔬果專業(yè)合作社，青浦區(qū) 201711；4上海市金山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 201500；5上海市浦東新區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 201201）

草莓是上海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，但草莓炭疽病嚴(yán)重阻礙了當(dāng)?shù)夭葺a(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展?，F(xiàn)根據(jù)草莓炭疽病菌的生物學(xué)特性，結(jié)合序列分析，依據(jù)國(guó)家和行業(yè)的有關(guān)安全生態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)草莓炭疽病病害的癥狀、鑒定技術(shù)作了規(guī)定，制定了草莓炭疽病菌鑒定技術(shù)規(guī)程，以供參考。

草莓；炭疽病菌；鑒定；技術(shù)規(guī)程

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)屬薔薇科草莓屬，多年生草本植物。作為目前上海地區(qū)園藝作物中的特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，種植草莓的經(jīng)濟(jì)效益十分顯著，上海市郊草莓種植面積常年維持在2 666.67 hm2左右，產(chǎn)值超過6億元。

在我國(guó)，草莓炭疽病危害嚴(yán)重的年份會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)50%-80%，甚至絕產(chǎn)。因此，草莓炭疽病已成為草莓產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的瓶頸。同時(shí)，種植戶對(duì)草莓炭疽病菌的生活史及危害特點(diǎn)缺乏科學(xué)辨識(shí)，在其防治中存在許多誤區(qū)，濫用和亂用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致果品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，不僅影響了草莓果品的質(zhì)量，也加劇了對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞。為解決食品安全和環(huán)境保護(hù)問題，促進(jìn)上海市草莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，筆者根據(jù)草莓炭疽病菌的生物學(xué)特性，結(jié)合序列分析，依據(jù)國(guó)家和行業(yè)的有關(guān)安全生態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)草莓炭疽病病害的癥狀、鑒定技術(shù)作了規(guī)定，制定了草莓炭疽病菌鑒定技術(shù)規(guī)范，該規(guī)范適用于上海地區(qū)草莓炭疽病菌的鑒定。

1 草莓炭疸病菌的檢測(cè)鑒定

草莓炭疽病是由半知菌類黑盤孢目黑盤孢科刺盤孢菌屬（Colletotrichum spp.）真菌引起的病害，主要包括3種病原菌：草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。束狀炭疽菌（C. dematium）偶爾也會(huì)引起果腐，但在草莓上較為少見。危害癥狀、菌落的形態(tài)特征、致病力是檢測(cè)鑒定該病菌的依據(jù)。

1.1 取 樣

草莓炭疽病菌能侵染草莓的多個(gè)部位，各部位的癥狀特點(diǎn)如下：（1）葉柄和匍匐莖上的病斑。在匍匐莖和葉柄上的病斑起初小，有紅色條紋，之后迅速擴(kuò)展為深色、凹陷和硬的病斑。葉柄上的病斑逐漸擴(kuò)大，環(huán)繞葉柄后可引起葉片萎蔫死亡。葉柄上的病斑也可擴(kuò)展到根頸，導(dǎo)致根頸腐爛。（2）根頸腐爛。最初癥狀是病株在水分脅迫期間（如夏季）的午后表現(xiàn)萎蔫。將萎蔫植株的根頸部縱切開，可見紅褐色、硬的腐爛，或紅褐色的條紋。根頸病斑通常在近葉柄基部的一側(cè)開始產(chǎn)生，然后以水平的“V”字形擴(kuò)展至根莖。（3）芽腐。在植株移栽到產(chǎn)果田的幾天內(nèi)或在定植和形成多個(gè)根莖后的幾周內(nèi)，尖孢炭疽菌會(huì)引起植株的芽腐。有多個(gè)根莖的植株，只在一個(gè)芽上腐爛，然后這個(gè)芽死亡，而其余根莖繼續(xù)生長(zhǎng)，或腐爛發(fā)展后引起整株萎蔫和死亡。（4）果腐。在將要成熟的果實(shí)上，形成淡褐色、水漬狀的斑點(diǎn)，并迅速發(fā)展為硬的圓形病斑，病斑通常變成暗褐色至黑色，但也有的保持棕褐色。（5）花枯。被侵染的花朵迅速死亡、干枯，產(chǎn)生黑色病斑，延伸至花梗下面距花萼幾毫米處。開花期間如果溫暖潮濕，整個(gè)花序都可能死亡，植株呈枯萎狀。（6）葉斑。草莓葉部有兩種炭疽?。阂环N是炭疽葉斑病，也叫黑斑病，由草莓炭疽菌和膠孢炭疽菌引起；另一種是不規(guī)則葉斑病，由尖孢炭疽菌引起。炭疽葉斑病的病斑呈圓形，直徑0. 5-1.5 mm不等，偶爾有3mm的病斑，通常呈黑色，有時(shí)為淺色，常類似于墨水漬。不規(guī)則葉斑病的病斑呈深褐色，近于黑色，葉尖及葉緣干枯，病斑通常在近葉尖處的邊緣開始形成，沿葉緣擴(kuò)展為3-18 mm，沿中脈。病原菌的不同小種，會(huì)導(dǎo)致不完全相同的癥狀。按照草莓炭疽病在田間的典型表征進(jìn)行取樣。受侵染植株各部位的癥狀（見圖1）。

1.2 病菌分離

圖1 草莓炭疽病危害癥狀

從病健交界處切取小塊組織：葉片剪成5 mm×5 mm左右的小塊，葉柄和匍匐莖切成長(zhǎng)0.5 cm左右的小段，根部剖開后取開始褐變的組織切成0.5 cm的小段作分離材料。

分離技術(shù)：材料先用75%酒精漂洗10s，緊接著用3%-5%次氯酸鈉水溶液消毒2-5 min（葉片消毒1-2 min，葉柄和匍匐莖的滅菌時(shí)間稍長(zhǎng)），再用無菌水漂洗3-4次，每次l min，然后置于PDA（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g）培養(yǎng)基上、25 ℃下培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后結(jié)合顯微觀察形態(tài)進(jìn)行單孢分離。

1.3 病菌鑒定（分子生物學(xué)方法）

鑒定方法：純化菌株經(jīng)25 ℃培養(yǎng)5-7 d后，制備模板DNA，擴(kuò)增ITS序列（見表1），用無菌雙蒸水代替模板做空白對(duì)照，擴(kuò)增目的片段大小約為600 bp。PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知菌株序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。若與已知的炭疽病菌序列一致性達(dá)90%以上，則判定檢測(cè)結(jié)果為陽性；反之若與已知的炭疽病菌序列不一致，則判定檢測(cè)結(jié)果為陰性。觀察發(fā)病情況，再對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行病菌分離培養(yǎng)和鑒定。

表1 ITS序列引物

2 草莓炭疽病菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)

2.1 炭疽病菌營(yíng)養(yǎng)體及繁殖器官的形態(tài)確定和顯微觀察

2.1.1 膠孢炭疽菌

在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈灰白色、橄欖色、黑灰色至黑色，在同心輪紋上通常可見橙色的分生孢子團(tuán)，氣生菌絲均勻，氈狀或絮狀。背面不均勻灰色，或隨菌齡變黑。在培養(yǎng)基上不產(chǎn)生任何紅色素，有的有剛毛，大部分有子囊殼形成，在粉紅色的孢子堆中有分生孢子形成。分生孢子呈橢圓形，兩端鈍圓。單孢大小為14.5-18.6 (16.6) × 5.4-7.0 (6.2) μm（見圖2E）。

圖 2 草莓炭疽病病菌的形態(tài)特征

DNA提取方法：將0.5 g研磨好的菌絲樣品加入10 mL尿素提取液(7 mol/L Urea、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、62.5 mmol/L NaCl、1%SDS)，搖勻；在12 000 r/ min條件下離心5 min，吸取上清液，上清液在12 000 r/ min條件下再次離心5 min；將上清液移入另一新管中，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇 (25∶24∶1)溶液，用力振蕩數(shù)次混勻，在12 000 r/min條件下離心5 min；取上清到一新管中，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3 mol/L NaAc (pH 5.2)，于-20 ℃放置20 min，在12 000 r/min條件下離心5 min；棄上清液，倒置使管壁液體流盡，用70%無水乙醇洗沉淀，室溫放置干燥 5-10 min，溶于 200μL雙蒸水中，加入 RNase A (10μg/μL) 2μL，37 ℃水浴30 min，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系：無菌雙蒸水16.7μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 1μL，Mg2+(25 mmol/L) 1.5μL，引物ITS1（10 pmol/L）1μL，ITS4（10 pmol/L）1μL，DNA模板（50 mg/L）1μL，rTaq（5 U/μl）0.3μL。1.4 病原菌致病力測(cè)定

將分離、純化得到的病原菌菌株置于酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)液（酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g）中，于25 ℃、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)2-3 d，產(chǎn)生大量小型分生孢子。離心去除培養(yǎng)液并用無菌水沖洗，然后配制成濃度約為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液。

供試草莓品種為“久香”（上海市農(nóng)科院2007年育成品種），采用噴霧法，將孢子懸浮液噴灑至植株上，采用保濕膜保濕24 h。每個(gè)菌株接種健壯草莓苗50株。接種7-15 d后

2.1.2 草莓炭疽菌

在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈白色至灰白色，無子囊殼形成。分生孢子為倒卵形或一端略尖，無色、單孢。單孢大小為14.1-20.0 (16.9) ×5.3-6.5 (5.9) μm（見圖2C）。

2.1.3 尖孢炭疽菌

在PDA培養(yǎng)基上，菌落初期呈白色至乳白色或淺粉紅色，后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，變?yōu)榛疑秃诨疑?。菌落背面初期為粉色或畦肉色，后期變?yōu)楹谏?。未發(fā)現(xiàn)有剛毛和有性態(tài)的產(chǎn)生。25℃下培養(yǎng)，尖孢炭疽菌生長(zhǎng)速度很慢，而膠孢炭疽菌和草莓炭疽菌的生長(zhǎng)則快得多。分生孢子直，梭形，兩端尖，有時(shí)中部輕微縊縮。單孢大小為13.2-5.1(15.1)× 4.8-6.3 (5.5) μm（見圖2D）。

2.2 致病性測(cè)定

若測(cè)定結(jié)果可導(dǎo)致“久香”草莓葉片形成局部病斑，莖上形成黑色、紡錘形或橢圓形、潰瘍狀病斑，稍凹陷，甚至全株萎蔫枯死，且從發(fā)病植株上進(jìn)行病菌再分離培養(yǎng)，可得到與原接種菌相同培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征的病原菌，則可判定該病菌為草莓炭疽病菌。

3 結(jié)果判定

如果癥狀和分離物的各形態(tài)特征與描述的癥狀和病原菌形態(tài)相吻合，且序列比對(duì)一致，則可判定為草莓炭疽病菌。

2015-07-18

*為通訊作者。