“嘉定白蒜”分生組織培養(yǎng)脫病毒及優(yōu)種繁育體系的建立

沈若剛 （上?；莺头N業(yè)有限公司“嘉定白蒜”項(xiàng)目課題組 201899）

劉 衛(wèi) （上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 200240）

“嘉定白蒜”分生組織培養(yǎng)脫病毒及優(yōu)種繁育體系的建立

沈若剛 （上海惠和種業(yè)有限公司“嘉定白蒜”項(xiàng)目課題組 201899）

劉 衛(wèi) （上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 200240）

為確保大蒜高質(zhì)量生長(zhǎng)，培育優(yōu)良的大蒜脫毒苗，以“嘉定2號(hào)”白蒜為供試材料，選擇不同處理的莖尖為材料，將其接種到不同激素配比的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，利用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了大蒜脫毒苗快速繁殖的相關(guān)研究。結(jié)果表明，以帶有1片葉原基、大小為0.2-0.6 mm的莖尖外植體較為適宜，以MS+6-BA 0.5 mg/ L+IAA 0.2 mg/L配比組成的培養(yǎng)基對(duì)大蒜脫毒苗成苗效果為最好，同時(shí)NAA濃度為0.8 mg/L時(shí)，生根率達(dá)到最高，為71%，當(dāng)其濃度增至1.0 mg/L時(shí)，生根率開(kāi)始下降。經(jīng)病毒檢測(cè)，大蒜脫毒苗的脫毒率為85%。

“嘉定2號(hào)”白蒜；脫毒苗；莖尖培養(yǎng)

大蒜(Allium sativum L.)又叫蒜頭、大蒜頭、胡蒜、葫、獨(dú)蒜、獨(dú)頭蒜，是蒜類(lèi)植物的統(tǒng)稱(chēng)，屬于百合科蔥屬半年生草本植物。大蒜是秦漢時(shí)從西域傳入中國(guó)的，經(jīng)人工栽培繁育而成，它既能作為調(diào)味品，又是預(yù)防和治療多種疾病的良藥，還具有抗癌功效，深受大眾喜食。世界上大蒜的栽培總面積為80 萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量為762萬(wàn)t，單產(chǎn)約為9.5 t/hm2，最高單產(chǎn)達(dá)40.6 t/hm2[1]。近年來(lái)，我國(guó)大蒜的種植面積在逐步增加、產(chǎn)量在逐步提高、市場(chǎng)規(guī)模也在逐步擴(kuò)大，許多地區(qū)已把大蒜作為主要經(jīng)濟(jì)作物進(jìn)行栽培。

在我國(guó)，大蒜的主要繁殖方式為利用鱗莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，但鱗莖是大蒜的產(chǎn)品器官，在大蒜無(wú)性繁殖過(guò)程中，易感染和積累多種病毒，而病毒極易通過(guò)種蒜進(jìn)行傳播，降低了大蒜的品質(zhì)和產(chǎn)量，給生產(chǎn)者造成了嚴(yán)重的損失[2]。研究表明，利用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)快速培育大蒜脫毒苗，不僅可解決病毒傳染的問(wèn)題、提純復(fù)壯，而且還可以解決因連年種植大蒜而造成的種性退化等問(wèn)題[3]。此外，還要建立一個(gè)更加適合大蒜生長(zhǎng)繁育的體系，以保證大蒜的高質(zhì)量生長(zhǎng)，從而培育更加優(yōu)良的大蒜脫毒苗?，F(xiàn)以“嘉定2號(hào)”白蒜為供試材料，選擇不同處理的莖尖為材料，將其接種到不同激素配比的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，利用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了大蒜脫毒苗快速繁殖的相關(guān)研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為“嘉定2號(hào)”白蒜，由上?；莺头N業(yè)有限公司提供，該品種為上海嘉定大蒜的主栽品種之一。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試材料的選取與消毒

供試大蒜鱗莖先在8 ℃低溫下貯藏30 d，以打破休眠，然后在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)ニ馄ぃ?5%乙醇消毒10 min，再用無(wú)菌水沖洗2-3次，在無(wú)菌條件下切取0.2-0.9 mm分別帶有1片葉原基、2-3片葉原基和不帶葉原基的3種莖尖為外植體接種到不同培養(yǎng)基上。

1.2.2 基本培養(yǎng)基試驗(yàn)

將外植體接種到分別附加BA 0.1 mg/L 和IBA 0.1 mg/L 的MS、B5、WPM和N6 四種不同類(lèi)型的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 d后觀察成苗情況。

1.2.3 增殖培養(yǎng)基的篩選

在篩選出的最佳培養(yǎng)基上，附加8種不同濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素：（1）MS+BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L，（2）MS+BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L，（3）MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，（4）MS+BA 1.0 mg/ L+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L，（5）MS+BA 1.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，（6）MS+BA 1.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，（7）MS+BA 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L，（8）MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L。接種后3-4周，對(duì)各增殖培養(yǎng)基上分化出的試管叢生苗莖尖和成芽數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的篩選

將組培苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，添加濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ L的NAA，2-3周后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.5 試管苗移栽

移栽前將大蒜脫毒苗置于自然光照下，打開(kāi)瓶蓋煉苗3 d，或直接注入自來(lái)水，使其根部充分吸水，用鑷子將苗從試管中輕輕取出，洗凈培養(yǎng)基，移栽到已消毒的混合基質(zhì)中，混合基質(zhì)中泥碳土∶蛭石∶腐熟肥為1∶1∶1。移栽后澆足水分，移栽初期不宜澆灌營(yíng)養(yǎng)液，以防止高離子濃度造成植株的生理干旱。用塑料薄膜保濕7 d，成苗率達(dá)80%以上，30 d后移至無(wú)大蒜栽培地（隔離區(qū)）種植。

1.2.6 病毒檢測(cè)

將剝離的大蒜莖尖置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個(gè)月，長(zhǎng)成球形胚狀體或愈傷組織塊，將此材料搗碎、研磨，制成組織汁液，用磷酸鹽作緩沖液在3 000 r/min條件下離心20 min，棄去殘?jiān)?，取上清液，?%磷鎢酸（pH6.8）負(fù)染色1-2 min，在電鏡（JBM-100CXII型）下觀察，每個(gè)樣品做3個(gè)銅網(wǎng)，每個(gè)銅網(wǎng)至少取20個(gè)以上不同視野檢測(cè)病毒，并以未脫病毒樣品作對(duì)照，確認(rèn)所含病毒的基本形態(tài)和特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體大小對(duì)莖尖成活率的影響

一般大蒜無(wú)病毒區(qū)分布在近生長(zhǎng)點(diǎn)0.1-1.0 mm范圍內(nèi)，因此大蒜脫毒頻率的高低，關(guān)鍵在于剝?nèi)∏o尖的大小。本試驗(yàn)在同等條件下，采用長(zhǎng)度為0.2-0.9 mm分別帶有1片葉原基、2-3片葉原基和不帶葉原基的3種莖尖為外植體。結(jié)果表明，莖尖外植體大小對(duì)成活率有明顯影響，帶有2片葉原基的莖尖萌動(dòng)早、顯綠快、成活率高，但該外植體大小在1.0 mm左右，難以保證脫毒效果；而剝?nèi)〔粠~原基的莖尖（0.1 mm），接種后多數(shù)變?yōu)楹稚?、中途枯死，或變硬、停留在原?lái)狀態(tài)，長(zhǎng)成完整植株的概率很?。灰詭в?片葉原基、大小為0.2-0.6 mm的莖尖外植體較為適宜，這與李昌華等[4]的研究結(jié)果基本相似。

2.2 基本培養(yǎng)基的篩選

由表1可知，各培養(yǎng)基里的莖尖均能誘導(dǎo)成苗，經(jīng)差異顯著性測(cè)定，MS、N6、B5培養(yǎng)基的成苗率均顯著高于WPM培養(yǎng)基，MS和N6培養(yǎng)基的成苗率均達(dá)90%。觀察結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基上，幼芽變綠早（僅6-7 d）、幼苗健壯，對(duì)繼代培養(yǎng)至關(guān)重要；N6培養(yǎng)基誘導(dǎo)成苗率雖高，但幼芽變綠較MS培養(yǎng)基遲2-3 d，且幼苗長(zhǎng)勢(shì)較弱，影響了其后來(lái)的增殖與擴(kuò)繁；在WPM培養(yǎng)基上外植體培養(yǎng)速度慢、生長(zhǎng)發(fā)育差。由此可見(jiàn)，MS培養(yǎng)基配合適當(dāng)濃度的BA和NAA是誘導(dǎo)“嘉定白蒜”莖尖成苗較為適宜的培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)莖尖成苗的影響

2.3 激素和生長(zhǎng)素的配比

以MS為基本培養(yǎng)基進(jìn)行激素及生長(zhǎng)素配比試驗(yàn)，接種后3-4周各增殖培養(yǎng)基均可不同程度地分化出試管叢生苗。由表2可見(jiàn)，處理（1）優(yōu)于其它處理組合，每個(gè)莖尖平均分化4.0個(gè)芽，且增殖的新生芽生長(zhǎng)正常。初步結(jié)果認(rèn)為，較低濃度的BA和IAA對(duì)“嘉定白蒜”莖尖外植體的芽分化具有良好的促進(jìn)作用。處理（7）、（8）雖然增殖系數(shù)分別為3.1、2.6，但分化出的單株有玻璃苗或假莖膨大異?，F(xiàn)象，這可能與BA濃度偏高有一定關(guān)系。

表2 不同激素配比對(duì)莖尖成苗增殖的影響

2.4 不同濃度NAA對(duì)大蒜綠苗生根的影響

由表3可知，隨著NAA濃度的增加，生根率均有不同程度的提高，以NAA濃度為0.8 mg/L時(shí)生根效果最為理想，生根率達(dá)71%，當(dāng)其濃度增至1.0 mg/L時(shí)，生根率開(kāi)始下降。說(shuō)明在生根培養(yǎng)基中添加適量NAA有利于組培苗生根，但濃度過(guò)高不僅生根率下降，而且產(chǎn)生的根短而脆，造成后期移栽成活率不降。在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，生根培養(yǎng)基中以MS培養(yǎng)基附加NAA0.6-0.8 mg/L較為適宜。

表3 不同濃度NAA對(duì)大蒜綠苗生根的影響

2.5 病毒檢測(cè)結(jié)果

以本試驗(yàn)培育的脫毒組培苗為試樣，進(jìn)行花葉病癥狀觀察及電鏡檢查檢測(cè)，并以未脫毒植株為對(duì)照。結(jié)果表明，對(duì)照中全部含病毒，該病原體為一種彎曲線狀病毒，粒子直徑為10-12 nm，長(zhǎng)度不等，大多數(shù)病毒顆粒的長(zhǎng)度集中在600-850 nm，為典型的大蒜花葉病毒[5]，平均每銅網(wǎng)網(wǎng)孔病毒粒子含量達(dá)110粒；被檢測(cè)的13份再生植株中，有11份樣品在所有的視野中沒(méi)有觀察到病毒，脫毒率為85%，且脫毒蒜個(gè)體健壯、葉片綠而肥大、根系發(fā)達(dá)、清秀無(wú)黃色斑點(diǎn)。由此可見(jiàn)，“嘉定白蒜”通過(guò)莖尖培養(yǎng)具有明顯的脫毒效果，可消除或減輕種蒜帶毒率，從而獲得無(wú)性系脫毒苗原種。

3 結(jié)論與討論

利用大蒜莖尖誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行不定芽的增殖從而生產(chǎn)大蒜脫毒苗，是目前為止大蒜快速繁殖且降低病毒傳染率的一種十分重要的手段。本試驗(yàn)主要是通過(guò)不同莖尖大小的處理進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果表明，莖尖外植體大小對(duì)成活率有明顯影響，以帶有1片葉原基、大小為0.2-0.6 mm的莖尖外植體較為適宜；不同培養(yǎng)基和激素配比對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)率和成苗率有顯著影響，以MS+BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)成苗率較高，同時(shí)以MS附加NAA 0.6-0.8 mg/L的培養(yǎng)基生根率較高；對(duì)脫毒苗進(jìn)行病毒檢測(cè)，脫毒率為85%，表明莖尖培養(yǎng)具有明顯的脫毒效果。

許多研究表明[6，7]，培養(yǎng)基中附加不同的激素對(duì)大蒜脫毒苗的誘導(dǎo)率具有不同的效果，同時(shí)，不同的激素配比、不同的NAA濃度、不同的白蒜品種對(duì)大蒜成苗率、生根率及其他性狀均有不同的影響效果。因此，要根據(jù)不同的大蒜品種確定合適的激素配比，從而建立優(yōu)種繁育體系。

[1] 宋滿坡.大蒜莖尖的組織培養(yǎng)[J].信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào),2005,15（3）：86-87.

[2] 陳世儒,黃菊輝.大蒜離體快繁及脫毒[J].園藝學(xué)報(bào),1991, 18(3):245-250.

[3] 趙一鵬,宋建偉,周巖,等.植物組織培養(yǎng)及其在園藝上的應(yīng)用[J].河南職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào),2002,30（3）：30-32.

[4] 李昌華,李小川,趙美華,等.大蒜莖尖脫毒技術(shù)及組織培養(yǎng)研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),1995,10(3):20-25.

[5] DN Moriconi, VC Conci, SF Nome. In vitro plantlet regeneration from callus in garlic(Allium sativum L.[J]. Phyton,1989,(1-2):97-103.

[6] 屈二軍,李文建,張現(xiàn)青,等.植物激素對(duì)大蒜愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36（21）：8932-8933.

[7] 湯青林,王志敏,宋明,等.大蒜不定芽的誘導(dǎo)及其增殖系數(shù)的調(diào)節(jié)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,22（6）：224-226.

2015-06-28