三江平原沼澤濕地墾殖及自然恢復(fù)對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

徐 飛, 蔡體久, 楊 雪, 琚存勇, 唐慶明

1 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 哈爾濱 150040 2 黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院, 哈爾濱 150038 3 呼倫貝爾市林業(yè)局, 呼倫貝爾 021008

三江平原沼澤濕地墾殖及自然恢復(fù)對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

徐 飛1, 2, 蔡體久1,*, 楊 雪1, 2, 琚存勇1, 唐慶明3

1 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 哈爾濱 150040 2 黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院, 哈爾濱 150038 3 呼倫貝爾市林業(yè)局, 呼倫貝爾 021008

為量化墾殖對(duì)我國(guó)東北沼澤濕地的影響程度,于2015年6月基于Illumina Miseq PE300第二代高通量測(cè)序平臺(tái),對(duì)黑龍江省洪河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的原始沼澤、耕地、退耕濕地的土壤細(xì)菌16S rRNA基因高變區(qū)域進(jìn)行測(cè)序,并分析沼澤濕地土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成與墾殖的關(guān)系。結(jié)果表明：共獲得358737條修剪序列且被劃分為36個(gè)已知的菌門,在11個(gè)主要的土壤細(xì)菌門類中 (相對(duì)豐度>1%),芽單胞菌門 (P<0.01)、擬桿菌門 (P<0.01)、厚壁菌門 (P<0.01) 和綠菌門 (P<0.01) 在不同生境類型樣地差異顯著,土壤細(xì)菌群落alpha多樣性由高到低排序依次是：耕地、退耕濕地、原始沼澤。結(jié)合相關(guān)性分析和冗余分析可以證明,長(zhǎng)期的耕作,特別是旱田耕作對(duì)沼澤濕地土壤細(xì)菌群落組成產(chǎn)生顯著的影響,土壤pH、含水量、全碳、有機(jī)碳、可溶有機(jī)碳、堿解氮、微生物量碳、微生物量氮對(duì)土壤細(xì)菌的多樣性和群落組成產(chǎn)生影響?？傊?研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)自然恢復(fù)可以顯著促進(jìn)土壤細(xì)菌群落多樣性的恢復(fù),但是沼澤濕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)一旦被墾殖干擾改變將很難恢復(fù)到原始狀態(tài),強(qiáng)調(diào)了有效地利用土壤細(xì)菌群落對(duì)維護(hù)土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡具有重要的意義。

沼澤；墾殖；土壤細(xì)菌；α多樣性；群落結(jié)構(gòu)；高通量測(cè)序

中國(guó)東北部是沼澤濕地 (Marsh) 的主要分布區(qū)之一,也是黑土的原生地。由于特殊的氣候條件和地理位置,使土壤具有腐殖質(zhì)含量高、微生物數(shù)量和種類較少的特點(diǎn)。因此,其生態(tài)環(huán)境雖然最適合農(nóng)業(yè)開發(fā),但具有脆弱易破壞性[1- 2]。在全球氣候變暖和人類大面積墾濕造田的綜合影響下,中國(guó)東北沼澤濕地出現(xiàn)了不同程度的退化。沼澤濕地生態(tài)系統(tǒng)正常的水循環(huán)、有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的循環(huán)過(guò)程受到嚴(yán)重影響,土壤變薄、變貧瘠,地下水位降低,沼澤濕地的土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成隨之發(fā)生改變[3- 5]。

近年來(lái),這種現(xiàn)象逐漸引起中國(guó)政府及科研人員的高度關(guān)注。有關(guān)濕地墾殖的影響[6]、濕地污染的處理[7]、濕地微生物參與的碳氮循環(huán)等方面成為了研究熱點(diǎn)[8- 9]。人類逐漸認(rèn)識(shí)到土壤微生物是土壤生態(tài)環(huán)境中最敏感的生物,并且不斷探索通過(guò)控制土壤微生物促進(jìn)土壤環(huán)境修復(fù)的方法[10]。而細(xì)菌在土壤微生物中數(shù)量最多、分布最廣,是參與土壤有機(jī)質(zhì)分解和礦化過(guò)程的主要門類,在化學(xué)物質(zhì)循環(huán)、降解污染和修復(fù)生態(tài)環(huán)境方面起著重要作用[11]。其群落結(jié)構(gòu)與組成能夠反映出土壤養(yǎng)分變化乃至環(huán)境變化帶來(lái)的影響,并能直接影響土壤功能的發(fā)揮[12]。因此,研究人員對(duì)土壤細(xì)菌的種類和功能進(jìn)行更詳細(xì)的劃分,對(duì)多種土壤細(xì)菌分解有機(jī)質(zhì)、固氮、控制植物生長(zhǎng)和降解有機(jī)農(nóng)藥的調(diào)節(jié)機(jī)制展開了深入的研究[13- 15]。

然而,傳統(tǒng)的觀察和分離方法由于儀器的分辨率和大量的微生物不能夠培養(yǎng)帶來(lái)的局限性等因素,很難準(zhǔn)確的揭示細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、功能及多樣性。隨著科技的進(jìn)步,分子生物技術(shù)成為科學(xué)家們探索微生物個(gè)體、群體間作用及其與環(huán)境關(guān)系的重要手段[16- 17]。不可培養(yǎng)的土壤細(xì)菌通過(guò)基因組信息能夠被辨別、豐度可以被比較、計(jì)算,因此全面了解土壤細(xì)菌群落狀態(tài)成為了現(xiàn)實(shí)[18]。本文以墾殖及自然恢復(fù)下的沼澤濕地為研究對(duì)象,基于新一代高通量基因測(cè)序技術(shù),通過(guò)分析土壤細(xì)菌的種類以及它們之間的相對(duì)豐度和進(jìn)化關(guān)系,探討土壤細(xì)菌多樣性與土壤環(huán)境因子之間的內(nèi)在聯(lián)系,揭示墾殖對(duì)中國(guó)東北沼澤濕地土壤環(huán)境帶來(lái)的影響,對(duì)于研究環(huán)境治理和微生物資源利用有著重要的現(xiàn)實(shí)意義,為中國(guó)東北沼澤濕地的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 研究地區(qū)概況

試驗(yàn)地位于三江平原腹地黑龍江省洪河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(47°42′38″—47°52′00″N, 133°34′38″—133°46′29″ E),總面積為21836 hm2,屬于濕地生態(tài)系統(tǒng)類型的保護(hù)區(qū)。海拔一般在58—61 m之間,溫帶濕潤(rùn)氣候,1月份平均溫度為-23.4℃左右,7月份平均溫度在22.4℃左右,年平均氣溫約為1.9℃。多年平均降雨量為585 mm,多年平均蒸發(fā)量為1166 mm,多年平均無(wú)霜期131 d左右,凍融期從10月中旬至次年的5月中旬,沼澤植被凍層深80—160 mm。保護(hù)區(qū)內(nèi)的絕大部分植被仍保持原始狀態(tài),以草本沼澤植被和水生植被為主,間有島狀林分布。主要植被有毛果苔草 (Carexlasiocapa)、漂筏苔草 (Carexpseudocuraica)、烏拉苔草 (Carexmeyeriana)及狹葉甜茅 (Glyceriaspiculosa)、小葉章 (Deyeuxiaangustifolia)等[19]。

1.2 樣地的設(shè)計(jì)與土壤樣品的采集

2014年9月,根據(jù)洪河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)沼澤濕地和實(shí)驗(yàn)田的分布情況,共設(shè)置了6塊實(shí)驗(yàn)樣地。其中,在保護(hù)區(qū)緩沖區(qū)設(shè)置2塊原始沼澤濕地類型樣地 (PM),分別命名為小葉章沼澤 (Site 1, S1)、烏拉苔草沼澤 (Site 2, S2)；在保護(hù)區(qū)實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置2塊耕地類型樣地 (Cultivated land, CL),分別命名為水稻田 (Site 3, S3)、輪作農(nóng)田 (Site 4, S4),輪種作物為：玉米-高粱-大豆；在保護(hù)區(qū)實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置2塊退耕濕地 (CCTW),分別命名為水田退耕 (Site 5, S5)、旱田退耕 (Site 6, S6),樣地詳細(xì)信息如表1。

表1 樣地的具體信息

PM: 原始沼澤 pristine marshland；CL: 耕地 cultivated land；CCTW: 退耕濕地 cropland converting to wetland

于2015年6月,土壤微生物量較大時(shí)進(jìn)行土壤采集。每塊實(shí)驗(yàn)樣地內(nèi)共設(shè)置了2塊10 m×10 m的標(biāo)準(zhǔn)樣方,在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣方中隨機(jī)布設(shè)2 m×2 m的小樣方3個(gè),分別在樣方的四角與中心布設(shè)5個(gè)取樣點(diǎn),采用無(wú)菌土鉆和環(huán)刀取表層大約5—20 cm深度的土壤樣品,更換樣地取樣前對(duì)土鉆等工具采取清洗殺菌措施。每個(gè)取樣點(diǎn)中大約取出0.2 kg的土壤樣品,然后將每個(gè)土樣分為2份,一份土樣裝入無(wú)菌自封樣品袋中并置于4℃電子恒溫箱中,6塊樣地中共獲取180份土樣,用于測(cè)定土壤化學(xué)性質(zhì)。將同一標(biāo)準(zhǔn)樣方的剩余15份土樣充分混合,過(guò)2 mm篩網(wǎng),去除雜草與石塊后裝入無(wú)菌自封樣品袋中,并儲(chǔ)存于-80℃的干冰保溫箱中,用于提取土壤細(xì)菌DNA,共獲取12個(gè)土壤微生物樣品[20]。

1.3 土壤理化指標(biāo)的測(cè)定

土壤pH值用土∶水=1∶2.5浸提,電位法測(cè)定；土壤水分含量(Mc)使用重量分析儀測(cè)得；土壤的全碳(TC)和全氮(TN)含量使用元素分析儀測(cè)得；土壤有機(jī)碳(SOC) 使用島津TOC-VCPH分析儀測(cè)定；土壤溶解有機(jī)碳(DOC)含量使用高純度水浸提,取上清液過(guò)0.45m濾膜后使用島津TOC-VCPH分析儀測(cè)定；堿解氮(AN)含量采用堿解蒸餾法測(cè)定；土壤微生物生物量碳(MBC)含量采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法,通過(guò)公式：MBC =EC/0.45計(jì)算得出,式中,EC為熏蒸和未熏蒸樣品浸提液測(cè)定的有機(jī)碳差值；土壤微生物生物量氮(Soil microbial biomass of nitrogen, MBN)含量采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法,通過(guò)公式：MBN =EN/0.54計(jì)算得出,式中,EN為熏蒸和未熏蒸樣品浸提液測(cè)定的有機(jī)氮差值[21- 23]。

1.4 土壤細(xì)菌DNA提取與PCR擴(kuò)增

使用E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒(Omega U.S.)并按照說(shuō)明書抽提基因組DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在土壤細(xì)菌16SRNA的v4—v5區(qū)域合成帶有條形碼的特異引物。

引物設(shè)計(jì)：上游引物338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′)；

下游引物806R(5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)[24]。

PCR試驗(yàn)采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase,20L反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4L, 2.5 mmol/L dNTPs 2L, Forward Primer(5mol/L) 0.8L, Reverse Primer(5mol/L) 0.8L, FastPfu Polymerase 0.4L, Template DNA 10ng, 補(bǔ)ddH2O至20L；PCR儀：ABI GeneAmp? 9700 型；

PCR反應(yīng)參數(shù)：1) 1× (3 minutes at 95℃). 2) 27× (30 seconds at 95℃；30 seconds at 55 ℃；45 seconds at 72 ℃). 3) 10 minutes at 72 ℃, 10 ℃ until halted by user。全部樣本嚴(yán)格按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行,每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù),將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)切膠回收PCR產(chǎn)物[25- 26]。

1.5 Illumina Miseq測(cè)序

Tris_HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測(cè),參照電泳初步定量結(jié)果,將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega 公司)進(jìn)行檢測(cè)定量。將純化擴(kuò)增產(chǎn)物等摩爾混合,構(gòu)建Miseq文庫(kù),按照Illumina MiSeq平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議進(jìn)行雙端測(cè)序(2×300)。原始測(cè)序數(shù)據(jù)存放在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心建立了大容量數(shù)據(jù)庫(kù)SRA中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra)。

1.6 生物信息統(tǒng)計(jì)與分析

Miseq測(cè)序序列數(shù)據(jù)首先根據(jù) PE reads之間的 overlap關(guān)系,使用軟件Trimmomatic將成對(duì)的 reads 拼接(merge)成一條序列,同時(shí)對(duì) reads的質(zhì)量和 merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾,并根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列,并校正序列方向。然后按照 barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣本得到有效數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)去雜方法和參數(shù)：過(guò)濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基,設(shè)置50bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20,從窗口開始截去后端堿基,過(guò)濾質(zhì)控后50bp以下的read；根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系,將成對(duì)reads拼接(merge)成一條序列,最小overlap長(zhǎng)度為10bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2,篩選不符合序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品,并調(diào)整序列方向,barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0,最大引物錯(cuò)配數(shù)為2[26- 27]。

全部分析在運(yùn)算分類單位 (Operational Taxonomic Units, OTU) 的相似水平為97% (0.97)條件下進(jìn)行。使用Usearch軟件 (version 7.1) 對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分及生物信息統(tǒng)計(jì)；采用貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,置信度閾值為0.7,比對(duì)RDP (Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫(kù) (Release 11.1)；計(jì)算alpha多樣性指數(shù)和做rarefaction分析采用mothur軟件 (version v.1.30.1),計(jì)算公式：Ace指數(shù)參考 (http:// www.mothur.org/wiki/Ace)；Chao指數(shù) (http://www.mothur.org/wiki/Chao)；Shannon指數(shù) (http://www.mothur. org/wiki/Shannon)；Simpson指數(shù) (http://www.mothur.org/wiki/ Simpson)。利用R語(yǔ)言工具制作曲線圖和文氏圖；使用Qiime計(jì)算beta多樣性距離矩陣,根據(jù)beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類 (Hierarchical cluatering) 分析,使用非加權(quán)組平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA) 算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)；R語(yǔ)言vegan包中冗余分析 (Redundancy Analysis, RDA) 和作圖；使用SPSS軟件 (IBM SPSS Statistics 22 for WINDOWS) 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；差異顯著性檢驗(yàn)采用Duncan法和排列檢驗(yàn) (Permutation tests)；相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生境類型樣地土壤理化性質(zhì)差異

墾殖及自然恢復(fù)對(duì)土壤pH值、含水量及碳、氮含量的影響差異達(dá)顯著水平 (表2)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),耕地土壤的平均pH值比沼澤濕地土壤的高8.45%,比退耕濕地土壤的pH值高2.48%；耕地土壤含水量比沼澤濕地土壤的低41.37%,比退耕濕地土壤的含水量低13.05%；沼澤濕地土壤TC、TN、C/N、SOC、DOC、AN、MBC、MBN的含量分別是耕地土壤的2.36、1.19、1.97、2.38、3.23、1.43、4.42、3.18倍,分別是退耕濕地土壤的1.75、1.11、1.58、1.78、3.04、1.39、2.44、1.57倍。由此可見,持續(xù)的在沼澤濕地進(jìn)行墾殖對(duì)土壤理化性質(zhì)和微生物量具有顯著的影響。

表2 不同樣地的土壤理化性質(zhì)和微生物量

不同小寫字母表示不同生境類型間差異顯著(P<0.05),最大的平均數(shù)標(biāo)記為a,表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=180)

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通過(guò) miseq高通量測(cè)序并優(yōu)化后,6個(gè)樣地的12個(gè)土壤樣品共獲得358737條修剪序列且被劃分為36個(gè)已知的菌門,總堿基數(shù)為1567500132,平均堿基長(zhǎng)度為 436.95 bp,其中 401—500 bp的堿基占總序列數(shù)的99.89%。

稀釋性曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體,統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目,并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建曲線[28]。采用抽樣序列數(shù)與它們所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線(圖1),可以看出12個(gè)土壤樣品的稀釋性曲線均趨于平坦,表明測(cè)序數(shù)據(jù)合理,更多的測(cè)序數(shù)據(jù)只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU。

2.3 不同類型樣地土壤細(xì)菌群落的OTU分布

Venn圖用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目,可以比較直觀的表現(xiàn)環(huán)境樣本的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況[29]。如圖2,在97%的相似水平上進(jìn)行統(tǒng)計(jì),全部樣地的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目為2263個(gè),其中共有的OTU分布數(shù)目為1411個(gè),約占62.35%。退耕濕地土壤獨(dú)有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目最少,約占全部的1.55%；耕地土壤獨(dú)有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目最多,約占全部9.63%；原始沼澤濕地土壤獨(dú)有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目為52個(gè),約占全部的2.30%。原始沼澤濕地土壤與耕地土壤共有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目約占二者全部的67.77%；原始沼澤濕地土壤與退耕濕地土壤共有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目約占二者全部的75.21%；耕地土壤與退耕濕地土壤共有OTU分布數(shù)目約占全部的78.38%。由此可以看出原始沼澤濕地與耕地土壤細(xì)菌的OTU分布差異最顯著。

2.4 不同類型土壤細(xì)菌群落α多樣性

通過(guò)對(duì)各土壤樣品細(xì)菌群落進(jìn)行α多樣性統(tǒng)計(jì)(表3),并對(duì)3種生境類型樣地土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)可知,原始沼澤濕地土壤細(xì)菌群落的多樣性相對(duì)較低,而耕作導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落的多樣性顯著提高,濕地退耕后土壤細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)略有降低,與耕地土壤細(xì)菌群落的多樣性差異水平不顯著。

圖1 不同樣地土壤細(xì)菌OTU稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves showing the extent of OTU detection at the different quadrats不同顏色的曲線代表不同樣方；相似水平為97%;S：實(shí)驗(yàn)樣地

圖2 不同類型樣地土壤細(xì)菌基因測(cè)序獲取的基因庫(kù)中獨(dú)有和共有OTUs分布的Venn圖Fig.2 Venn diagram showing the numbers of shared and exclusive OTUs of soil bacteria identified at different types of sites PM, 原始沼澤pristine marshland；CL, 耕地cultivated land；CCTW, 退耕濕地cropland converting to wetland；相似水平：97%

生境類型HabitatTypes樣地Sites艾斯指數(shù)Aceindex趙氏指數(shù)ChaoindexShannon指數(shù)ShannonindexSimpson指數(shù)SimpsonindexPMS1-1123612825.840.0132S1-2120412176.020.0046S2-1109211805.740.0070S2-2117712265.850.0082CLS3-1144514696.230.0045S3-2142215176.110.0063S4-1140814556.180.0047S4-2142814806.170.0052CCTWS5-1141114446.000.0070S5-2137514346.190.0043S6-1126712915.830.0080S6-2135213896.010.0064

2.5 不同樣地土壤細(xì)菌群落的分類組成及差異

在相似水平為 97%的條件下,對(duì)OTU的代表序列作分類學(xué)分析 (圖3)。結(jié)果表明,12個(gè)土壤樣品共檢測(cè)出2263個(gè)OTUs分布,分屬于36個(gè)菌門。其中,變形菌門 (Proteobacteria)、酸桿菌門 (Acidobacteria)、綠彎菌門 (Chloroflexi)、放線菌門 (Actinobacteria)、厚壁菌門 (Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)、疣微菌門 (Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌門 (Nitrospirae)、(Saccharibacteria)和綠菌門 (Chlorobi)為主要細(xì)菌群落門類 (相對(duì)豐度>1%)。根據(jù)beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類分析,使用非加權(quán)組平均法算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)比較各樣地土壤細(xì)菌群落的相似性和差異關(guān)系[30]?？梢钥闯?原始沼澤濕地土壤菌群結(jié)構(gòu)相似度較高,與耕地、退耕濕地間的差異較大,耕地與退耕樣地之間的土壤菌群結(jié)構(gòu)相似度較高。在原始沼澤濕地與耕地之間,豆田的菌群結(jié)構(gòu)與烏拉草沼澤的菌群結(jié)構(gòu)差異最高,而稻田的菌群結(jié)構(gòu)與小葉章沼澤相似度。

圖3 不同樣地土壤細(xì)菌門劃分水平上的群落結(jié)構(gòu)柱狀圖和聚類樹Fig.3 Histogram and cluster tree of soil bacterial community in different plots

對(duì)不同生境類型樣地11個(gè)主要細(xì)菌群落門類所占百分比采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。由此發(fā)現(xiàn),變形菌門 (P=0.777)、酸桿菌門 (P=0.601)、綠彎菌門 (P=0.830)、放線菌門 (P=0.153)、疣微菌門 (P=0.950)、硝化螺旋菌門 (P=0.116)和Saccharibacteria (P=0.241)在各類型樣地中分布較均勻,差異不顯著；芽單胞菌門 (P<0.01)、擬桿菌門 (P<0.01) 和綠菌門 (P<0.01) 在無(wú)干擾樣地與墾殖干擾樣地、退耕濕地間差異顯著；厚壁菌門 (P<0.01) 在3種類型樣地間差異顯著。

2.6 土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤性質(zhì)、微生物量的關(guān)系

采用Pearson法分析計(jì)算樣地土壤性質(zhì)與細(xì)菌α多樣性指數(shù)的相關(guān)性(表4),Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)與含水量、TC、TN、C/N、SOC、DOC、AN、MBC、MBN顯著負(fù)相關(guān),與pH值顯著正相關(guān)；Simpson指數(shù)與TC、C/N、SOC、DOC、AN、MBC、MBN顯著正相關(guān),與pH值顯著負(fù)相關(guān)。

表4 土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)、微生物量的相關(guān)系數(shù)

*P< 0.05;**P<0.01

對(duì)不同樣地土壤細(xì)菌的 OTU (97%) 組成進(jìn)行冗余分析,兩軸累計(jì)貢獻(xiàn)率為55.67% (圖 4)。原始沼澤和水田退耕分布在第一排序軸正方向,耕地和旱田退耕樣地分布在第一排序軸負(fù)方向,表明墾殖及自然恢復(fù)是第一排序軸的主要影響因素。Mc、TC、SOC、DOC和AN與第一排序軸正相關(guān),TN和pH與第一排序軸負(fù)相關(guān)。排列檢驗(yàn)顯示 Mc、pH、TC、SOC和DOC對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最顯著。

圖4 環(huán)境因素對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征影響的冗余分析Fig.4 RDA of soil bacterial community and environmental factors

3 討論與結(jié)論

3.1 不同生境土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性及控制因子

目前,有關(guān)土壤細(xì)菌群落方面的研究?jī)?nèi)容較落后且嚴(yán)重不足,因而土壤細(xì)菌被比喻為“生物暗物質(zhì)”[31],針對(duì)墾殖及恢復(fù)對(duì)土壤細(xì)菌群落影響機(jī)理等方面的科學(xué)問(wèn)題亟待解決[1,18]。本研究采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)沼澤濕地土壤細(xì)菌群落進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同類型生境的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異性,從聚類角度分析,退耕濕地與原始沼澤的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大而植被類型相同,表明植被類型對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響處于次要地位。墾殖與退耕濕地的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較接近,與原始沼澤土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著不同,可能是由于退耕還不能對(duì)土壤環(huán)境完全修復(fù),有些相似的土壤性質(zhì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌存在相似種群[32]。

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化以群落組分變化為基礎(chǔ),不同類型生境土壤細(xì)菌群落組分的不同預(yù)示著環(huán)境改變?yōu)檫@些細(xì)菌提供了特異性的生存條件,從而對(duì)菌群進(jìn)行選擇[33]。三江平原3種不同生境類型的沼澤濕地土壤細(xì)菌群落分屬于36菌門,在墾殖和自然恢復(fù)的土樣中沒(méi)有檢測(cè)出LCP- 89、TM6、Gracilibacteria、互養(yǎng)菌門 (Synergistetes) 的菌群,而在原始沼澤土樣中沒(méi)有檢測(cè)出熱袍菌門 (Thermotogae) 和梭桿菌門 (Fusobacteria) 的菌群,這說(shuō)明墾殖過(guò)程破壞了原有土壤細(xì)菌群落的生態(tài)平衡,改變土壤菌群原有的生境條件,從而導(dǎo)致某種土壤細(xì)菌種群異常的增加或減少,同時(shí)引入了新的菌群為其提供適宜的生境條件,通常土壤細(xì)菌群落多樣性會(huì)變得比原來(lái)高[34]。

不同類型生境的土壤樣品中存在特有的高相對(duì)豐度和低相對(duì)豐度細(xì)菌門類[35]。如墾殖土樣中的厚壁菌和芽單胞菌的相對(duì)豐度顯著高于原始沼澤土樣,而墾殖土樣中的疣微菌和綠菌的相對(duì)豐度顯著低于原始沼澤土樣,并且這4種菌門的土壤細(xì)菌群落與土壤pH值、含水量及碳氮含量同時(shí)具有趨勢(shì)性變化,表明這4種菌門的土壤細(xì)菌群落更易受墾殖干擾的影響,且土壤pH值、含水量及碳氮含量都是與沼澤土壤菌群變化密切相關(guān)的影響因子。沼澤土壤中含有龐大的細(xì)菌數(shù)量意味著擁有復(fù)雜的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),認(rèn)識(shí)和利用土壤細(xì)菌群落對(duì)維護(hù)土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡以及促進(jìn)耕地的可持續(xù)利用具有重要的意義[36]。

3.2 不同生境土壤細(xì)菌群落多樣性的比較及控制因子

利用多樣性指數(shù)分析土壤細(xì)菌群落是一種非常有效的方法[37],在研究土壤細(xì)菌α多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn),墾殖導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度顯著高于原始沼澤,但濕地退耕并沒(méi)有導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度的顯著降低,這與于振華利用DGGE圖譜分析結(jié)果相似,在作物的生長(zhǎng)季節(jié)耕地土壤細(xì)菌Shannon指數(shù) (3.49—3.69) 高于自然恢復(fù)土地土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)(3.34—3.44)[38],海倫市與三江平原的緯度較為相近,耕地土壤條件具有相似性。劉方春等在研究持續(xù)干旱對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響中發(fā)現(xiàn),隨著持續(xù)干旱強(qiáng)度的增大,土壤細(xì)菌的數(shù)量及群落多樣性先增加后減少[39],這與本研究旱田土壤細(xì)菌群落多樣性高于水田和沼澤濕地的結(jié)果相似。三江平原夏季氣候濕潤(rùn),土壤含水量高,旱田耕作降低土壤含水量可以提高土壤細(xì)菌群落多樣性,而干旱程度沒(méi)有到達(dá)土壤細(xì)菌的群落多樣性由增到減的閾值,沼澤濕地的土壤含水量可能是土壤細(xì)菌群落多樣性的關(guān)鍵控制因子。

沼澤濕地墾殖或恢復(fù)的過(guò)程能夠通過(guò)改變土壤的水熱條件、土壤結(jié)構(gòu)以及土壤營(yíng)養(yǎng)條件,間接的影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性[40]。土壤細(xì)菌群落多樣性發(fā)生變化是適應(yīng)墾殖干擾的直接表現(xiàn),這種變化加快了土壤有機(jī)質(zhì)的分解,也促進(jìn)了作物吸收土壤養(yǎng)分[41]。本研究中發(fā)現(xiàn),墾殖過(guò)程導(dǎo)致土壤中的TC、TN、SOC、DOC、AN、MBC及MBN含量顯著降低,卻顯著提高了土壤細(xì)菌群落的多樣性水平,推斷出土壤碳、氮含量降低可以提高土壤細(xì)菌群落多樣性,然而這種假設(shè)顯然不合常理,這種現(xiàn)象有可能是因?yàn)樵颊訚赏寥烙袡C(jī)物經(jīng)過(guò)常年積累,雖然土壤養(yǎng)分含量極高,但其自然存在形式不能夠被大多數(shù)土壤細(xì)菌作為能量來(lái)源直接利用,墾殖改變了沼澤濕地土壤養(yǎng)分的原始存在形式,為土壤細(xì)菌對(duì)碳、氮的利用提供了有利條件,因此不能理解為土壤碳氮含量下降促進(jìn)了土壤細(xì)菌多樣性提高,而是只能說(shuō)明沼澤濕地中的碳、氮含量并不是土壤細(xì)菌多樣性的關(guān)鍵限制因子。本文研究了墾殖及自然恢復(fù)導(dǎo)致11個(gè)環(huán)境因子的變化對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響,但仍缺少對(duì)土壤溫度、土壤氧氣含量等相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定,其影響機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

致謝：黑龍江省洪河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局提供幫助,哈爾濱工程大學(xué)劉迪博士和東北林業(yè)大學(xué)于洋博士在野外作業(yè)中給予技術(shù)支持，特此致謝。

[1] 王宗明, 宋開山, 劉殿偉, 張柏, 張樹清, 李方, 任春穎, 金翠, 楊婷, 張春華. 1954—2005年三江平原沼澤濕地農(nóng)田化過(guò)程研究. 濕地科學(xué), 2009, 7(3): 208- 217.

[2] Liu J J, Sui Y Y, Yu Z H, Shi Y, Chu H Y, Jin J, Liu X B, Wang G H. High throughput sequencing analysis of biogeographical distribution of bacterial communities in the black soils of northeast China. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 70: 113- 122.

[3] 黃靖宇, 宋長(zhǎng)春, 宋艷宇, 劉德燕, 萬(wàn)忠梅, 廖玉靜. 濕地墾殖對(duì)土壤微生物量及土壤溶解有機(jī)碳、氮的影響. 環(huán)境科學(xué), 2008, 29(5): 1380- 1387.

[4] Zhang X M, Zhang G M, Chen Q S, Han X G. Soil bacterial communities respond to climate changes in a temperate steppe. PLoS One. 2013, 8(11): e78616.

[5] 白雪, 馬克明, 楊柳, 張潔瑜, 張小雷. 三江平原濕地保護(hù)區(qū)內(nèi)外的生態(tài)功能差異. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 28(2): 620- 626.

[6] 霍莉莉, 鄒元春, 郭佳偉, 呂憲國(guó). 墾殖對(duì)濕地土壤有機(jī)碳垂直分布及可溶性有機(jī)碳截留的影響. 環(huán)境科學(xué), 2013, 34(1): 283- 287.

[7] 郭建國(guó), 趙龍浩, 徐丹, 孫野青. 人工濕地處理造紙廢水后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 34(8): 2095- 2101.

[8] 張乃莉, 郭繼勛, 王曉宇, 馬克平. 土壤微生物對(duì)氣候變暖和大氣N沉降的響應(yīng). 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 31(2): 252- 261.

[9] 肖燁, 黃志剛, 武海濤, 呂憲國(guó). 三江平原4種典型濕地土壤碳氮分布差異和微生物特征. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 25(10): 2847- 2854.

[10] Ribeiro H, Mucha A P, Almeida C M R, Bordalo A A. Bacterial community response to petroleum contamination and nutrient addition in sediments from a temperate salt marsh. Science of the Total Environment, 2013, 458- 460: 568- 576.

[11] Sura S, Waiser M J, Tumber V, Raina-Fulton R, Cessna A J. Effects of a herbicide mixture on primary and bacterial productivity in four prairie wetlands with varying salinities: an enclosure approach. Science of the Total Environment, 2015, 512- 513: 526- 539.

[12] Arroyo P, de Miera L E S, Ansola G. Influence of environmental variables on the structure and composition of soil bacterial communities in natural and constructed wetlands. Science of the Total Environment, 2015, 506- 507: 380- 390.

[13] 汪仲瓊, 王為東, 祝貴兵, 尹澄清. 人工和天然濕地蘆葦根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的比較. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 31(16): 4489- 4498.

[14] Liu J J, Zheng C Y, Song C C, Guo S D, Liu X B, Wang G H. Conversion from natural wetlands to paddy field alters the composition of soil bacterial communities in Sanjiang Plain, Northeast China. Annals of Microbiology, 2014, 64(3): 1395- 1403.

[15] Ludwig-Müller J. Bacteria and fungi controlling plant growth by manipulating auxin: balance between development and defense. Journal of Plant Physiology, 2015, 172: 4- 12.

[16] 王興春, 楊致榮, 王敏, 李瑋, 李生才. 高通量測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用. 中國(guó)生物工程雜志, 2012, 32(1): 109- 114.

[17] 劉馳, 李家寶, 芮俊鵬, 安家興, 李香真. 16S rRNA基因在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 35(9): 2769- 2788.

[18] 袁紅朝, 吳昊, 葛體達(dá), 李科林, 吳金水, 王久榮. 長(zhǎng)期施肥對(duì)稻田土壤細(xì)菌、古菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 26(6): 1807- 1813.

[19] 朱寶光. 三江原始濕地的“縮影”——黑龍江洪河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū). 生命世界, 2010, (5): 16- 19.

[20] 楊菁, 周國(guó)英, 田媛媛, 劉倩麗, 劉成鋒, 楊權(quán), 周潔塵. 降香黃檀不同混交林土壤細(xì)菌多樣性差異分析. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 35(24): 8117- 8217.

[21] 孫又寧, 保萬(wàn)魁, 余梅玲. 自動(dòng)定氮儀堿解蒸餾法測(cè)定土壤中水解性氮含量. 中國(guó)土壤與肥料, 2007, (5): 64- 66.

[22] 魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000: 125- 233.

[23] 李玉潔, 王慧, 趙建寧, 皇甫超河, 楊殿林. 耕作方式對(duì)農(nóng)田土壤理化因子和生物學(xué)特性的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 26(3): 939- 948.

[24] Dennis K L, Wang Y W, Blatner N R, Wang S Y, Saadalla A, Trudeau E, Roers A, Weaver C T, Lee J J, Gilbert J A, Chang E B, Khazaie K. Adenomatous polyps are driven by microbe-instigated focal inflammation and are controlled by IL- 10-producing T cells. Cancer Research, 2013, 73(19): 5905- 5913.

[25] Schloss P D, Gevers D, Westcott S L. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-Based studies. PLoS ONE, 2011, 6(12): e27310.

[26] 張芳, 林紹艷, 徐穎潔. 水稻連作對(duì)江蘇地區(qū)稻田土細(xì)菌微生物多樣性的影響. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2014, 45(2): 161- 165.

[27] Yang S Z, Wen X, Jin H J, Wu Q B. Pyrosequencing investigation into the bacterial community in permafrost soils along the China-Russia Crude oil pipeline (CRCOP). PLoS One, 2012, 7(12): e52730.

[28] Amato K R, Yeoman C J, Kent A, Righini N, Carbonero F, Estrada A, Gaskins H R, Stumpf R M, Yildirim S, Torralba M, Gillis M, Wilson B A, Nelson K E, White B A, Leigh S R. Habitat degradation impacts black howler monkey (Alouattapigra) gastrointestinal microbiomes. The ISME Journal, 2013, 7(7): 1344- 1353.

[29] Fouts D E, Szpakowski S, Purushe J, Torralba M, Waterman R C, MacNeil M D, Alexander L J, Nelson K E. Next generation sequencing to define prokaryotic and fungal diversity in the Bovine Rumen. PLoS One, 2012, 7(11): e48289.

[30] Jiang X T, Peng X, Deng G H, Sheng H F, Wang Y, Zhou H W, Tam N F Y. Illumina sequencing of 16S rRNA tag revealed spatial variations of bacterial communities in a Mangrove wetland. Microbial Ecology, 2013, 66(1): 96- 104.

[31] Jansson J K, Prosser J I. Microbiology: the life beneath our feet. Nature, 2013, 494(7435): 40- 41.

[32] Berg G, Smalla K. Plant species and soil type cooperatively shape the structure and function of microbial communities in the rhizosphere. FEMS Microbiology Ecology, 2009, 68(1): 1- 13.

[33] 苗禎, 杜宗軍, 李會(huì)榮, 樓妍穎, 羅瑋. 5株北極微藻藻際環(huán)境的細(xì)菌多樣性. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 35(5): 1587- 1600.

[34] 陳波, 黃霄, 劉小玉, 周登博, 譚昕, 高祝芬, 張錫炎, 戚春林. 不同香蕉枯萎病區(qū)土壤細(xì)菌群落多樣性. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 24(8): 2281- 2286.

[35] 張偉, 陳一峰. 棉花長(zhǎng)期連作對(duì)新疆土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 34(16): 4682- 4689.

[36] Cookson W R, Murphy D V, Roper M M. Characterizing the relationships between soil organic matter components and microbial function and composition along a tillage disturbance gradient. Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40(3): 763- 777.

[37] 隋心, 張榮濤, 鐘海秀, 許楠, 王繼豐, 劉應(yīng)竹, 袁海峰, 倪紅偉. 利用高通量測(cè)序?qū)θ皆∪~章濕地土壤細(xì)菌多樣性的研究. 土壤, 2015, 47(5): 919- 925.

[38] 于鎮(zhèn)華. 墾殖與自然恢復(fù)黑土微生物群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)功能的季節(jié)變化[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 2012.

[39] 劉方春, 邢尚軍, 馬海林, 陳波, 丁延芹, 杜秉海. 持續(xù)干旱對(duì)櫻桃根際土壤細(xì)菌數(shù)量及結(jié)構(gòu)多樣性影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 34(3): 642- 649.

[40] Sheik C S, Mitchell T W, Rizvi F Z, Rehman Y, Faisal M, Hasnain S, McInerney M J, Krumholz L R. Exposure of soil microbial communities to chromium and arsenic alters their diversity and structure. PLoS One, 2012, 7(6): e40059.

[41] Zhang X M, Chen Q S, Han X G. Soil bacterial communities respond to mowing and nutrient addition in a steppe ecosystem. PLoS One, 2013, 8(12): e84210.

Effect of cultivation and natural restoration on soil bacterial community diversity in marshland in the Sanjiang Plain

XU Fei1, 2, CAI Tijiu1,*, YANG Xue1, 2, JU Cunyong1, TANG Qingming3

1CollegeofForestry,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China2HeilongjiangAcademyofLandReclamationSciences,Harbin150038,China3HulunbeierForestryAdministration,Hulunbeier021008,China

Different perturbation regimes, including disturbance caused by cultivation or the process of natural restoration, can have significant effects on the soil bacterial community in marshland. In this study, we investigated the relationship between soil bacterial community composition and perturbation in marshland to quantify the extent of such disturbance-related changes in northeast China. We assessed the diversity of bacterial communities in twelve samples of marsh soil collected from pristine marsh, neighboring cropland, and a wetland restoration area. High-throughput sequencing of a bacteria-specific genomic sequence, the internal transcribed spacer (16S rRNA) region, was used to identify bacterial taxa. We obtained 358,737 sequences that represented 2263 bacterial OTUs across the three types of sampling sites. Of these, 1411 OTUs occurred at all three site types, 99 were shared between cultivated land and pristine marshland, 322 were shared between cultivated land and wetland converted from cropland, and 126 were shared between pristine marshland and wetland converted from cropland. All sites also hosted unique fungal OTUs, with 218 OTUs exclusive to cultivated land, 52 exclusive to pristine marshland, and 35 exclusive to wetland converted from cropland. Sequences were affiliated to 36 different phyla throughout the dataset. Sequence abundance showed that members of the Proteobacteria were more frequently identified in all soil samples than Acidobacteria, and included members of Chloroflexi, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Verrucomicrobia, Nitrospirae, Saccharibacteria, and Chlorobi, which represented an overwhelming proportion of the soil bacterial communities with an average relative abundance of > 1%, and another 25 phyla with an average relative abundance were < 1%. The dominant phyla that showed the greatest variation among habitat types (> 1% of the average relative abundance) were Gemmatimonadetes (P<0.01), Bacteroidetes (P<0.01), Firmicutes (P<0.01), and Chlorobi (P<0.01). The soil bacterial community diversity decreased from a maximum in cultivated land, through the wetland restoration area, to a minimum in pristine marshland. Redundancy and correlation analyses demonstrated that chronic disturbance through cultivation, especially dry cultivation, significantly altered the bacterial community composition of marsh soil. The α-diversity of the soil bacterial community was most affected by soil moisture, soil pH, total carbon, soil organic carbon, soil dissolved organic carbon, available nitrogen, microbial biomass of carbon, and microbial biomass of nitrogen. Meanwhile, the soil bacterial community composition was significantly affected by soil moisture, soil pH, total carbon, soil organic carbon, and soil dissolved organic carbon. Overall, the results from our study showed that the state of soil carbon and nitrogen is affected by the disturbance by agricultural cultivation, causing long-term accumulated soil nutrients to become available as an energy source that can be rapidly mineralized by soil bacteria. In addition, our results also indicate that cultivation and natural restoration influenced the bacterial community structure and diversity. Natural restoration can significantly enhance the recovery of bacterial diversity; however, once the composition of the marshland bacterial community has been altered by cultivated disturbance, it might be difficult to restore to its original state. These findings highlight the importance of effectively managing the soil bacterial community to maintain a naturally functioning soil ecosystem.

marsh; cultivation; soil bacteria; α-diversity; community structure; high-throughput sequencing

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(QC2014C029);國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)課題 (2015ZX07201-008-03)

2016- 01- 04;

2016- 07- 25

10.5846/stxb201601040015

*通訊作者Corresponding author.E-mail: caitj@263.net

徐飛, 蔡體久, 楊雪, 琚存勇, 唐慶明.三江平原沼澤濕地墾殖及自然恢復(fù)對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(22):7412- 7421.

Xu F, Cai T J, Yang X, Ju C Y, Tang Q M.Effect of cultivation and natural restoration on soil bacterial community diversity in marshland in the Sanjiang Plain.Acta Ecologica Sinica,2016,36(22):7412- 7421.