功能性生物分子對納米材料的修飾及影響

劉宇煒， 郭 卓

(沈陽化工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

?

功能性生物分子對納米材料的修飾及影響

劉宇煒， 郭 卓

(沈陽化工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

利用功能性生物分子牛血清蛋白，通過不同方法對介孔二氧化硅納米粒子進行功能化，并觀察其對藥物釋放行為的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過加熱變性方式來修飾牛血清蛋白時，牛血清蛋白能在介孔二氧化硅納米顆粒表面形成蛋白外殼，并抑制了在不同pH值環(huán)境下的藥物釋放行為.而通過靜電作用修飾牛血清蛋白時，發(fā)現(xiàn)蛋白分子能夠吸附在介孔二氧化硅的表面，并促進了藥物釋放行為對環(huán)境pH值變化的響應(yīng).

功能性生物分子； 牛血清蛋白； 介孔二氧化硅； 藥物釋放

隨著生物醫(yī)學(xué)的不斷進步，癌癥治療手段正從單一的化療手段逐步發(fā)展為多元手段，其中納米材料起到了重要的推動作用.研究者們通過選取的反應(yīng)物，控制反應(yīng)條件，制備出了具有各種功能和尺寸的納米材料.Tasciotti E等人通過合成不同尺寸形貌以及孔徑的介孔二氧化硅粒子，成功將其作為多級運載系統(tǒng)應(yīng)用于生物成像與治療[1]. Huang Xiaohua等人通過制備Au納米棒，利用其在近紅外區(qū)具有等離子體共振效應(yīng)這個特性，成功將其應(yīng)用于癌細胞成像與光熱治療中[2].Hessel C M等人通過制備在近紅外區(qū)具有光熱轉(zhuǎn)換性能的 Cu2-xSe納米顆粒，成功開啟了半導(dǎo)體納米材料在生物體中光熱治療的應(yīng)用[3].功能性生物納米材料正憑借著其優(yōu)異的性能，不斷促進生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展.但是，遺憾的是這些材料并不能直接作用于生物體內(nèi).

由于生物分子擁有良好的生物相容性，并帶有豐富的化學(xué)基團，功能性生物分子這一概念逐漸被研究者們先后提出.利用生物分子功能化納米材料，彌補材料原有的生物應(yīng)用缺陷并提高其相關(guān)性能，已成為一項極具應(yīng)用潛力的研究.生物相容性、分散性、特異性等都是納米材料作用于體內(nèi)癌細胞必不可少的性質(zhì).但這些具有特殊功能的納米材料在生物體內(nèi)癌癥治療應(yīng)用方面存在缺陷，因此，功能化這一概念開始被研究者們提出，研究者將納米材料進行了功能化.通過不同方法在材料表面修飾上具有特殊功能的分子，同時提高其性能.Liu Z等人以共價鍵的方式成功在氧化石墨烯上修飾了聚乙二醇，使原本無法分散于血清中的氧化石墨烯能夠很好地分散于血清之中[4].Chen H Y等人利用牛血清蛋白在Au納米簇周圍包裹了一層功能性蛋白分子層，不僅彌補了Au納米簇易團聚的缺陷，還提供了多種官能團，同時在蛋白分子上進一步修飾上了葉酸，使得Au納米簇又具備了特異性的功能[5].由此可見，通過一步或多步功能化，能夠使納米材料彌補其本身在生物應(yīng)用方面的缺陷.

近年來，安全、可降解的功能性生物分子正不斷地被應(yīng)用于生物納米材料中.Zou Zhen等人利用明膠分子的物理性質(zhì)并通過共價鍵作用，成功在介孔二氧化硅納米顆粒表面上包裹了一層明膠層，大大提高了介孔二氧化硅的分散性，同時由于明膠能夠在酸性條件下降解，使得功能化后的介孔二氧化硅納米顆粒能夠?qū)H值的變化有所響應(yīng)，其藥物釋放行為在酸性條件下更為明顯[6].Liu X S等人則研究了包裹了功能性生物分子聚多巴胺的Au納米粒子的穩(wěn)定性及生物毒性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過功能化的Au納米粒子具有極低的細胞毒性，并且能長期穩(wěn)定存在于細胞內(nèi)，沒有表現(xiàn)出任何組織毒性[7].牛血清蛋白作為一種典型的功能性蛋白分子，具有便宜、安全、可降解、化學(xué)基團豐富等特點，它們不僅被用來改善材料的分散性，降低其細胞毒性，而且修飾到材料表面之后，為進一步修飾其他物質(zhì)提供反應(yīng)位點.Li C X等人利用蛋白分子高溫變性的特點，在碳納米管表面修飾上了一層蛋白分子殼，不僅大大提高了材料的分散性，還成功降低了碳納米管的細胞毒性[8].Liu J B等人通過疏水和靜電作用，在石墨烯表面修飾蛋白分子，并以這些蛋白分子提供的化學(xué)基團作為反應(yīng)位點，在石墨烯上組裝了各種金屬納米粒子[9].

文中通過實驗設(shè)計，嘗試利用蛋白分子高溫變性的特點和靜電作用，將其修飾在傳統(tǒng)載藥材料——介孔二氧化硅納米顆粒表面，觀察蛋白對材料藥物釋放行為的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過加熱變性方式來修飾牛血清蛋白時，牛血清蛋白能在介孔二氧化硅納米顆粒表面形成蛋白外殼，并抑制了在不同pH值環(huán)境下的藥物釋放行為.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

所有化學(xué)用品都未進行預(yù)處理；所有溶液均由經(jīng)Millipore Milli-Q系統(tǒng)獲得的二次水配制；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，分析純，北京化工有限公司；正硅酸乙酯(TEOS)，分析純，北京化工有限公司； 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；牛血清蛋白(BSA)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；鹽酸阿霉素(Dox)，北京華奉聯(lián)博科技有限公司；氨水、乙醇，分析純，北京化工有限公司.實驗中使用的磷酸緩沖液(PBS)由磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制.

1.2 實驗儀器

透射電子顯微鏡(H-600)，日本株式會社日立制作所；紫外/可見分光光度計(LAMBDA 25)，珀金埃爾默儀器有限公司；動態(tài)光散射儀(ZEN 3600)，英國馬爾文儀器有限公司.

1.3 材料合成

1.3.1 介孔二氧化硅納米顆粒的制備及氨基功能化

稱取0.25 g CTAB粉末加入120 mL水中，充分攪拌.待CTAB粉末完全溶解后，加入0.825 mL 2 mol/L的NaOH溶液，并加熱至80 ℃.隨后，逐滴滴加1.25 mL TEOS溶液，繼續(xù)攪拌，回流處理2 h.待反應(yīng)結(jié)束后，使用離心機8 000 r/min處理，去除上清液，并再次將所獲沉淀用水重新分散.反復(fù)處理4次后，將所獲沉淀再次分散于20 mL乙醇溶液和0.2 mL質(zhì)量分數(shù)為37.2 %的濃鹽酸中，79 ℃回流處理16 h.反應(yīng)結(jié)束后，離心水洗4次.然后將所獲沉淀放入真空干燥箱，60 ℃烘干過夜.獲得介孔二氧化硅納米顆粒.

為了獲得氨基功能化的介孔二氧化硅納米顆粒，在制備過程中，加入了APTES溶液.同樣取0.25 g CTAB粉末分散于120 mL水中，加入0.825 mL 2 mol/L的NaOH溶液，并加熱至80 ℃，隨后逐滴滴加1.25 mL TEOS溶液.加熱回流處理2 h后，將0.1 mL APTES分散于2 mL乙醇溶液中，并逐滴加入反應(yīng)溶液中，繼續(xù)加熱4 h.反應(yīng)結(jié)束后，離心水洗4次，并將沉淀再次分散于20 mL乙醇溶液和0.2 mL質(zhì)量分數(shù)為37.2 %的濃鹽酸中，79 ℃回流處理16 h.反應(yīng)結(jié)束后，離心水洗4次，將沉淀放入60 ℃真空干燥箱中，烘干過夜.獲得氨基功能化的介孔二氧化硅納米顆粒.

1.3.2 介孔二氧化硅納米顆粒負載阿霉素

稱取8 mg介孔二氧化硅納米顆粒分散于4 mL 0.125 g/L pH值為8.0的阿霉素PBS溶液中，避光攪拌過夜.負載結(jié)束后，通過離心處理，使用pH值為7.4的PBS溶液水洗數(shù)次，去除掉負載在介孔二氧化硅納米顆粒表面的阿霉素分子.

1.3.3 牛血清蛋白功能化介孔二氧化硅納米顆粒

首先，通過加熱變性的方式修飾牛血清蛋白.取5 mg負載了藥物的介孔二氧化硅納米顆粒分散于5 mL 1 g/L牛血清蛋白溶液中，60 ℃加熱15 min.反應(yīng)結(jié)束后，離心水洗處理4次.獲得牛血清蛋白功能化的介孔二氧化硅納米顆粒.

隨后，通過靜電作用的方式修飾牛血清蛋白.取5 mg負載了藥物的氨基功能化的介孔二氧化硅納米顆粒分散于5 mL 1 g/L牛血清蛋白溶液中，攪拌60 min.反應(yīng)結(jié)束后，離心水洗處理4次.獲得牛血清蛋白功能化的介孔二氧化硅納米顆粒.

1.3.4 測試牛血清蛋白對介孔二氧化硅納米顆粒藥物能力的影響

取2 mg功能化后的載藥材料，分別分散在2 mL pH值為7.4和pH值為5.0的PBS溶液中.充分分散后，將溶液轉(zhuǎn)移到搖床中，37 ℃恒溫振動.定時取出樣品進行離心處理0.5 h、2 h、12 h，收集上清液，并將材料再次分散在2mL相應(yīng)的pH值的磷酸緩沖液中，放入搖床繼續(xù)振動.同時，選用載藥后未修飾的介孔二氧化硅作為控制組，以相同條件進行藥物釋放實驗.

利用紫外/可見分光光度計測量不同濃度下阿霉素在波長482 nm處的吸光強度，繪制阿霉素吸光強度-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.測量上清液中阿霉素在482 nm處的吸光強度，從而計算出每次上清液中阿霉素的濃度，繪制出阿霉素釋放率與時間的關(guān)系曲線.

2 結(jié)果與討論

參考之前文獻報道，選用CTAB作為軟模板劑，成功制備了介孔二氧化硅納米顆粒[10].通過TEM觀察，介孔二氧化硅納米顆粒的尺寸處于50～100 nm之間，有明顯的孔道結(jié)構(gòu)(圖1).同時，為了對介孔二氧化硅氨基功能化，在制備的過程中，加入了帶氨基的硅烷偶聯(lián)劑ATPES.反應(yīng)結(jié)束后，測量材料的Zeta電勢，發(fā)現(xiàn)介孔二氧化硅納米顆粒表面電勢由(-28.3±0.7)mV變?yōu)?31.9±0.7)mV.文獻[11]通過修飾ATPES，其介孔二氧化硅的表面電勢能由(-39.4±0.9) mV變?yōu)?32.4±0.5) mV.雖然

電位變化并沒有文獻[11]那么大，但考慮到正負電荷已經(jīng)發(fā)生變化，因此，認為APTES被成功修飾到了介孔二氧化硅納米顆粒表面，使材料帶正電.

圖1 不同介孔二氧化硅TEM形貌

Fig.1 The TEM images of different mesoporous silicon

眾所周知，化療藥物阿霉素在pH值越高的水溶液中溶解度越低，因此，常常被研究者選為負載藥物應(yīng)用于藥物釋放實驗中[12].現(xiàn)將獲得的介孔二氧化硅納米顆粒分散在pH值為8 的阿霉素溶液中，攪拌過夜.通過靜電作用，帶正電的Dox分子能夠吸附在帶負電的介孔二氧化硅納米顆粒的孔道之中[13].如圖2所示，負載了阿霉素的介孔二氧化硅納米顆粒在482 nm處有了阿霉素的特征吸收峰，由此可以判斷阿霉素成功負載在了介孔二氧化硅納米顆粒的孔道之中.另一方面，由于氨基功能化的介孔二氧化硅納米顆粒的氨基基團只集中在材料表面，因此，利用同樣的方法，在氨基功能化的介孔二氧化硅納米顆粒的孔道中負載了化療藥物阿霉素(圖 3).

為了研究功能性生物分子對納米材料的修飾及影響，通過高溫加熱變性和靜電作用兩種方式促使牛血清蛋白作用在介孔二氧化硅納米顆粒的表面上，并觀察這種蛋白分子對藥物釋放行為的影響.

圖2 加熱修飾的紫外可見分光光譜

Fig.2 The UV-Vis absorption spectra of decorating by heating

圖3 靜電修飾的紫外可見分光光譜

Fig.3 The UV-Vis absorption spectra of decorating by electrostatic interaction

通過高溫加熱，牛血清蛋白能夠以變性的方式團聚在納米材料的表面上[14].觀察TEM圖發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過60 ℃處理的牛血清蛋白，能以外殼的形式包裹在介孔二氧化硅納米顆粒的表面，介孔二氧化硅納米顆粒的孔道結(jié)構(gòu)消失，并且表面上出現(xiàn)了顆粒狀的結(jié)構(gòu)(見圖1).觀察紫外/可見分光光譜，發(fā)現(xiàn)處理后的介孔二氧化硅納米的吸收光譜發(fā)生了變化，其趨勢與牛血清蛋白的吸收光譜一致，這進一步證明了牛血清蛋白成功修飾在了介孔二氧化硅納米顆粒的表面上(圖2).而在利用靜電作用修飾牛血清蛋白的實驗中，選用了氨基功能化后的介孔二氧化硅納米顆粒作為藥物載體，并使之與牛血清蛋白相互作用.由于在pH為7.4的水溶液條件下，氨基功能化后的介孔二氧化硅納米顆粒帶正電，而牛血清蛋白帶負電，嘗試通過簡單的攪拌使之相互作用，經(jīng)過60 min的處理，發(fā)現(xiàn)牛血清蛋白也被成功修飾在了介孔二氧化硅納米顆粒的表面上.觀察TEM圖發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過蛋白處理后氨基化介孔二氧化硅納米顆粒的孔道結(jié)構(gòu)同樣消失，但是表面上并未出現(xiàn)顆粒狀的結(jié)構(gòu)(圖1).同時，處理后的納米顆粒的紫外分光吸收光譜在250 nm以下，吸光度明顯增加(圖3).這說明通過靜電作用牛血清蛋白能夠吸附在納米粒子表面，但未發(fā)生變性團聚現(xiàn)象，因此，未能在材料表面發(fā)現(xiàn)顆粒狀的結(jié)構(gòu).同時，由于蛋白分子的吸附，原材料的紫外分光吸收光譜也發(fā)生了改變.

為了檢測這類新材料的藥物釋放行為，模擬了正常細胞及癌細胞的生理條件，分別將材料置于pH值為7.4與pH值為5.0的磷酸緩沖液中，觀察其藥物釋放行為.定時取樣，通過離心的方式，測取了釋放液中阿霉素在482 nm處的吸光度，計算并繪制了釋放率與時間的關(guān)系圖(見圖4、圖5).由圖4、圖5可知：利用高溫加熱變性手段修飾的牛血清蛋白無論在哪種條件下，都阻止了阿霉素的釋放，12 h后，釋放率最終維持在40 %左右，而控制組的釋放率接近80 %(圖4、圖5). 另一方面，通過靜電作用修飾的牛血清蛋白，則只是減緩了藥物釋放的速率，并使材料藥物釋放行為對pH值的變化有了更強的響應(yīng).12 h后，當(dāng)pH值偏中性時，載藥材料的藥物釋放量為50 %；而當(dāng)pH值偏酸性時，藥物釋放量提升了到80 %；對照控制組，藥物釋放率接近飽和(圖5).不難發(fā)現(xiàn)，通過靜電作用修飾的牛血清蛋白，不僅能夠起到藥物緩釋的作用，還能提高藥物釋放行為對pH值變化的響應(yīng).對比加熱組，通過靜電作用修飾了蛋白的材料，在pH值偏酸性的環(huán)境下的藥物釋放率較pH值偏中性的環(huán)境下提升了34 %，更有利于癌細胞的治療(圖6).

負載了阿霉素的介孔二氧化硅(SiO2/Dox@BSA)在pH值為5.0和pH值為7.4的條件下的藥物釋放行為

圖4 加熱變性修飾的藥物釋放行為

Fig.4 The release profiles of Dox of SiO2/Dox@BSAdecorating by heating

通過靜電修飾牛血清蛋白的負載了阿霉素的氨基功能化的介孔二氧化硅(SiO2-NH2/Dox@BSA)在pH值為5.0和pH值為7.4的條件下的藥物釋放行為

圖5 靜電修飾的藥物釋放行為

Fig.5 The release profiles of Dox of SiO2-NH2/Dox @BSA decorating by electrostatic interaction

圖6 兩種處理方法隨pH值變化的藥物釋放量的變化

Fig.6 The charges of Dox releases of SiO2/Dox@BSA and SiO2-NH2/Dox@BSA at pH 5.0 and pH 7.4

對比兩組實驗，分析造成這種現(xiàn)象的原因主要是由修飾在材料表面的蛋白分子的狀態(tài)決定的.通過高溫處理，牛血清蛋白的分子能夠發(fā)生構(gòu)象的變化，最后以團聚的形式在材料表面上成殼，形成了一定的空間位阻，因此無差別地阻礙了藥物分子的擴散.而通過靜電作用修飾的蛋白分子，其構(gòu)象并不會發(fā)生特別大的改變，不會以團聚的形式存在，所以，不會完全阻擋藥物分子的擴散.同時由于蛋白分子上含有多種化學(xué)基團，在不同pH值條件下，這些化學(xué)基團能與藥物分子產(chǎn)生強弱各異的作用力，因此，促進了材料藥物釋放行為對pH變化的響應(yīng).

3 結(jié) 論

通過高溫加熱變性和靜電作用兩種方式，成功地將生物功能分子牛血清蛋白修飾在了介孔二氧化硅納米粒子的表面.觀察材料形貌，發(fā)現(xiàn)不同的修飾方法會對修飾的蛋白分子產(chǎn)生不同的影響.而這種變化，最終決定了材料本身的藥物釋放行為.變性團聚的蛋白殼無差別地阻礙了藥物的釋放，而以分子形式存在的蛋白分子，則促進了材料藥物釋放行為對環(huán)境pH值的響應(yīng)，有利于載藥治療癌細胞的應(yīng)用.不難看出，牛血清蛋白作為功能性分子在載藥材料功能化方面有著極大的研究潛力.同時，功能性生物分子雖然有著優(yōu)異的性能，但由于其結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜，在功能化應(yīng)用的過程中，往往會因為自身結(jié)構(gòu)的變化而失去功效.如何選用合適的功能化手段，對將來功能性生物分子的研究具有重要意義.

[1] TASCIOTTI E，LIU X W，BHAVANE R，et al.Mesoporous Silicon Particles as a Multistage Delivery System for Imaging and Therapeutic Applications[J].Nature Nanotechnology，2008，3(3):151-157.

[2] HUANG X H，EL-SAYED I H，QIAN W，et al.Cancer Cell Imaging and Photothermal Therapy in the Near-infrared Region by Using Gold Nanorods[J].Journal of the American Chemical Society，2006，128(6):2115-2120.

[3] HESSEL C M，PATTANI V P，RASCH M，et al.Copper Selenide Nanocrystals for Photothermal Therapy[J].Nano Letters，2011，11(6):2560-2566.

[4] LIU Z,ROBINSON J T，SUN X M，et al.Pegylated Nanographene Oxide for Delivery of Water-insoluble Cancer Drugs[J].Journal of the American Chemical Society，2008，130(33):10876-10877.

[5] CHEN H Y，LI S L，LI B W，et al.Folate-modified Gold Nanoclusters as Near-infrared Fluorescent Probes for Tumor Imaging and Therapy[J].Nanoscale，2012，4(19):6050-6064.

[6] ZOU Z，HE D G，HE X X，et al.Natural Gelatin Capped Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Acid-Triggered Drug Delivery[J].Langmuir，2013，29(41):12804-12810.

[7] LIU X S，CAO J M，LI H，et al.Mussel-inspired Polydopamine:a Biocompatible and Ultrastable Coating for Nanoparticles in Vivo[J].ACS Nano，2013，7(10):9384-9395.

[8] LI C X，BOLISETTY S，CHAITANYA K，et al.Tunable Carbon Nanotube/Protein Core-shell Nanoparticles with Nir-and Enzymatic-responsive Cytotoxicity[J].Advanced Materials，2013，25(7):1010-1015.

[9] LIU J B，F(xiàn)U S H，YUAN B，et al.Toward a Universal “Adhesive Nanosheet” for the Assembly of Multiple Nanoparticles Based on a Protein-induced Reduction/Decoration of Graphene Oxide[J].Journal of the American Chemical Society，2010，132(21):7279-7281.

[10]LAI C Y，TREWYN B G，JEFTINIJA D M，et al.A Mesoporous Silica Nanosphere-based Carrier System with Chemically Removable Cds Nanoparticle Caps for Stimuli-Responsive Controlled Release of Neurotransmitters and Drug Molecules[J].Journal of the American Chemical Society，2003，125(15):4451-4459.

[11]TIAN Y，MALUGIN A,GHANDEHARI H.The Impact of Silica Nanoparticle Design on Cellular Toxicity and Hemolytic Activity.[J] ACS Nano，2011，5(7):5717-5728.

[12]BAI J，LIU Y W，JIANG X.Multifunctional Peg-Go/Cus Nanocomposites for Near-infrared Chemo-photothermal Therapy[J].Biomaterials，2014，35(22):5805-5813.

[13]LI G Y，SONG S，GUO L，et al.Self-assembly of Thermo-and Ph-responsive Poly(Acrylic Acid)-B-Poly(N-isopropylacrylamide) Micelles for Drug Delivery[J].Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry，2008，46(15):5028-5035.

[14]XIA B，ZHANG W Y，SHI J S，et al.Engineered Stealth Porous Silicon Nanoparticles Via Surface Encapsulation of Bovine Serum Albumin for Prolonging Blood Circulation in Vivo[J].ACS Applied Materials Interfaces，2013，5(22):11718-11724.

Modification of Nanomaterials with Functional Bio-molecules

LIU Yu-wei， GUO Zhuo

(Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110142， China)

The functional bio-molecules have drawn widespread interest because of their good biocompatibility and abundant chemical group.How to decorate the functional bio-molecules on the nanomaterials to overcome shortage of the materials on the biomedicine would be a meaningful reaches.In our report，the Bovine Serum Albumin(BSA) has been used as the functional bio-molecule and was decorated on the surface of the mesoporous silicon(mSiO2) through different methods.The release behavior has been also studied.The results showed that when the BSA was decorated on the mSiO2by denaturing the protein，the releases of the medicine have been suppressed at different pH values.When the BSA was decorated on the amino functional mSiO2(mSiO2-NH2) through the electrostatic interaction，the protein molecules could adsorb on the surface of mSiO2-NH2，and improved the sensibility of the release behavior at different pH values.

functional bio-molecules； bovine serum albumin； mesoporous silicon； medicine release

2014-10-09

遼寧省教育廳資助項目(LJQ201203)

劉宇煒(1989-)，男，湖南溆浦人，碩士研究生在讀，主要從事生物材料的研究.

郭卓(1975-)，女，遼寧沈陽人，副教授，博士，主要從事藥物緩釋材料的研究.

2095-2198(2016)04-0333-06

10.3969/j.issn.2095-2198.2016.04.010

TB34

A