超聲波輔助提取東北紅豆杉葉中多糖

石大駿， 張萬忠

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

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超聲波輔助提取東北紅豆杉葉中多糖

石大駿， 張萬忠

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

以東北紅豆杉葉為原料，利用超聲波輔助提取，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)和超聲波功率對(duì)紅豆杉多糖得率的影響.結(jié)果表明：在料液比為1∶20、提取時(shí)間40 min、提取溫度50 ℃、超聲波功率150 W、提取3次時(shí)，紅豆杉葉多糖得率達(dá)7.49 %.該提取方法高效快速，且降低了能耗，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，為提高東北紅豆杉葉中多糖成分的提取提供了研究基礎(chǔ).

東北紅豆杉； 多糖； 超聲波輔助提??； 得率

東北紅豆杉(Taxus cuspidate)是一種天然的珍貴藥用資源，其中的紫杉烷類化合物，特別是紫杉醇，具有顯著的抗腫瘤作用，在治療癌癥方面被認(rèn)為是當(dāng)今最具潛力的抗癌藥物之一[1-2].此外，最新研究表明，除紫杉醇外，紅豆杉中含有的活性多糖還具有免疫促進(jìn)作用[3]，在抗病毒、抗腫瘤[4]、抗心血管疾病、抗衰老、提高免疫、保護(hù)肝臟、清除自由基，以及保護(hù)心肌損傷等方面有著獨(dú)特的生物活性[5-7].然而，相對(duì)于紫杉醇，目前對(duì)于紅豆杉多糖的研究尚處于初級(jí)階段[8]，因而日益引起人們的關(guān)注[9].紅豆杉多糖常用提取方法主要有:熱水回流提取、超聲波輔助提取和微波輔助提取等[10-11]，而超聲波輔助提取技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、提取時(shí)間短、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于生物活性成分的提取方面[12].本文采用超聲波輔助提取技術(shù)提取東北紅豆杉葉中多糖，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確立其適宜的提取工藝，為進(jìn)一步綜合利用紅豆杉資源提供必要的技術(shù)支持和研究基礎(chǔ)[13].

1 試劑與儀器

1.1 材料與試劑

紅豆杉枝葉，采自遼寧省朝陽林場(chǎng)，采摘后放置一段時(shí)間烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過40目篩，干燥處保存?zhèn)溆茫?/p>

D(+)-無水葡萄糖(φ(HPLC)≥98 %)，上海源葉生物科技有限公司；乙醇(AR，體積分?jǐn)?shù)95 %)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重蒸苯酚，西隴化工股份有限公司；濃硫酸(AR，體積分?jǐn)?shù)98 %)，沈陽市新化試劑廠；石油醚(AR)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司.

1.2 儀 器

FA1104電子天平，沈陽杰龍儀器有限公司；UV1100紫外-可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；KQ5200DE 超聲波清洗機(jī)，河南兄弟儀器有限公司；其余均為實(shí)驗(yàn)室常用玻璃儀器.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑的配制

質(zhì)量分?jǐn)?shù)6 %苯酚溶液的配制：精確稱取6.0 g苯酚，加入一定量的蒸餾水使苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 %，混勻，置于棕色瓶中保存?zhèn)溆?

對(duì)照品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取5.4 mg干燥至恒質(zhì)量的D(+)-無水葡萄糖，于100 mL容量瓶中蒸餾水溶解定容，混合均勻，即得到質(zhì)量濃度(下同)為54 mg/L的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密移取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mL于具塞試管中，加蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6 %的苯酚溶液1.0 mL，搖勻；再迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min，放入30 ℃恒溫水浴鍋水浴加熱20 min，測(cè)定490 nm處的吸光度值，每組測(cè)3次，取平均值.空白對(duì)照組取1.0 mL蒸餾水，不加提取液，按上述同樣操作.以無水葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，490 nm處吸光度值(A)為縱坐標(biāo)作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為A=0.011 8ρ-0.004 3(R2=0.999 6)，說明無水葡萄糖在5.4～54 mg/L范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系.

2.3 紅豆杉葉中多糖提取及提取液中多糖含量測(cè)定

精確稱取4 g紅豆杉葉粉末，加入40 mL石油醚，震蕩12 h，抽濾，粉末自然風(fēng)干.以蒸餾水作提取劑，選取不同的料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、功率、溫度進(jìn)行超聲波提取，提取后過濾，合并上清液(總體積為V/mL).準(zhǔn)確量取濾液0.5 mL(剩余提取液通過濃縮，乙醇沉淀，冷凍干燥后得到粗多糖)，加蒸餾水定容至10 mL容量瓶定容，再從中量取0.5 mL于具塞試管中，加入0.5 mL蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，混勻；對(duì)照組不加提取液，加入1.0 mL蒸餾水，再按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定方法，測(cè)定490 nm處的吸光度值，每組測(cè)3次，求取平均值.根據(jù)線性回歸方程由吸光度計(jì)算出提取液中多糖含量，并按公式(1)進(jìn)行多糖得率的計(jì)算.

紅豆杉多糖得率(質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%)=

f·V·ρ0×100/(4.0×106)

(1)

其中：ρ0=ρ×40；ρ0為提取液中葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/L；ρ為稀釋后的質(zhì)量濃度，mg/L；f為換算因子0.9；V為提取液總體積，mL.

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 料液比對(duì)多糖得率的影響

按2.3所述方法，選取超聲波功率120 W，溫度50 ℃，提取3次，每次40 min，考察不同料液比(質(zhì)量體積比/g∶mL，下同)1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30對(duì)多糖提取得率的影響.

2.4.2 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

按2.3所述方法，選取料液比1∶25，提取溫度50 ℃，超聲波功率120 W，提取3次，考察不同提取時(shí)間20、30、40、50、60 min對(duì)多糖提取得率的影響.

2.4.3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

按2.3所述方法，選取料液比1∶25，提取時(shí)間40 min，超聲波功率120 W，提取3次，考察不同提取溫度20、30、40、50、60 ℃對(duì)多糖提取得率的影響.

2.4.4 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響

按2.3所述方法，選取料液比1∶25，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間40 min，超聲波功率120 W，考察不同提取次數(shù)1、2、3、4、5次對(duì)多糖提取得率的影響.

2.4.5 超聲波功率對(duì)多糖得率的影響

按2.3所述方法，選取料液比1∶25，提取溫度50 ℃，提取3次，40 min/次，考察不同超聲波功率60、90、120、150、180 W對(duì)多糖提取得率的影響.

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

綜合單因素的結(jié)果，且由于提取次數(shù)是非連續(xù)變量，定為3次[14].對(duì)其余4個(gè)因素，以多糖得率為指標(biāo)，選用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，其因素、水平見表1.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1 料液比對(duì)紅豆杉葉中多糖提取得率的影響

由圖1可以看出：當(dāng)料液比由1∶5增加到1∶25，多糖得率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，此后隨著料液比進(jìn)一步增大多糖得率開始降低.這可能是由于溶劑量的增加，多糖從細(xì)胞中擴(kuò)散達(dá)到一定量[15]，已基本溶出，繼續(xù)增加溶劑的量，溶劑中溶質(zhì)的量也不會(huì)增加[16]，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而降低[15].因此選取料液比1∶25為宜.

圖1 料液比對(duì)多糖得率的影響

Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides yield

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)紅豆杉葉中多糖提取得率的影響

提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響如圖2所示.由圖2可以看出：隨著提取時(shí)間的增加，多糖得率先增加后降低，在50 min時(shí)達(dá)到最大值.在20～30 min內(nèi)，多糖得率顯著升高；進(jìn)一步延長至50 min，多糖得率增長較??；超過50 min，多糖得率開始降低.這可能是由于長時(shí)間加熱導(dǎo)致部分易分解多糖水解，多糖得率降低，因此選擇適宜的超聲波輔助提取時(shí)間為50 min.

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharides yield

3.1.3 提取溫度對(duì)紅豆杉葉中多糖提取得率的影響

由圖3可看出：當(dāng)溫度不斷升高，紅豆杉葉中多糖的提取得率也不斷上升.20～30 ℃多糖得率增加緩慢；在30～50 ℃隨著提取溫度升高，多糖得率顯著增大；溫度繼續(xù)升高，得率增加又趨于平緩.考慮到過高的溫度不僅增加能耗，還造成提取溶劑大量蒸發(fā)，影響提取效果，且可能導(dǎo)致部分多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞使多糖得率降低，因此，提取溫度選擇50 ℃為宜.

圖3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

Fig.3 Effect of extraction temperature on polysaccharides yield

3.1.4 提取次數(shù)對(duì)紅豆杉葉中多糖提取得率的影響

由圖4可以看出：隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率不斷提高.從1次增加到3次，多糖得率顯著增加，進(jìn)一步增加提取次數(shù)，得率增加趨于平緩.綜合考慮溶劑成本、能耗和實(shí)驗(yàn)效率，實(shí)驗(yàn)提取3次為宜.

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響

Fig.4 Effect of extraction times on polysaccharides yield

3.1.5 超聲功率對(duì)紅豆杉葉中多糖提取得率的影響

由圖5可看出：隨著超聲功率的增大，多糖得率先增加后降低.從60～150 W，隨著超聲功率的增大，多糖得率隨之增大；當(dāng)超聲波功率達(dá)到150 W時(shí)，紅豆杉多糖提取得率達(dá)到最大值，進(jìn)一步增加超聲波功率，多糖得率開始下降.這可能是由于功率過高，超聲波空化、震蕩作用增強(qiáng)[17]，導(dǎo)致一些多糖結(jié)構(gòu)被破壞，且一些非目標(biāo)成分大量擴(kuò)散到提取劑中，多糖溶解量相對(duì)減少[18]，多糖得率相應(yīng)降低.因此，選擇超聲波功率150 W為宜.

圖5 超聲功率對(duì)多糖得率的影響

Fig.5 Effect of ultrasonic wave power

on polysaccharides yield

3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按表1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)編號(hào)同時(shí)做3組平行實(shí)驗(yàn)，多糖得率以3組平均值計(jì)，結(jié)果如表2所示.從表2中極差R可以看出：各因素對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)榱弦罕?提取溫度>超聲功率>提取時(shí)間；最佳提取條件為A1B1C2D2，即料液比1∶20，提取時(shí)間40 min，提取溫度50 ℃，超聲波功率150 W.方差分析(見表3)結(jié)果表明，料液比對(duì)東北紅豆杉葉中多糖提取得率有顯著影響.

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9(34)

表3 方差分析表

注:F0.05(2，2)=19；*表示差異具有顯著性；P<0.05.

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中未出現(xiàn)正交最優(yōu)組合，因此需進(jìn)一步驗(yàn)證正交最優(yōu)工藝的可靠性[14].準(zhǔn)確稱取4.0 g紅豆杉粉末3份，分別按照單因素和正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4.

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表4結(jié)果表明，正交最優(yōu)工藝條件下多糖平均得率為7.49 %，高于單因素最優(yōu)工藝得率6.83 %，同時(shí)也高于正交實(shí)驗(yàn)表中結(jié)果，因此選擇的最優(yōu)工藝條件可行.

4 不同提取方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

為比較不同提取方法對(duì)紅豆杉葉中多糖提取效果的影響，以多糖得率為指標(biāo)，將超聲波輔助提取與熱水回流提取和微波輔助進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn).其中微波輔助提取條件為：料液比1∶20，微波功率300 W，間隔3 min后再輻射1 min，如此直至微波輻射時(shí)間達(dá)5 min，提取2次；熱水回流提取條件為：料液比1∶25，90 ℃，提取150 min，提取2次.對(duì)比結(jié)果見表5.

表5 不同提取方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

由表5可知：不同提取方法提取紅豆杉葉中多糖，其提取得率有較大差異：熱水回流提取和超聲波輔助提取多糖得率明顯高于微波提取，分別高1.54 %和1.16 %，且微波提取溫度難以控制[19]，而相較于熱水回流提取，超聲波提取法略低于熱水回流提取0.38 %，相差甚微.相對(duì)于熱水回流提取，超聲波輔助提取在很多方面有其優(yōu)勢(shì)：縮短了提取時(shí)間，提高生產(chǎn)效率；同時(shí)提取溫度50 ℃較為溫和，避免多糖結(jié)構(gòu)遭到高溫破壞，且降低了能耗，大大降低了生產(chǎn)成本.綜合考慮，認(rèn)為在多糖得率相差較小的情況下，超聲波輔助提取是一種較理想的提取方式[20].

5 結(jié) 論

超聲波輔助提取具有提取時(shí)間縮短，能耗低，提取效率高；萃取溫度低，不會(huì)破壞具有熱不穩(wěn)定、易水解或氧化特性的有效成分；常壓操作，工藝簡(jiǎn)易安全，設(shè)備投資低[12]，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn).該研究采用苯酚-硫酸法測(cè)定提取液中多糖含量，通過超聲波輔助提取東北紅豆杉葉中多糖的單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定了最優(yōu)工藝條件：料液比為1∶20，在50 ℃、150 W條件下輔助提取3次，每次提取40 min，該條件下多糖得率可達(dá)7.49 %.

研究比較了熱水回流提取、微波輔助提取和超聲波提取3種不同提取方法.結(jié)果表明：熱水回流提取多糖得率最高(7.87 %)，超聲波輔助提取次之(7.49 %)，微波提取最低(6.33 %).但相較于微波提取溫度難以控制，熱水回流提取效率低、能耗高等缺點(diǎn)，超聲波輔助提取依舊具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：超聲波空化作用使植物細(xì)胞壁破裂，振動(dòng)作用加速了紅豆杉中有效成分的擴(kuò)散、溶出；提取過程常壓操作，無需高溫，有效地避免多糖的分解及結(jié)構(gòu)破壞[8].該實(shí)驗(yàn)以紅豆杉枝葉為原料，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)東北紅豆杉葉多糖的高效、快速提取，為進(jìn)一步綜合利用紅豆杉資源提供一定的研究基礎(chǔ)，而且避免了對(duì)紅豆杉這一珍貴藥用資源的破壞.但對(duì)于凍干所得粗多糖中多糖含量的測(cè)定，還需要進(jìn)一步的研究.

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Ultrasonic Assisted Extraction of Taxus Polysaccharides from Taxus Cuspidate Leaves

SHI Da-jun， ZHANG Wan-zhong

(Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110142， China)

The process of ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from Taxus cuspidate leaves was studied.Through single factor and orthogonal experiment，the influences of solid-liquid ratio，extraction time，temperature，extraction times and ultrasonic power on the polysaccharides yield were investigated.The results showed that under the conditions of solid-liquid ratio 1∶20，extraction time 40 min，extraction temperature 50 ℃，ultrasonic power 150 W，three times extraction，polysaccharides yield could reach 7.49 %.This process，which was advantageous evidently，can shorten the extraction time and lower the energy cost.It provided the theoretical foundation of production process of Taxus cuspidate polysaccharides.

taxus cuspidate; polysaccharides; ultrasonic assisted extraction; yield

2014-10-26

石大駿(1990-)男，安徽安慶人，碩士研究生在讀，主要從事生物化工方面的研究.

張萬忠(1968-)男，安徽宿州人，教授，博士，主要從事化學(xué)工程及資源綜合利用方面的研究.

2095-2198(2016)04-0316-06

10.3969/j.issn.2095-2198.2016.04.007

R914.4

A