利用GoldenGate分析的高通量SNP芯片對鯉基因進行分型

張曉峰，鄭先虎，匡友誼，李超，魯翠云，孫效文

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

利用GoldenGate分析的高通量SNP芯片對鯉基因進行分型

張曉峰，鄭先虎，匡友誼，李超，魯翠云，孫效文

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

單核苷酸多態(tài)性（SNPs）標記在大多數(shù)物種基因組中數(shù)量巨大且分布均勻，是許多水產(chǎn)物種遺傳研究的理想標記，因此快速發(fā)展了幾種高通量、快速的SNP標記分型平臺。本研究利用GoldenGate分析技術(shù)對鯉Cyprinus carpio轉(zhuǎn)錄組測序的1 536個SNP標記合成了一張中等密度SNP芯片，對5個鯉群體的480份樣本進行基因分型。結(jié)果表明：1 235個SNP標記成功分型，約占80%；915個標記至少在一個家系中呈現(xiàn)多態(tài)性，占74.1%；標記最小等位基因頻率（MAF）介于0.05～0.5之間，平均為0.334，其中48.9%的標記最小等位基因頻率（MAF）大于平均值；5個群體中SNP標記平均多態(tài)性信息含量（PIC）在0.3左右，為中度多態(tài)，雜合度為0.010～0.990，平均為0.5左右，暗示群體具有豐富的遺傳多態(tài)性，育種價值及性狀改良潛力很大。本研究分型的多態(tài)性SNP標記可廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性研究、標記-性狀關(guān)聯(lián)分析以及分子標記輔助育種。

單核苷酸多態(tài)（SNP）；鯉；遺傳多樣性；GoldenGate分析；高通量

隨著各種分子標記技術(shù)的應(yīng)用，在過去20多年中鯉Cyprinus carpio遺傳研究得到快速發(fā)展。應(yīng)用比較廣的標記有基于雜交技術(shù)的RFLPs[1]（Restriction fragment length polymorphism）標記和基于PCR技術(shù)的SSRs[2]（Microsatellite polymorphism）標記。理想的分子標記系統(tǒng)應(yīng)數(shù)量巨大且在基因組中分布均勻、共顯性、準確率高而且適合低成本高通量基因分型。盡管RFLP和SSR標記具備很多優(yōu)點，但大規(guī)模基因分型成本還非常高。最近，從全基因組測序開發(fā)的SNP（Single nucleotide polymorphism）標記能大規(guī)模分型，而且成本低廉，成為具備上述優(yōu)點的新選擇[3-5]。

SNP標記作為遺傳標記被廣泛應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、標記性狀相關(guān)分析及標記輔助選擇等。SNP標記分型方法也很多，大約30多種應(yīng)用于不用物種不同樣本[6]。近年來，還開發(fā)出幾種高通量SNP標記的分型平臺，尤其是Illumina公司的兩種SNP標記基因分型平臺，一種為GoldenGate分析，應(yīng)用于中等密度的基因分型，每批分析包括96～1 536個標記；另一種為高密度基因分型，每次分析高達百萬個標記[7]。微陣列通過每一次單獨檢驗所需的平均時間最小化，使每一陣列上能同時進行的實驗數(shù)最大化來實現(xiàn)檢測能力的最大化，也使實驗樣品/試劑和其他消耗品的需要量最小化，是高通量大規(guī)模研究中的首選技術(shù)。用這樣的微陣列做基因分型只需極少量的DNA樣品和試劑。GoldenGate技術(shù)是一種高通量、自動化的檢測SNP的手段，為SNP標記快速及高通量檢測和開發(fā)提供了有效途徑，而且使得SNP標記在研究親本間親緣關(guān)系以及遺傳多樣性方面展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。該技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于人[8]、農(nóng)作物如玉米[9]、大豆[10]、大麥[11]、菜豆[12]等遺傳圖譜構(gòu)建、標記和性狀連鎖不平衡分析中，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中尚未得到應(yīng)用。

生物遺傳多樣性是進化和適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)，群體的遺傳多樣性越豐富，適應(yīng)環(huán)境變化的能力就越強；而遺傳多樣性的喪失，對生存于不穩(wěn)定環(huán)境中的動物群體是極大的威脅。分析鯉不同養(yǎng)殖群體的進化關(guān)系和遺傳多樣性有助于保持各優(yōu)良品種的優(yōu)勢基因，對鯉育種群體的進一步應(yīng)用和開發(fā)具有十分重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

本研究利用GoldenGate分析系統(tǒng)分析5個鯉育種群體480份樣本的遺傳多樣性，從分子水平上分析各群體基因頻率、基因的多樣性、雜合度等方面的差異，比較5個群體間的遺傳變異、遺傳距離，為客觀評價和合理利用各育種群體的遺傳資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GoldenGate芯片設(shè)計及SNP來源

本實驗SNP標記序列來自鏡鯉高通量轉(zhuǎn)錄組測序，采用SNP分析軟件QualitySNP鑒定候選SNP[13]。該軟件包核心程序包含兩個應(yīng)用程序：即CAP3[14]和HaploSNPer[15]，前者用于序列聚類，后者用于序列比對。為提高所鑒定候選SNP的可靠性，本研究對軟件的參數(shù)設(shè)置比較嚴格，其中相似性（Similarity）＞95%，E值（E-value）＜1e-60，每個單倍型（Haplotype）至少包含兩條序列，即包含EST序列數(shù)量至少為4的重疊群才被用來確定候選SNP。

選擇置信度的1 536個SNP標記用于設(shè)計OPA（Oligopool assay）寡核苷分析芯片。選擇design score大于0.6的SNP位點，1 536個標記均勻分布在鯉50條染色體上。探針序列、芯片制作流程及芯片雜交實驗、芯片設(shè)計與制作委托illumina公司完成。設(shè)計制作1 536個位點的SNP芯片5個SAM板（5×96，每個SAM板可以上96個樣品）。

1.2 家系來源

5個鯉群體是松浦鏡鯉混合家系（P1）、松浦鏡鯉單家系2（P2）、柏氏鯉/荷包紅鯉抗寒品系雜交F1（P3）、柏氏鯉/荷包紅鯉抗寒品系的雌核發(fā)育群體（P4）以及柏氏鯉/荷包紅鯉抗寒品系回交家系（P5）（表1）。采用QIAampDNA Blood Midi Kit試劑盒，參照標準流程提取各家系樣本血液的DNA。

1.3 SNP基因分型

SNPs標記的基因分型由上海博豪生物芯片有限公司采用Illumina Bead Station 500G平臺，采用程序參考Fan等[16]。每個樣本最小DNA提供為50ng*5μL，分型前檢測每個DNA質(zhì)量。用DNAClean&ConcentratorTM-5RNA進行純化，純化后的DNA用NanoDrop紫外分光光度計進行定量和電泳檢測合格后，進行GoldenGate分型實驗。將全部480份樣本分成 5個獨立的 Sentrix Array Matrices（SAMs），每組96個樣本。所有的SNP數(shù)據(jù)使用Illumina BeadStudio基因分型軟件讀取和自動分析，只有那些可靠的標記保留下來作進一步的后續(xù)分析。數(shù)據(jù)分析之前，手工重新檢測SNP標記，剔除錯誤分型。

1.4 基因型數(shù)據(jù)分析

用Powermarker3.25軟件[17]分析了等位基因數(shù)量、最小等位基因頻率（MAFs）基因多樣性和多態(tài)性信息含量（PIC）。用Strucure2.3.4[18，19]軟件分析群體遺傳結(jié)構(gòu)。用 MEGA4軟件[20]中的鄰接法[21]（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建群體間進化樹，可靠性經(jīng)過1000次（Bootstrap）檢驗。進化樹采用在線作圖軟件[22]（http://www.evolgenius.info/evolview.html）完成。

表1 鯉樣本的名稱、數(shù)量及親本來源Tab.1 The sample name,quantity and genetic background in common carp

表2 5個群體間相同多態(tài)性標記數(shù)比較Tab.2 Comparison of same SNPs among the 5 populations

圖1 SNP頻率統(tǒng)計Fig.1 Frequency of SNPs

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP分型結(jié)果

用BeadStudio分型軟件自動分析SNP標記，本研究的1 536個SNP標記在480分樣本中有1 235個SNP標記的call frequency在90%以上，分型成功率在80%以上，手工檢測剔除基因分型錯誤的標記比率為 0.9%。其中 915個標記呈現(xiàn)多態(tài)性（74.1%），用來進行后續(xù)遺傳分析。

不同群體中基因頻率的分布情況：915個多態(tài)性SNPs標記最小等位基因頻率（MAF）值分布圖，所有的標記MAF值介于0.05～0.5之間，平均為0.334，其中48.9%的標記MAF值大于平均值（圖1）。

2.2 群體間多態(tài)性標記比較

表2為5個群體多態(tài)性標記數(shù)量，多態(tài)性SNP標記數(shù)量由高至低依次為：P1（452個）、P2（383）、P5（315個）、P3（250個）及P4（173個）。P1群體樣本量最大（183個），其多態(tài)性標記最多；P4樣本數(shù)量最少（44個），多態(tài)性標記數(shù)也最少。暗示群體樣本數(shù)量增加，多態(tài)性標記數(shù)量也增多。表2中列出5個家系兩兩比較家系間相同標記的數(shù)量，其中P1與P2之間相同多態(tài)性標記最多，為283個（占62.6%）；其次是P1與P5群體，為209個（占46.2%）；P1與P3和P4兩個群體之間相同標記數(shù)較少。P2與P1群體之間相同的標記數(shù)最多，為283個，占P2總數(shù)的73.9%；其次是P2與P5群體，為176個，占46.0%，P2與P4最少，僅有85個，占22.2%。而P3則與來源相同家系的P5和P4群體較多，分別為151個（60.4%）和130個（52.0%）；P4群體與P3最多，為130個（75.1%），而與鏡鯉單家系P2群體最少，為85個（49.1%）。P5與P1相同標記數(shù)較多，與P4相同標記數(shù)最少，P2和P3介于二者之間。

2.3 群體遺傳多樣性分析

將獲得的915個SNP標記進行群體遺傳多樣性分析，用Structure軟件估算不同群體最小等位基因頻率（MAF）、基因多樣性指數(shù)、雜合度及多態(tài)信息含量（PIC）（表3）。五個群體中P4群體的平均最小等位基因頻率最大，為0.398，其次為P3（0.352）、P5（0.340）和P2（0.313），P1最小，為0.267；群體內(nèi)平均基因分化系數(shù)變化趨勢也是P4（0.444）、P3（0.429）和P5（0.429）最大，然后是P2（0.417），P1（0.353）最低；雜合度及多態(tài)性信息含量的變化趨勢同基因多樣性指數(shù)的變化規(guī)律基本一致，均是鏡鯉混合家系P1群體最低，P4群體最高，其他群體介于這二者之間。由圖2可見，915個SNP標記的最小等位基因頻率變化范圍為0.05～0.50，這些標記的基因多樣性指數(shù)、雜合度及多態(tài)信息含量變化范圍分別為0.010～0.672、0.010～0.990和0.010～0.591。

表3 5個群體的遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity in the five population

圖2 915個SNP標記在5個群體的箱形統(tǒng)計圖Fig.2 Box and Whisker box of summary statistics for 915 SNPs in the five populations

表4 5個鯉群體的Nei's遺傳距離Tab.4 Nei’s distance in five populations of common carp

圖4 5個群體親緣關(guān)系進化樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of five populations

2.4 群體結(jié)構(gòu)和遺傳聚類

采用STRUCTURE軟件分析群體結(jié)構(gòu)，以檢測不同群體的起源。對于每個給定亞群數(shù)k值（k=2～8），LnP（D）值隨著k值的增加而增加（圖3-a）。用二階似然檢測估算△k值，當k=2時，△k值明顯高于k=3～8；△k值從2增加到4時，急劇下降。當k=3時顯著高于k=4時，因而，k=2和k=3可以作為兩個最有可能的亞群數(shù)量。圖3-b中列出了當k值取2、3和4時，群體的分離情況。第一個聚類水平，即當k=2時，反映了所有個體最原始的分離。起源同一祖先的個體發(fā)生了分離，德國鏡鯉和中國鯉反應(yīng)了品種之間的地域差異。當k=3時，分離出另外一個小的亞群。當k值增加到4時，更小的亞群進一步分裂，越來越多的個體暗示混合祖先。

由表4可看出，5個群體的遺傳距離變化在0.0341～0.2185之間，其中P1和P2、P3和P4群體之間的遺傳距離最近，說明它們的相似性最高；P1群體與P3群體之間的遺傳距離最大，說明它們親緣關(guān)系最遠。

為了能夠更直觀地體現(xiàn)出群體間的關(guān)系，利用NJ（neighbor-joining）法對5個群體進行了聚類分析。聚類圖4表明，P1和P2兩個群體的鏡鯉大部分個體聚在一起，其親緣關(guān)系較近，而具有柏氏鯉和荷包紅鯉血緣的P3、P4和P5三個群體聚在一起。有趣的是，P2群體的一小部分個體與P5群體聚在一起，說明它們之間有較近的親緣關(guān)系，這些個體親本間發(fā)生了遺傳物質(zhì)的滲入。

圖3 群體結(jié)構(gòu)分析圖Fig.3 Analysis of the population structure in the five populations of common carp

3 討論

目前，許多重要動植物都進行了全基因組測序，可以大規(guī)模地獲得所有目標性狀關(guān)聯(lián)的侯選基因的SNP標記。更為重要的是，隨著SNP檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，SNP標記可以自動化的高通量檢測和分析[7,23,24]。與以往常用的低通量傳統(tǒng)檢測方法，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性[25]、酶切擴增多態(tài)性[26]、高分辨率溶解曲線[27]等相比，SNP芯片技術(shù)是一種高效的檢測SNP的手段。本研究采用中等密度SNP芯片來基因分型技術(shù)，即GoldenGateTMprotocol是一種依靠寡核苷酸對SNP位點等位基因的專一性來進行延伸和PCR擴增的方法，能同時檢測1 500多個SNP位點；與其他技術(shù)平臺類似的步驟相比，GoldenGate所需時間、體系和材料最小化，以更少的花費更快地得到非常準確的結(jié)果。

多種標記如SSR、線粒體基因等已應(yīng)用于不同鯉養(yǎng)殖群體、野生群體等遺傳結(jié)構(gòu)分析研究中[28,29]。本研究首次采用SNP標記分析鯉育種群體遺傳多樣性。群體間遺傳關(guān)系一般表現(xiàn)為以等位基因頻率計算的兩兩群體間的遺傳距離。本研究采用Nei’s遺傳距離計算公式分析5個鯉群體的平均遺傳距離，鏡鯉家系間遺傳距離較近，鏡鯉與柏氏鯉/荷包紅鯉之間遺傳距離較遠。這說明來源相同的群體之間，親緣關(guān)系較近；反之，親緣關(guān)系較遠。

群體平均基因雜合度高低反映了群體遺傳一致性的程度，是群體雜合程度的度量單位。群體平均基因雜合度越低，該群體的遺傳一致性越高，也就是群體的遺傳變異越少，群體的遺傳多樣性越差[30]。本研究的5個鯉群體的基因雜合度變動在0.010～0.990之間，平均為0.5左右，與全迎春等[31]和王洪哲[32]用微衛(wèi)星標記檢測的黑龍江鯉、散鱗鏡鯉、荷包紅鯉抗寒品系、松浦鯉群體的研究結(jié)果基本一致。根據(jù)哈特-溫伯格定理，雜合度在0.5左右的群體處于Hard-Weinberg平衡狀態(tài)，具有豐富的遺傳多態(tài)性。遺傳多樣性是保持種群優(yōu)良性狀的前提，遺傳多樣性越高，育種價值及性狀改良的潛力也就越大。

平均多態(tài)信息含量（PIC）是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標，當PIC＞0.5時，該座位為高度多態(tài)性座位；當0.25＜PIC＜0.5時，該座位為中度多態(tài)性座位；當PIC＜0.25時，該座位為低度多態(tài)性座位。在本研究中，5個群體的SNP位點多態(tài)性信息含量在0.3左右，均為中度多態(tài)，稍低于微衛(wèi)星標記多態(tài)信息含量[33]。其原因是SNP標記有效等位基因數(shù)少，這可能和SNP是二等位多態(tài)性標記有關(guān)。

本試驗結(jié)果表明，與以往分子標記相比，利用SNP標記估算鯉群體間的遺傳距離可取得同樣的效果，但以往的分子標記試驗比較繁瑣，試驗周期長，效率低，而本試驗采用SNP芯片技術(shù)，縮短了試驗周期，提高了試驗效率，估算鯉群體基因型分型及遺傳距離的優(yōu)勢較為明顯。

總之，SNP芯片是一種集高通量、高集成、微型化和自動化等優(yōu)點為一體的檢測SNP的手段，為SNP標記更為廣泛地應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、標記與性狀之間的關(guān)聯(lián)分析、數(shù)量性狀定位及分子標記輔助選擇等提供了必要的技術(shù)支持，并且隨著SNP芯片的推廣，成本越來越低，必將為鯉分子育種研究帶來新的突破。

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High-throughput SNP Genotyping in Common Carp（Cyprinus carpio L.）by GoldenGate Assay

ZHANG Xiao-feng,ZHENG Xian-hu,KUANG You-yi,LI Chao,LU Cui-yun,SUN Xiao-wen
（National and Local United Engineering Laboratory for Freshwater Fish Breeding,Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

Single nucleotide polymorphisms（SNPs）are abundant and evenly distributed throughout the genomes in most species,and become an ideal marker system for genetic research in many aquatic species.Several high throughput platforms have been developed that allow rapid and simultaneous genotyping of up to a million SNP markers.In this study,a custom GoldenGate assay containing 1 536 SNPs was developed based on public SNP information for common carp（Cyprinus carpio）and used to genotype in five breeding populations of common carp.Over 80%of the SNPs were shown to be successfully scored in the population diversity in 480 samples,with a genotyping error rate of less than 1%.The polymorphism was detected in at least one of the five panels in a total of 915 SNP markers,accounting for 74.1%.The minor allelic frequency（MAF）was distributed evenly across 10 continued classes from 0.05 to 0.5,and about 48.9%of the SNP markers had a MAF above the average 0.334 in the diversity panel.The polymorphic information content（PIC）of polymorphism loci was varied from 0.010 to 0.591,with an average PIC of about 0.3 in five populations of common carp.The average observed heterozygosity was ranged from 0.010 to 0.990 in five populations,with an average of about 0.5,indicating that the five populations have abundant genetic diversities and high breeding value improvement,and that most polymorphism SNPs genotyped in this GoldenGate assay appear to be equally useful for diversity analysis,marker-trait association studies,and marker-aided breeding.

single nucleotide polymorphism（SNP）;common carp;genetic diversity;GoldenGate assay;high-throughput

S917

A

1005-3832（2016）06-0019-07

2014-09-12

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本業(yè)務(wù)費重點項目（2016ZD0301）；農(nóng)業(yè)部“948”計劃項目（2016-X15）.

張曉峰（1973-），副研究員，博士，從事水產(chǎn)基因組研究.E-mail:zhangxf.yu@163.com

孫效文（1955-），研究員，博士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)分子育種研究.E-mail:sunxw2002@163.com