微生物介導厭氧甲烷氧化反硝化過程及其反應機制探討

陳黃曌　魯　荔　余海尤　鄧曉旭　潘春梅*

（1河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院河南鄭州4500462廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所廣東廣州510650）

微生物介導厭氧甲烷氧化反硝化過程及其反應機制探討

陳黃曌1魯荔2余海尤1鄧曉旭1潘春梅1*

（1河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院河南鄭州4500462廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所廣東廣州510650）

微生物進行的厭氧甲烷氧化反硝化過程是減少自然環(huán)境中甲烷這一溫室氣體排放的重要生物途徑，即反硝化型甲烷厭氧氧化(denitrifying anaerobic methane oxidation，DAMO)。反硝化型甲烷厭氧氧化是指在厭氧條件下以甲烷作為電子供體，NO2-/NO3-作為電子受體的反硝化過程。Candidatus Methylomirabilis oxyfera細菌和Candidatus Methanoperedens nitroreducens古菌是參與DAMO過程的2類主要功能微生物。深入了解微生物介導的DAMO的發(fā)生機理以及影響因素，有助于更好地理解碳氮耦合在生物地球化學循環(huán)中發(fā)生的重要作用，為DAMO工藝的開發(fā)與應用提供理論依據(jù)。本文從功能微生物的富集、影響因素、生理特性、生物代謝與反應機制等方面對DAMO的最新進展進行闡述，并探討了DAMO未來的研究方向與應用前景。

反硝化型甲烷厭氧氧化（DAMO）碳氮耦合；反應機制Candidatus Methylomirabilis oxyfera

甲烷是一種重要的溫室氣體，等物質(zhì)量的CH4所引起的溫室效應是CO2的23倍，在全球氣候變暖中“貢獻”了約20%[1]。眾所周知，濕地是甲烷的重要排放源，占所有天然甲烷排放源的70%，占全球甲烷通量的20%左右[2]。同時，濕地也是氮素的源、匯或轉(zhuǎn)換器，能夠截留和過濾大量陸源氮素污染物，具有“自然之腎”之稱[3]。微生物是自然生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在氧化-還原交替作用下，參與碳氮等關(guān)鍵元素的生物地球化學循環(huán)過程，對濕地生態(tài)系統(tǒng)碳氮形態(tài)轉(zhuǎn)化遷移、能量流動和維系碳氮生態(tài)平衡方面發(fā)揮不可替代的作用[4]。微生物是自然界中甲烷的主要生產(chǎn)者，其貢獻率高達69%，但是大部分甲烷在到達大氣圈之前已被消耗，例如濕地產(chǎn)生的50%的甲烷會被消耗掉[2]。這種重要的微生物引起的甲烷匯通常被認為只與需氧的甲烷營養(yǎng)細菌有關(guān)，它們可以利用氧氣作為電子受體來消耗甲烷[3]。在生態(tài)系統(tǒng)中，當氧氣消耗殆盡，甲烷也可以在厭氧條件下轉(zhuǎn)化[5]。因此，微生物甲烷厭氧氧化是地球上甲烷減少的重要途徑之一。

甲烷的厭氧氧化耦合硫酸鹽還原的這一過程已被證實是控制海洋甲烷排放的重要途徑，在海洋碳循環(huán)中發(fā)揮著不可替代的作用。但是根據(jù)化學反應熱力學預測，厭氧條件下NO2-/NO3-更容易成為微生物介導的甲烷厭氧氧化的電子受體，即反硝化型甲烷厭氧氧化（Denitrifyinganaerobicmethaneoxidation,DAMO）過程[5]。

作為碳氮循環(huán)的重要橋梁，深入了解DAMO過程及其生物學機制對加深全球碳氮循環(huán)的理解具有重要意義。本文簡要總結(jié)了幾年來國內(nèi)外關(guān)于微生物介導的反硝化型甲烷厭氧氧化過程的研究進展，闡述了DAMO功能的生物學機制以及影響因素等，并探討了DAMO過程在污水生物脫氮中的應用以及未來研究發(fā)展方向。

1　DAMO微生物——連接碳循環(huán)和氮循環(huán)的重要橋梁

微生物催化的DAMO過程耦合了碳氮代謝，是連接碳氮循環(huán)的紐帶，目前對該方面的研究尚處于初級階段。上世紀70年代，Mason等[5]試圖分離和富集具有DAMO功能的微生物，但未成功。此后較少的研究也僅限于對發(fā)現(xiàn)DAMO過程這一現(xiàn)象地描述，但對于哪些微生物在該現(xiàn)象中發(fā)揮重要功能依然是未知數(shù)。直到2006年，Raghoebarsing等[6]發(fā)現(xiàn)海洋沉積物中的甲烷含量急劇下降，首次認識到甲烷的減少可能是由微生物介導甲烷厭氧消耗所造成的。研究者們利用富集培養(yǎng)，第一次證實甲烷氧化可以耦合亞硝酸鹽還原，該生物過程被稱之為亞硝酸鹽型甲烷厭氧氧化（Nitrite-dependent anaerobic methane oxidation，N-DAMO）。Raghoebarsing團隊應用同位素標記研究發(fā)現(xiàn)負責催化DAMO反應的微生物主要是NC10門細菌和進化關(guān)系遠離的ANME-2（甲烷厭氧氧化菌）古菌。

系統(tǒng)發(fā)育樹表明，NC10門細菌屬于非培養(yǎng)的、只能通過環(huán)境基因序列定義的新亞門。古菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上的地位介于ANME-2和甲烷絲狀菌(Methanosaeta)之間。FISH探針檢測到這兩類功能微生物的存在：NC10門細菌呈細桿狀、1μm長、0.3μm寬、DNA聚集在細胞的中心；古菌呈球形、聚集成3～6μm的圓形[6]。2009年，Hu等[7-8]同樣發(fā)現(xiàn)上述細菌和古菌參與了DAMO，并認為NO2－是NC10細菌生長的關(guān)鍵選擇因子。與上述發(fā)現(xiàn)不同，Ettwig等[9-11]認為DAMO反應可單獨由NC10細菌完成，運用宏基因組測序組裝分析，將這株優(yōu)勢細菌命名為‘Candidatus Methylomirabilis oxyfera’。2013年，Mohamed等[12]富集培養(yǎng)到一個可催化DAMO反應的ANME-2的單個種群，將該古菌群命名為Candidatus‘Methanoperedens nitroreducens’，歸屬于Methanoperedens科，它是一種直徑1～3μm的不規(guī)則球菌，通常以類似八疊球菌的族群方式存在，中溫(22～35℃)、pH 7.0～8.0條件下生長。至此，這些研究為參與DAMO過程中的微生物揭開神秘面紗。但是，受環(huán)境樣品純培養(yǎng)分離技術(shù)條件的限制，導致只能反映極少數(shù)DAMO微生物的信息，不能充分反映特定生態(tài)系統(tǒng)DAMO微生物的整體活動藍圖。

國內(nèi)學者對DAMO微生物的研究起步較晚，研究基礎(chǔ)較為薄弱，且多集中于DAMO微生物的富集與檢測研究[13-17]。Yang等[13]利用特定引物，在中國兩個天然鹽湖的表面沉積物中，發(fā)現(xiàn)了N-DAMO和厭氧氨氧化細菌的存在。蔡琛[14]采用厭氧產(chǎn)甲烷顆粒污泥、農(nóng)田水稻土壤和淡水河道沉積物作為接種物，成功富集培養(yǎng)了DAMO微生物NC10門細菌。Shen等[15-17]在中國東海椒江流域和錢塘江流域采用分子生物學技術(shù)也檢測到N-DAMO微生物。

近年來，我國溫室氣體減排壓力增大，氮素污染已不容忽視，而DAMO過程是最新的耦合碳氮循環(huán)的發(fā)現(xiàn)之一，具有很好的環(huán)保優(yōu)勢和經(jīng)濟優(yōu)勢。所以，有必要對催化DAMO的微生物進行更為深入的探索研究，以期為甲烷的資源化利用、氮素污染地深度脫除提供理論和實踐基礎(chǔ)，同時也豐富了國內(nèi)碳氮循環(huán)耦合研究的理論基礎(chǔ)。

2　DAMO微生物的分布特性與生長影響因子研究

DAMO過程受許多物理、化學和生物因子等外界條件的影響。目前該領(lǐng)域的研究者已從許多的自然生境中富集或檢測到DAMO微生物，例如，溝渠沉積物[5]，廢水活性污泥[7-8]，鹽水湖沉積物[13]及水稻土壤[14]，湖泊與河口沉積物[16-17]等。Katharina[5,9-10]利用溝渠底泥為接種物進行富集培養(yǎng)，從而檢測到相當數(shù)量的NC10門細菌和古菌。蔡琛[14]首先在土壤中檢測到反硝化型甲烷厭氧氧化微生物并對其進行了富集培養(yǎng)。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，16S rRNA和pmoA基因分子生物標記被用于確認NC10門細菌有關(guān)M.oxyfera細菌及其多樣性的檢測[17]。研究表明，16S rRNA和pmoA基因分子生物標記檢測到活性污泥、湖泊河口沉積物人工濕地也是DAMO微生物適合生存的環(huán)境[14,16]。綜上，DAMO微生物多分布于淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)，群落結(jié)構(gòu)與豐度存在一定空間差異。然而對于其他環(huán)境DAMO微生物分布特征還不清楚，并且DAMO微生物隨時間和空間二者梯度的變化會有怎樣的響應也有待于進一步研究。

由于DAMO微生物在天然環(huán)境中活性較低，并受多種外界因子的影響，對該過程的機理探索可以借助富集培養(yǎng)來實現(xiàn)。前期學者研究證明了不同的電子受體（NO3-和NO2-）、培養(yǎng)溫度等都會對DAMO微生物菌群具有選擇性，不同程度影響DAMO活性[7-9,14]。

電子受體（NO3-和NO2-）對DAMO微生物群落結(jié)構(gòu)具有直接影響。Hu等[7-8]研究比較了這兩種電子受體后發(fā)現(xiàn)，以NO3-為電子受體的富集培養(yǎng)物具有穩(wěn)定的DAMO微生物群落結(jié)構(gòu)和DAMO活性；以NO2-為電子受體的富集培養(yǎng)相對較易，但是培養(yǎng)物中高于1 mmol·L-1的NO2-會對N-DAMO過程產(chǎn)生不利影響，古菌會隨著NO2-濃度的增加而減少，最后消失。以NO3-為電子受體成功富集N-DAMO的公開報道更少，富集更慢且都存在Anammox細菌或N-DAMO細菌的協(xié)同作用[9]。

不同的培養(yǎng)溫度，DAMO微生物富集培養(yǎng)的結(jié)果也會差異顯著。緯度對微生物的生物活性具有極大關(guān)系，研究表明高溫可以增加DAMO微生物的活性，但是甲烷溶解度會明顯降低，使得甲烷可獲得性降低[14]。因此，在進行溫度優(yōu)化選擇時，需要考慮這兩種因素的共同效應，才可獲得加快DAMO過程的最優(yōu)溫度條件。

3　微生物DAMO耦合反應機制研究

雖然過去十年對DAMO過程的探索已積累了可觀的研究成果，奠定了一定研究基礎(chǔ)。但由于DAMO微生物的倍增時間較長（1～2周），富集培養(yǎng)及純培養(yǎng)的分離與鑒定均比較困難，所以限制了DAMO反應機制的研究以及NC10細菌生理生化特征的揭示[9]。目前,將DAMO機制解釋比較明確的是Ettwig[11]所提出的M. oxyfera細菌催化DAMO過程的理論模型。作者對宏基因組序列進行分析組裝，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學分析，預測了涉及CH4和NO2-代謝的中心途徑，發(fā)現(xiàn)M.oxyfera具有編碼好氧甲烷氧化的全部基因，但是缺少催化完整反硝化過程所需的某些基因（編碼N2O還原酶基因）。Ettwig等利用同位素標記實驗證明M.oxyfera可以自身產(chǎn)生氧氣，并推測該菌胞內(nèi)可能存在某種酶，催化2分子的NO通過歧化反應生成O2和N2，其中3/4的O2用于進行CH4氧化。Shen等[16-17]認為在沒有氧氣源，沒有光照的情況下，DAMO的功能微生物NC10門細菌將NO2-分解為NO和O2，然后用生成的O2來氧化甲烷獲得能量，表明在植物出現(xiàn)之前細菌就已在地球上制造氧氣，彌補了地球上氧化過程“缺失的一環(huán)”。

2013年，Mohamed等[12]對古菌在DAMO過程中所扮演的重要角色加以闡釋作者利用宏基因組學、單細胞基因組學和宏轉(zhuǎn)錄組學等分子技術(shù)揭示M.nitroreducens基因組中包含完整的產(chǎn)甲烷途徑所需的mcrABCDG和mer基因，甲烷氧化為二氧化碳所需要的全部基因都高度表達。C-13同位素標記實驗證明ANME-2d通過基因水平轉(zhuǎn)移從細菌中獲得NO3-代謝相關(guān)的功能基因，以NO3-作為最終電子受體，通過反向產(chǎn)甲烷方式，進行甲烷的厭氧氧化。在NH4+存在的條件下，厭氧氨氧化細菌與M.oxyfera競爭NO2-，并占據(jù)優(yōu)勢地位，與ANME-2d通過共營模式將產(chǎn)生的NO2-還原成N2，但是無法得知古菌是否可以獨立完成硝酸鹽完全還原過程。

4　結(jié)論與展望

綜上，DAMO過程的研究還存在明顯的不足，尚需深入和完善，主要表現(xiàn)在：（1）DAMO微生物在不同生境中時間和空間分布特征尚不明確，并受CH4和NO3-/NO2-的分布數(shù)據(jù)局限，無法解釋人類活動對DAMO微生物產(chǎn)生的影響；（2）外界影響因子對DAMO微生物生長、群落結(jié)構(gòu)及活性影響的研究報道有限，尚需加強該方面的研究，以期為工程應用奠定基礎(chǔ)；（3）目前，DAMO微生物單菌分離與鑒定比較困難，無法解釋古菌和細菌在DAMO過程中各占據(jù)怎樣的地位，并且由于缺乏中間代謝產(chǎn)物的檢出及關(guān)鍵酶的分離鑒定，限制了DAMO微生物作用機制的明確闡釋。

此外，反硝化型甲烷厭氧氧化已被證實廣泛存在于各種環(huán)境中。在實際應用方面，反硝化型的甲烷厭氧氧化為污水處理脫氮工藝的設(shè)計和發(fā)展提供良好的理論基礎(chǔ)。目前，污水處理廠一般根據(jù)傳統(tǒng)硝化-反硝化原理進行脫氮，此類工藝不僅耗能，而且當進水有機物碳源不足時需要外加碳源。DAMO耦合了硝態(tài)氮還原和甲烷氧化，基于這一原理的廢水處理技術(shù)，能夠為生物脫氮提供經(jīng)濟、清潔的碳源。同時可以利用甲烷產(chǎn)生更少的N2O，減少廢水處理中溫室氣體的排放，并減少污泥的處理成本[1,11]。

總之，反硝化型甲烷厭氧氧化具有顯著的經(jīng)濟和環(huán)境效益，應深入加強反硝化型甲烷厭氧氧化的相關(guān)研究，同時也應積極開展探索和推進反硝化型甲烷厭氧氧化在污水處理中的應用研究。

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陳黃曌（1986—），男，河南鄭州，碩士研究生，助教，從事發(fā)酵微生物生理生化研究工作。