雞源大腸埃希菌的耐藥性與分子分型研究

錢曉璐，商軍*，董棟，張浩然，田愷

(1.上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040)

雞源大腸埃希菌的耐藥性與分子分型研究

錢曉璐1，商軍1*，董棟2，張浩然1，田愷1

(1.上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040)

為了解規(guī)?；B(yǎng)殖廠雞源大腸埃希菌的耐藥性以及分子流行規(guī)律和特征，為該菌的分子溯源及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)，本研究收集2013-2014 年上海地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)分離的雞源大腸埃希菌共計(jì)741株，采用微量稀釋肉湯法分別對(duì)常用的9 類13 種抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，以了解大腸埃希菌的耐藥表型。在篩選出多重耐藥嚴(yán)重的菌株后，同時(shí)采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型方法及核糖體(RP)分型方法進(jìn)行分子分型分析。結(jié)果顯示，2013-2014年所分離的雞源大腸埃希菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、大觀霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、氧氟沙星和恩諾沙星的耐藥率較高，在50 %以上，且主要為多重耐藥菌株。用XbaⅠ酶切后進(jìn)行PFGE分析，結(jié)果表明，29株雞源大腸埃希菌可分為22個(gè)帶型；EcoRⅠ酶切后的RP聚類分析結(jié)果表明，雞源大腸埃希菌分為14個(gè)帶型。雞源大腸埃希菌耐藥率較高，同一分型菌株的耐藥譜型并非完全一致，菌株基因型呈多態(tài)性。

大腸埃希菌；耐藥性；PFGE；RP分型；分子分型

大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)是人和動(dòng)物體內(nèi)的腸道常駐菌、條件性致病菌，分布十分廣泛。大腸埃希菌病是畜禽常見的一種細(xì)菌性疾病，多與病毒性疾病及其他細(xì)菌性疾病并發(fā)，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。使用抗菌藥物一直是控制大腸埃希菌病的主要措施。而近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)預(yù)防用藥的增多，多重耐藥大腸埃希菌菌株(對(duì)三類或三類以上的抗菌藥物耐藥)的出現(xiàn)已對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展構(gòu)成威脅[1-3]。由于大腸埃希菌是表示抗菌藥物耐藥性水平的一種革蘭氏陰性指示菌[4-6]，可通過食物鏈或者其他方式將其攜帶的耐藥基因傳播擴(kuò)散，因此監(jiān)測(cè)動(dòng)物源大腸埃希菌的耐藥性、探究其基因分型情況不僅有利于畜牧業(yè)的發(fā)展，還具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。為此，本研究收集2013-2014年上海地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)分離的雞源大腸埃希菌進(jìn)行研究，分別對(duì)常用的9 類13 種抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，以了解大腸埃希菌的耐藥表型，并篩選出典型的重要耐藥表型及多重耐藥嚴(yán)重的多重耐菌株，同時(shí)采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型方法[7-8]及核糖體(RP)分型方法[9]對(duì)這些多重耐藥菌株進(jìn)行基因分型分析，以探究雞源大腸埃希菌分離株的耐藥性及分子分型的現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2013年從上海地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)成雞肛門拭子采樣分離到的233株大腸埃希菌；2014年從上海地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)成雞肛門拭子采樣分離到的508株大腸埃希菌；藥敏質(zhì)控菌株，大腸埃希菌ATCC25922，脈沖場(chǎng)凝膠電泳參考菌株，沙門氏菌H9812，美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心。

1.2 儀器與試劑 Sensititre AIM全自動(dòng)菌液接種儀，美國(guó)賽默飛公司；COMPACT VITEK2微生物鑒定儀，麥?zhǔn)媳葷醿x，法國(guó)梅里埃公司；CHEF Mapper脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀，Gel Doc成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司；微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)，Heat Treatment Station，美國(guó)DuPont公司。BPH-92電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SterilgardⅢ-SG403型生物安全柜，美國(guó)Baker公司；凍干型藥敏檢測(cè)板，肉湯培養(yǎng)基，天津市金章科技發(fā)展有限公司；SeaKem Gold Agarose，十二烷基硫酸鈉(SDS)，美國(guó)Bio-Rad公司；10 ×TBE，美國(guó)Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)，乙二胺四乙酸(EDTA)，生工生物工程有限公司；蛋白酶K，XbaⅠ酶，美國(guó)Bio-Rad公司；EcoRⅠ酶，美國(guó)DuPont公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣 從上海地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)采集成雞的棉拭子樣本，置于運(yùn)送培養(yǎng)基中，保存時(shí)間不超過24 h。每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)采樣，至少采30～50份樣品。

1.3.2 細(xì)菌分離與鑒定 將棉拭子樣本直接接種于麥康凱顯色培養(yǎng)基上，36±1 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取典型單菌落，在麥康凱顯色培養(yǎng)基上純化一代。挑取單菌落接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，36±1 ℃培養(yǎng)18～24 h。菌落經(jīng)VITEK2微生物鑒定儀鑒定，于20 %甘油保存于-70 ℃。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)[10-12]推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)與結(jié)果判讀。從過夜不超過24 h培養(yǎng)的平板上挑取適量菌落，均勻懸浮于1.5 mL細(xì)菌稀釋管中，將菌懸液調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠞舛?，使?xì)菌含量為1×108CFU/mL，然后稀釋為1×105～2×105CFU/mL左右，接種于含有不同濃度藥物的96孔凍干型細(xì)菌藥敏檢測(cè)板中，36±1 ℃培養(yǎng)16～18 h，按同法做ATCC25922的質(zhì)量控制，觀察并記錄結(jié)果，以無菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物溶液的濃度為最低抑菌濃度(MIC)。對(duì)所測(cè)得的MIC結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，測(cè)定結(jié)果按上述標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的臨界值判定為敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果的臨界值判定值和質(zhì)控范圍見表1。

表1 腸道桿菌對(duì)13種抗菌藥物藥敏試驗(yàn)的MIC判定標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控范圍 mg/L

1.3.3 PFGE試驗(yàn) 篩選耐藥菌株進(jìn)行復(fù)壯，調(diào)節(jié)菌液濁度至4.0～4.5，吸取400 μL到1.5 mL的離心管，加20 μL蛋白酶 K，與50 ℃預(yù)熱的SeaKem Gold Agarose 400 μL混合后注模。將膠塊放入5 mL含25 μL蛋白酶 K的細(xì)胞裂解液中，54 ℃水浴搖床裂解2 h。10～15 mL 50 ℃的水清洗4次，10～15 mL 50 ℃的TE清洗2次，每次10～15 min。洗好的膠塊浸于TE，4 ℃保存。切取膠塊2 mm，浸入含XbaⅠ酶 3 μL的200 μL酶切體系中，37 ℃水浴至少2 h。酶切后的膠塊置于梳齒，Marker位于1、5、10、15泳道，其余泳道放試驗(yàn)菌株。倒入冷至50 ℃ 1%的瓊脂糖，冷卻15 min，放入電泳儀電泳。電泳條件：電壓6 V，脈沖參數(shù)：6.76～35.38 s，電泳溫度14 ℃，電泳時(shí)間18 h。電泳結(jié)束后取出膠塊，1∶10000的溴化乙啶溶液染色20～30 min，純水脫色30 min。用Gel Doc成像。

1.3.4 Riboprinter全自動(dòng)指紋鑒定系統(tǒng) 采用Riboprinter微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)，通過EcoRⅠ內(nèi)切酶酶切，根據(jù)儀器生產(chǎn)商提供的說明書操作，得到微生物DNA 雜交指紋圖譜，進(jìn)行16SrRNA條帶分析。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用 將試驗(yàn)獲取的電泳圖譜用BioNumerics軟件(Version 6.0版本)進(jìn)行聚類分析，識(shí)別圖形條帶。聚類圖和矩陣圖使用非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法(UPGMA)構(gòu)建，在限制性內(nèi)切酶的作用下，不同菌株會(huì)呈現(xiàn)不同的條帶數(shù)和片段大小，聚類相似性系數(shù)(距離)采用的是基于條帶比較的Dice。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，2013-2014年所分離的雞源大腸埃希菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、大觀霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、氧氟沙星和恩諾沙星的耐藥率較高，在50%以上。2014年較2013年，雞源大腸埃希菌除對(duì)頭孢噻呋的耐藥率有所提高以外，對(duì)其他12種藥物的耐藥率均有所下降。雞源大腸埃希菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，80 %以上的為多重耐藥菌株(即對(duì)三類或三類以上的抗菌藥物耐藥)，表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的耐藥性。具體結(jié)果見表2和表3。

表2 大腸埃希菌對(duì)9類13種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 大腸埃希菌對(duì)9類13種抗菌藥物多的多重耐藥率

2.2 PFGE分型 篩選出典型的重要耐藥表型及多重耐嚴(yán)重的28株菌株(耐藥譜型見表4)，按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)菌PFGE分子分型后，采用Quantity One軟件獲得PFGE電泳圖譜，用BioNumerics軟件對(duì)PFGE帶型進(jìn)行分析，聚類分析結(jié)果見圖1(耐藥譜見表4)。結(jié)果表明28株大腸埃希菌經(jīng)XbaI 酶切，PFGE 分型后，每個(gè)菌株產(chǎn)生11～18 條電泳條帶，大約在50～400 kb之間，以85%相似度為標(biāo)準(zhǔn)，可分為22 個(gè)不同的帶型，菌株之間的相似系數(shù)為22.5 %～94.6 %之間，帶型比較分散，未發(fā)現(xiàn)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)帶型，說明菌株在基因水平上具有多態(tài)性。

2.3 RP分型 篩選出典型的重要耐藥表型及多重耐嚴(yán)重的菌株27株(表2)，按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)菌RP分子分型后，用BioNumerics軟件對(duì)RP帶型進(jìn)行分析，聚類結(jié)果見圖1(耐藥譜見表4)。結(jié)果表明，用EcoRⅠ酶切之后，雞源大腸埃希菌RP帶型的相似度在54.3 % ～ 100 %之間。以90 %相似度為標(biāo)準(zhǔn)，雞源大腸埃希菌分為14個(gè)RP帶型。結(jié)果與PFGE分型的結(jié)果基本一致，RP帶型比較分散，未發(fā)現(xiàn)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)帶型，說明菌株在基因水平上具有多態(tài)性。

圖1 雞源大腸埃希菌PFGE與RP聚類分析圖

耐藥表型類別細(xì)菌編號(hào)對(duì)所有藥物全部耐藥2013c25、2013c28對(duì)除PME以外的其他12種藥物耐藥2014xc2、2014xc20、2014sc9、2014sc10、2013c12、2013c16、2013c20、2013c21、2013c22、2013c34對(duì)除GM以外的其他12種藥物耐藥2014xc12、2013c19對(duì)除A/C以外的其他12種藥物耐藥2014xc9對(duì)除DO以外的其他12種藥物耐藥2014xc21對(duì)除GM、PME以外的其他11種藥物耐藥2014xc5、2014sc6、2014sc11、2014sc12、2013c14對(duì)除A/C、PME以外的其他11種藥物耐藥2014xc8、2014xc11、2014sc15對(duì)除A/C、SXT以外的其他11種藥物耐藥2014xc14、2014xc16對(duì)除PME、SXT以外的其他11種藥物耐藥2014sc14對(duì)除PME、OFX以外的其他11種藥物耐藥2013c32對(duì)除A/C、SXT、PME以外的其他10種藥物耐藥2014xc6

3 討論與小結(jié)

3.1 分型方法比較 核糖體分型(RP)是針對(duì)核糖體DNA操縱子基因的保守序列設(shè)計(jì)探針，探針與膜上的DNA片段進(jìn)行雜交，產(chǎn)生了特異性的DNA指紋圖；而PFGE則是利用限制性內(nèi)切酶，將菌株的基因組DNA切割成電泳方法可以區(qū)分的不同片段，反映了菌株全基因組遺傳學(xué)特征。對(duì)于大腸埃希菌來說，RP分型利用EcoRⅠ酶切對(duì)菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定與溯源。兩者比較可見，PFGE可根據(jù)帶型直觀地反映菌株的基因突變位點(diǎn)等，對(duì)于分析菌株親緣關(guān)系具有其優(yōu)勢(shì)。在本試驗(yàn)中，兩種分型方法結(jié)果均表明，29株耐藥大腸埃希菌的分子分型帶型比較分散，未發(fā)現(xiàn)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)帶型，菌株在基因水平上具有多態(tài)性，與蓋文燕等[13]報(bào)道一致。從分型能力上看，PFGE分為22個(gè)不同的帶型，RP分為14個(gè)不同的帶型，PFGE分型能力要強(qiáng)于RP，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[14-16]。

3.2 分型結(jié)果與藥敏試驗(yàn)結(jié)果聯(lián)合分析 本研究將分離所得的741 株大腸埃希菌對(duì)9類13種抗菌藥物進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，雞源大腸埃希菌對(duì)13種抗菌藥物耐藥率較高，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，80 %以上的為多重耐藥菌株(即對(duì)三類或三類以上的抗菌藥物耐藥)，表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的耐藥性，與王娟等報(bào)道結(jié)果一致[17]。將分型結(jié)果與藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，菌株2013c14和2013c19的PFGE分型相似度為94.6 %，RP分型相似度為100%，兩種分型方法的結(jié)果均為同一型，但耐藥譜型不同，即分型相同的菌株其耐藥譜型不一定相同。分析菌株2013c16和2014sc6，兩種分型方法的結(jié)果均為不同型，但耐藥譜型相同，即分型不同的菌株其耐藥譜型可能相同，與余婷等[18-19]的報(bào)道的結(jié)果一致，由此可以看出同一克隆型的菌株在增殖播散的過程中存在耐藥質(zhì)粒的獲取或丟失，導(dǎo)致耐藥性的改變，使分型相同的菌株具有不同的耐藥譜。將分型結(jié)果與藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，通過建立的基因指紋圖譜庫(kù)，可以發(fā)現(xiàn)耐藥株在基因指紋圖譜上存在的差異，研究它們?cè)谥虏∫蜃雍湍退幮缘确矫娴漠愅?/p>

研究結(jié)果表明，雞源大腸埃希菌對(duì)9類13種抗菌藥物耐藥率較高，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的耐藥性，同一分型菌株的耐藥譜型并非完全一致，將分型結(jié)果與藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，通過建立的基因指紋圖譜庫(kù)，不但可以發(fā)現(xiàn)耐藥株在基因指紋圖譜上存在的差異，還可以利用圖譜庫(kù)內(nèi)貯存的數(shù)據(jù)信息對(duì)基因型與耐藥性的變化實(shí)行動(dòng)態(tài)分析與研究，可為科學(xué)制定抗菌感染的防治方案及細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)提供必要的理論依據(jù)。

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(編輯：陳希)

Study on Antimicrobial Resistance and Molecular Subtyping of Escherichia coli Isolated from Chickens

QIAN Xiao-lu1，SHANG Jun1*，DONG Dong2，ZHANG Hao-ran1，TIAN Kai1

(1.ShanghaiInstituteforVeterinaryDrug&Feedscontrol,Shanghai201103,China; 2.HuashanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China)

This study was conducted to investigate the antimicrobial resistance and obtain the subtyping ofEscherichiacoliisolated from chickens in Shanghai. 741 strains ofEscherichiacoliwere collected from different areas in Shanghai in two years (2013-2014). Susceptibility test to 13 antimicrobial agents was performed by broth microdilution. Pulsed-field gel electrophresis(PFGE)and Ribo-printer(RP) were used to subtype the multidrug resistant strains. According to the antimicrobial susceptibility test ofEscherichiacoli, the resistance rates to ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, spectinomycin, tetracycline, doxycycline, florfenicol, sulfonamide isoxazole, trimenthoprim-sulfamethoxazole, ofloxacinand enrofloxacin were generally high. And more than 80% multidrug resistant strains were detected. Results of PFGE showed that these strains ofEscherichiacoliwere divided into 22 types after digested byXbaⅠ. While results of RP divided these strains into 14 types after digested byEcoRⅠ. Compared with RP, PFGE had higher definition on molecular subtyping. This study showed that the genetype ofE.coliwas polymorphic. And phenotypes of isolates with the same subtyping were not exactly identical.

Escherichiacoli; antimicrobial resistance ; PFGE ;Ribotyping ; molecular subtyping

錢曉璐，助理畜牧師，從事動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的研究。

商軍。E-mail：sjshvdc@163.com

2016-01-28

A

1002-1280 (2016) 04-0015-06

S852.61