海東雞CAPN1基因3′UTR多態(tài)性及其與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性

趙莉媛，趙香珍，張 娟

(1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海 湟源 812100； 2.樂都縣畜牧獸醫(yī)站，青海 樂都 810700； 3.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

海東雞CAPN1基因3′UTR多態(tài)性及其與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性

趙莉媛1，趙香珍2，張 娟3*

(1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海 湟源 812100； 2.樂都縣畜牧獸醫(yī)站，青海 樂都 810700； 3.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)海東雞CAPN1基因多態(tài)性進(jìn)行分析，研究CAPN1基因多態(tài)位點(diǎn)與體尺性狀之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，海東雞CAPN1基因3′UTR存在c.*1 114T>C轉(zhuǎn)換，對(duì)應(yīng)2種等位基因T和C，等位基因T為優(yōu)勢(shì)等位基因；該群體CAPN1基因檢測(cè)區(qū)域?yàn)橹卸榷鄳B(tài)(0.25

海東雞；CAPN1基因； PCR-SSCP； 體尺性狀

鈣蛋白酶(CAPN)是存在于果蠅屬和所有脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的一種鈣激活中性半胱氨酸內(nèi)肽酶[1],其在肌肉生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及膜蛋白裂解等方面發(fā)揮十分重要的作用[2]。CAPN1是鈣蛋白酶家族成員之一，也是降解肌原纖維蛋白的主要酶之一，該酶的活性與肌肉增長(zhǎng)和宰后嫩度的變化密切相關(guān)[3]。因此，可以從分子生物學(xué)角度對(duì)肌肉嫩度性狀的遺傳本質(zhì)問題進(jìn)行分析。大量研究表明，CAPN1基因與雞肉嫩度、肌纖維密度等肉質(zhì)性狀及屠宰性狀相關(guān)[4-7]。

海東雞風(fēng)味獨(dú)特、肉質(zhì)鮮嫩、脂肪含量低，是青海省半農(nóng)半牧區(qū)生態(tài)放養(yǎng)和生產(chǎn)特色優(yōu)質(zhì)雞肉最適合的雞種[8]。鑒于基因堿基突變可能影響畜禽的生長(zhǎng)性狀，本研究應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)和直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)海東雞CAPN1基因3′UTR的SNP位點(diǎn)，分析其多態(tài)位點(diǎn)對(duì)海東雞體尺性狀的遺傳效應(yīng)，以期發(fā)現(xiàn)影響海東雞體尺性狀的標(biāo)記位點(diǎn)，為青藏高原海東雞的選種選育及資源利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 血樣采集、DNA提取及體尺性狀測(cè)定

選取青海省樂都縣土橋村農(nóng)戶同一條件下散養(yǎng)的月齡相近的海東雞60只，各翼下靜脈采血5 mL，醫(yī)用采血管保存，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室,冷凍保存。用苯酚-氯仿法從凍存血樣中提取海東雞基因組總DNA[9]。體尺性狀測(cè)定包括體斜長(zhǎng)、胸深、胸寬、胸圍、胸骨長(zhǎng)、髖寬、脛長(zhǎng)。

1.2 試劑

蛋白酶K、Tris飽和酚、EDTA、SDS、氯仿、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、N,N,N,N′-四甲基乙二胺均購自北京天根公司；4S Green Nucle Acid、瓊脂糖等購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD19-T載體、DNA快速純化回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、X-gal、IPTG均購自大連寶生物公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

依據(jù)NCBI已發(fā)布的原雞CAPN1基因序列(NM_205303)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0和Select Primer設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增海東雞CAPN1基因的3′UTR (預(yù)期片段長(zhǎng)度384 bp)。引物序列：F為5′-CCAGAAGAGAAGGAGGGCAA-3′，R為5′-AGGTTGCAGCAGGAGGTATT-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1.2 μL，Taq預(yù)混酶15 μL，ddH2O 6.6 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 SSCP電泳及等位基因序列測(cè)定

取4 μL PCR產(chǎn)物加入到12 μL變性液(98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA)中，放置于普通PCR儀上98 ℃高溫變性10 min，然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻10 min。再將變性后的混合物加入到14%的聚丙烯酰胺凝膠上，350 V高壓預(yù)電泳30 min后，300 V電壓、電泳槽液體循環(huán)溫度18 ℃條件下電泳20.5 h。電泳結(jié)束后，用銀染法染色并判定基因型[10]，純合型個(gè)體的PCR產(chǎn)物直接送華大公司測(cè)序，雜合型個(gè)體參照文獻(xiàn)[9]的方法處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Genpop軟件統(tǒng)計(jì)突變位點(diǎn)的各遺傳參數(shù)并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)[11-12]。關(guān)聯(lián)分析采用獨(dú)立效應(yīng)模型，使用SPSS 19.0軟件建立模型，進(jìn)行基因型與海東雞生長(zhǎng)性狀間的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。統(tǒng)計(jì)模型：Yij=μ+Gi+eij，其中，Yij為個(gè)體表型值，μ為群體均值，Gi為基因型的固定效應(yīng)，eij為隨機(jī)誤差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1CAPN1基因PCR擴(kuò)增效果

海東雞CAPN1基因3′UTR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰、特異性好，片段長(zhǎng)度與預(yù)期相符(圖1)，可以用于SSCP電泳。

M.DNA Marker; 1—3.CAPN1基因3′UTR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 海東雞CAPN1基因3′UTR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 海東雞CAPN1基因PCR-SSCP檢測(cè)

海東雞CAPN1 基因3′UTR共檢測(cè)到T和C 2個(gè)等位基因，形成 TT、CT 2種帶型(圖2)。

圖2 海東雞CAPN1 基因3′UTR PCR產(chǎn)物SSCP檢測(cè)結(jié)果

2.3 序列測(cè)定結(jié)果

將海東雞CAPN1基因測(cè)序結(jié)果與雞CAPN1基因(GenBank： NM_205303 )3′UTR序列比對(duì)分析，同源性達(dá)到95%以上，表明擴(kuò)增產(chǎn)物的確為海東雞CAPN1基因。c.*1 114T>C的轉(zhuǎn)換，屬于同義突變，未引起氨基酸的改變(圖3)。

圖3 海東雞CAPN1基因3′UTR 等位基因核苷酸序列對(duì)比

2.4 海東雞CAPN1基因3′UTR遺傳特征

由表1可以看出，海東雞CAPN1基因3′UTR檢測(cè)區(qū)等位基因T為優(yōu)勢(shì)等位基因，頻率為0.733 3。多態(tài)信息含量(PIC)為0.314 6，介于0.25和0.50,屬中度多態(tài)，說明檢測(cè)區(qū)域多態(tài)性較豐富。有效等位基因數(shù)(Ne)為0.391 1，期望雜合度(He)為0.395 5，純合度(Ho)為0.604 5?？ǚ綑z驗(yàn)表明，海東雞在該位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

表1 海東雞CAPN1基因3′UTR多態(tài)性的群體遺傳參數(shù)

2.5 海東雞CAPN1基因3′UTR多態(tài)性與體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表2可知，CAPN1基因3′UTR的多態(tài)性對(duì)體斜長(zhǎng)、胸寬和胸骨長(zhǎng)有顯著性影響，對(duì)脛長(zhǎng)有極顯著影響，但對(duì)胸深、胸圍和髖寬無顯著性影響。進(jìn)一步多重比較表明，TT基因型的體斜長(zhǎng)、胸骨長(zhǎng)顯著高于CT型，而TT基因型的胸寬顯著低于CT型。TT基因型個(gè)體的脛長(zhǎng)極顯著高于CT型個(gè)體?？梢?，CAPN1基因可以作為影響海東雞體尺性狀的候選基因。

表2CAPN1基因3′UTR不同基因型與
體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

cm

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

畜禽肌肉蛋白質(zhì)的增加取決于肌肉蛋白合成速度和降解速度。在動(dòng)物屠宰后貯藏嫩化的過程中，CAPN1基因通過降解肌原纖維使肉的嫩度增加。大量研究表明，CAPN1是影響畜禽肉質(zhì)嫩度和機(jī)體生長(zhǎng)的主效基因[13-14]，且CAPN1基因在不同雞品種中都存在多態(tài)性[6,15]。真核生物mRNA的3′UTR對(duì)細(xì)胞的表型、生長(zhǎng)、分化起重要作用，該區(qū)域也是與其他細(xì)胞內(nèi)因子相互作用的重要位點(diǎn)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，海東雞CAPN1基因3′UTR區(qū)存在2種基因型(TT和CT)和2個(gè)等位基因(T和C)，T等位基因頻率(0.733 3)遠(yuǎn)大于C等位基因頻率(0.266 7)，呈明顯的偏態(tài)分布，這與郭彥等[15]報(bào)道的壽光雞及楊秀芹等[17]報(bào)道的大白豬群體在CAPN1基因3′UTR區(qū)的等位基因分布規(guī)律是一致的。多態(tài)信息含量和遺傳雜合度是群體內(nèi)遺傳變異大小的評(píng)定指標(biāo)，數(shù)值越高，遺傳變異越大。本研究中，海東雞群體在該位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25

本研究結(jié)果顯示，海東雞CAPN1基因3′UTR區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)與其體斜長(zhǎng)、胸寬、胸骨長(zhǎng)和脛長(zhǎng)等體尺性狀都有一定的相關(guān)性。TT基因型的體斜長(zhǎng)、胸骨長(zhǎng)顯著高于CT型，而TT基因型的胸寬顯著低于CT基因型。TT基因型個(gè)體的脛長(zhǎng)極顯著高于CT基因型個(gè)體。提示，CAPN1基因可以作為影響海東雞體尺性狀的候選基因。因此，TT基因型對(duì)于雞的生長(zhǎng)性能可能具有一定改善作用，本研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用及保護(hù)青海海東雞品種資源提供了參考依據(jù)。

[1] 黃萌,侯冠彧,李俊雅,等.鈣蛋白酶-3基因多態(tài)性與牛胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析[C]//中國牛業(yè)健康發(fā)展與科技創(chuàng)新——中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)第七屆養(yǎng)牛學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.南京:中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)，2009.

[2] Gitler D,Spira M E.Real time imagingof calcium-induced localized protrolytic activity after axotomy and its relation to growth cone formation[J].Neuron,1998,20(6):1123-1135. [3] Hopkins D L,Thompson J M.Inhibition of protease activity.Part 1.The effect on tenderness and indicators of pro-teolysis in ovine muscle[J]. Meat Science,2001，59:175-185.

[4] Li T S,Liu F M,Tang H.The correlation analysis of between the measure of chicken muscle tenderness and traits[J].Journal of Animal Science and Veterinary Medicine,2004,35(2):171-177.

[5] 高海軍.CAPN1 基因?qū)﹄u肌肉嫩度性狀的遺傳效應(yīng)及其表達(dá)規(guī)律研究[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2010.

[6] 張?jiān)鰳s,蔣小松,杜華銳,等.CAPN1 基因多態(tài)性與雞肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析[C]//安全優(yōu)質(zhì)的家禽生產(chǎn)——第十五次全國家禽學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集.廣州:華南理工大學(xué)出版社，2011.

[7] 張?jiān)鰳s,朱慶,蔣小松,等.鈣蛋白酶1基因多態(tài)性與雞肉嫩度和屠體性狀的相關(guān)研究[J].遺傳,2007,29(8):982-988.

[8] 張軍霞,楊葆春,張靜.青藏高原海東雞屠宰性能與肌肉品質(zhì)分析[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2012(3): 24-26.

[9] 胡江.牛ADRB3、CAPN1和CAPN4基因多態(tài)性及其對(duì)生長(zhǎng)和胴體性狀的影響[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[10] Byun S,Fang Q,Zhou H,etal.An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels[J].Analytical Biochemistry,2009,385:174-175.

[11] 胡寶利.不同年齡秦川牛胴體性狀與肉質(zhì)性狀的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2001:69-71.

[12] 姚玉妮,閻萍,梁春年,等.不同地方品種牦牛IGF1基因的PCR-SSCP分析[J].中國草食動(dòng)物,2008(3):9-11.

[13] Smith P L,Casas E,RexroadⅢC E,etal.BovineCAPN1 maps to a region ofBTA29 containing a quantitative trait locus for meat tenderness[J].J Anim Sci,2000,78(10):2589-2594.

[14] Page B T,Casas E,Heaton M P,etal.Evaluation of single nucleotide polymorphisms inCAPN1 for association with meat tenderness in cattle[J].Journal of Animal Science,2002,80(12):3077-3085.

[15] 郭彥,周國利,呂鑫,等.雞CAPN1基因3′UTR多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(12):104-107.

[16] 王海震,王瑩,劉定干.真核生物mRNA 3′非翻譯區(qū)的功能[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2008,35(9):980-985.

[17] 楊秀芹,劉慧,郭麗娟,等.豬CAPN1基因部分外顯子及3′UTR區(qū)的SNPs檢測(cè)[J].遺傳,2008,30(6):741-746.

Polymorphism of 3′UTR ofCAPN1 Gene and Its Association with Body Size of Haidong Chicken

ZHAO Liyuan1,ZHAO Xiangzhen2,ZHANG Juan3*

(1.Qinghai Vocational and Technical Institute of Animal Husbandry and Veterinary,Huangyuan 812100,China;2. Animal Husbandry and Veterinary Station of Ledu County,Ledu 810700,China;3.School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021,China)

To explore the polymorphism ofCAPN1 gene in Haidong chicken populations and to evaluate it as a candidate molecular marker associated with body size,PCR-SSCP method was used to detect the polymorphism ofCAPN1 in sixty Haidong chickens. The 3′UTR ofCAPN1 gene in Haidong chicken had the transition of c.*1 114T>C, corresponding to the 2 alleles of T and C, and the allele T was the dominant allele.The detection region ofCAPN1 gene with 0.25

Haidong chicken;CAPN1 gene; PCR-SSCP; body size

2015-08-16

寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ15011)

趙莉媛(1981- )，女，青海樂都人，講師，本科，主要從事家禽生產(chǎn)研究。

*通訊作者：張 娟(1982-)，女，寧夏中衛(wèi)人，副教授，博士，主要從事家禽遺傳育種研究。E-mail：shiningstar2013@sina.cn

S831

A

1004-3268(2016)02-0138-04