10種白僵菌菌株發(fā)酵液對植物線蟲和昆蟲病原線蟲的生物活性

路文雅，張 麗，關(guān)美娟，董建臻*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071000； 2.河北省植保植檢站，河北 石家莊 050000)

10種白僵菌菌株發(fā)酵液對植物線蟲和昆蟲病原線蟲的生物活性

路文雅1，張 麗2，關(guān)美娟1，董建臻1*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071000； 2.河北省植保植檢站，河北 石家莊 050000)

為了獲得高效的殺線蟲生防菌資源，以山藥短體線蟲(Pralylenchussp.)、黃瓜根結(jié)線蟲(Meloidogynesp.)為靶標(biāo)，對10種白僵菌菌株發(fā)酵液的殺線蟲活性進(jìn)行測定，同時測定了白僵菌菌株發(fā)酵液對昆蟲病原線蟲小卷蛾斯氏線蟲(SteinernemacarpocapsaeAll) 的生物活性。結(jié)果表明，菌株BD-B173、BD-B180、BD-B061-3和BD-B315對山藥短體線蟲具有高毒力，24 h校正死亡率分別為97.20%、96.50%、91.16%、90.32%；48 h校正死亡率分別為97.30%、97.67%、92.45%、94.40%。菌株BD-B061-3、BD-B198、BD-B118和BD-B173對黃瓜根結(jié)線蟲具有高毒力，24 h校正死亡率分別為97.47%、91.65%、81.37%、68.92%；48 h校正死亡率分別為98.73%、95.27%、87.53%、96.53%。10種白僵菌菌株發(fā)酵液對小卷蛾斯氏線蟲24 h及48 h的校正死亡率均不超過10%。說明10種白僵菌菌株發(fā)酵液對2種植物線蟲的殺蟲活性具有特異性，且對昆蟲病原線蟲小卷蛾斯氏線蟲的毒力均較弱。

白僵菌； 發(fā)酵液； 線蟲； 生物活性

植物寄生線蟲是一類重要的病原微生物，分布廣、種類多。目前全世界已報道的植物線蟲有 200 多屬 5 000 余種，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害[1]。山藥短體線蟲(Pralylenchussp.)是一種給山藥帶來毀滅性危害的植物寄生線蟲。近年來隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，山藥種植面積逐年增加，且給農(nóng)民帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)效益，其開發(fā)前景極為廣闊。然而，山藥因重茬連作，遭受短體線蟲病的危害也逐年增加，從而嚴(yán)重制約著山藥生產(chǎn)的發(fā)展。根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)可以侵染很多作物，其中蔬菜和果樹受害較嚴(yán)重[2]，近年來隨著蔬菜產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，蔬菜種植規(guī)模越來越大，標(biāo)準(zhǔn)化程度越來越高，蔬菜根結(jié)線蟲的危害程度逐年增加[3]，給國家的蔬菜產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失。

長期以來生產(chǎn)中主要采用化學(xué)方法防治植物寄生線蟲，由于人工合成的殺線蟲劑毒性均較高，導(dǎo)致線蟲產(chǎn)生抗藥性，更重要的是嚴(yán)重污染人類生存環(huán)境。同時，也致使農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留和殺傷天敵等副作用日益嚴(yán)重[4-5]，因此化學(xué)防治已不適應(yīng)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的需要。近年來，隨著國家大力倡導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，生物防治越來越受到重視，特別是利用真菌的代謝產(chǎn)物控制線蟲病害在國內(nèi)外已取得了顯著的成果[6-7]。

目前已記載的殺蟲真菌約100屬800多種，白僵菌是研究和應(yīng)用較多的一種，它的殺蟲譜非常廣泛，能寄生700余種昆蟲和螨[8-10]。至1999年，在國際上白僵菌已有17種產(chǎn)品注冊登記[11]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌可產(chǎn)生白僵菌素[12]、球孢白僵菌素[13]、卵孢毒素以及其他毒素，其對植物線蟲也具有活性[14]。劉霆等篩選出了1株具有殺線蟲毒力的球孢白僵菌菌株Snf907，明確了其對根結(jié)線蟲[14]、甘薯莖線蟲[15]和大豆胞囊線蟲[16]都有很強(qiáng)的毒殺作用。之后陳增齊等[17]研究發(fā)現(xiàn)，該菌株發(fā)酵液處理接種線蟲的番茄幼苗后，對番茄根結(jié)線蟲病害具有較好的防治效果，并且隨著發(fā)酵液濃度的升高，番茄幼苗根內(nèi)幾種防御酶活性上升。劉丹丹等[18]通過活體檢測方法，分別測定了不同濃度的球孢白僵菌發(fā)酵液對線蟲死亡率的影響，并對殺蟲活性物質(zhì)進(jìn)行了分離純化，其純度達(dá)97.38%。劉瓊等[19]研究了球孢白僵菌代謝產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲的作用機(jī)制，明確其通過抑制南方根結(jié)線蟲的運動能力、呼吸作用和降低乙酰膽堿酯酶活性，同時干擾線蟲體內(nèi)糖和蛋白質(zhì)的代謝，以及增加蟲體內(nèi)容物的滲漏，從而起到毒殺植物線蟲的作用。

目前關(guān)于白僵菌發(fā)酵液對植物寄生線蟲生物活性的研究仍較少，尤其對山藥短體線蟲的防治效果還未見報道。因此，本研究測定10種白僵菌菌株發(fā)酵液對山藥短體線蟲和黃瓜根結(jié)線蟲的毒力，以期篩選出對2種線蟲具有高毒力的菌株，為植物線蟲防治提供理論依據(jù)，同時對1種昆蟲病原線蟲小卷蛾斯氏線蟲(SteinernemacarpocapsaeAll)進(jìn)行了生物活性測定，以明確白僵菌發(fā)酵液對生防線蟲的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試線蟲 山藥短體線蟲(Pralylenchussp.)和黃瓜根結(jié)線蟲(Meloidogynesp.)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物防治實驗室分離并保存，小卷蛾斯氏線蟲(SteinernemacarpocapsaeAll)也由該實驗室保存。

1.1.2 供試菌株及培養(yǎng)基 白僵菌菌株BD-B173、BD-B198、BD-B161、BD-B118、BD-B008-2、BD-B180、BD-B015、BD-B061-3、BD-B315、BD-B511由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物防治實驗室提供。

菌種保存培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基為改良查氏液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 白僵菌發(fā)酵液的制備 25 ℃下用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)白僵菌7 d，在菌落邊緣用5 mm直徑的打孔器打菌餅2個，接種于裝有50 mL滅菌改良查氏液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，25 ℃搖床振蕩培養(yǎng)(150 r/min)7 d，培養(yǎng)好的白僵菌發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min去除孢子和菌絲體，將濾液置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 植物線蟲的分離和保存 山藥短體線蟲的分離和保存：將帶有山藥短體線蟲的山藥切成小塊，放入鋪有3層面巾紙、孔徑大小為0.15 mm的篩子上，將篩子放入適宜大小的托盤內(nèi)，然后向托盤內(nèi)加水直至病組織完全浸沒，靜置24 h。將收集到的線蟲液用滅菌水洗3次，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

黃瓜根結(jié)線蟲的分離與保存：將帶有根結(jié)線蟲的黃瓜根部剪成3～5 cm長的根段，放在盛有清水的培養(yǎng)皿中，剝掉根的表皮，挑出卵囊和雌蟲。將卵囊和雌蟲放在培養(yǎng)皿中，用0.5%次氯酸鈉處理3 min，再用無菌水沖洗3次，置于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵化。3 d后將孵化的2齡幼蟲放在培養(yǎng)皿中并加少量水，10 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 白僵菌發(fā)酵液對線蟲的活性測定 取潔凈滅菌的24孔板，分別加入 200 μL 線蟲懸液(內(nèi)含線蟲2齡幼蟲約 130 條)，再向其中滴加 200 μL白僵菌發(fā)酵液，混勻。以清水處理為對照(CK)，每個處理重復(fù)3次，分別于24 h、48 h鏡檢并記錄供試線蟲總數(shù)和死亡數(shù)，計算線蟲死亡率和校正死亡率。將處理靶標(biāo)線蟲24 h及48 h后校正死亡率分別達(dá)到80%及90%以上作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[20]。

線蟲死亡率=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)×100%

校正死亡率=(處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率)/(1-對照線蟲死亡率)×100%。

所得數(shù)據(jù)經(jīng)DPS軟件統(tǒng)計處理，用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白僵菌發(fā)酵液對山藥短體線蟲的室內(nèi)毒力

由表1可知，10種白僵菌菌株發(fā)酵液對山藥短體線蟲的毒力存在顯著性差異。處理24 h后，10株白僵菌菌株發(fā)酵液對山藥短體線蟲的毒力大小依次為：BD-B173>BD-B180>BD-B061-3>BD-B315>BD-B008-2>BD-B511>BD-B118>BD-B198>BD-B015>BD-B161。對山藥短體線蟲校正死亡率超過80%的菌株有BD-B173、BD-B180、BD-B061-3和BD-B315，其校正死亡率分別為97.20%、96.50%、91.16%、90.32%。

處理48 h后，10株白僵菌菌株發(fā)酵液對山藥短體線蟲的毒力大小依次為： BD-B180>BD-B173>BD-B315>BD-B061-3>BD-B511>BD-B008-2>BD-B118>BD-B198>BD-B015>BD-B161。對山藥短體線蟲的校正死亡率超過90%的菌株有BD-B180、BD-B173、BD-B315、BD-B061-3，其校正死亡率分別為97.67%、97.30%、94.40%、92.45%。雖然菌株BD-B511毒力也較高，在處理山藥短體線蟲48 h后校正死亡率達(dá)到82.14%，但尚未達(dá)到篩選標(biāo)準(zhǔn)。因此，處理24 h及48 h對山藥短體線蟲的校正死亡率超過80%及90%的菌株有BD-B173、BD-B180、BD-B061-3和BD-B315，這4株可以作為對山藥短體線蟲有高毒性潛力的生防菌株。

白僵菌菌株BD-B511和BD-B008-2的發(fā)酵液在處理山藥短體線蟲24 h與48 h的校正死亡率存在顯著性差異。BD-B511處理山藥短體線蟲24 h后的校正死亡率為14.83%，48 h后的校正死亡率達(dá)到82.14%；BD-B008-2處理山藥短體線蟲24 h后的校正死亡率為17.73%，48 h后的校正死亡率為58.13%。

表1 白僵菌發(fā)酵液對山藥短體線蟲的室內(nèi)毒力

注:同列數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示數(shù)據(jù)間無顯著差異(P>0.05)，下同。

2.2 白僵菌發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲的室內(nèi)毒力

由表2可知，10種白僵菌菌株發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲的毒力存在顯著性差異。處理24 h后，10株白僵菌菌株發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲的毒力大小依次為：BD-B061-3>BD-B198>BD-B118>BD-B008-2>BD-B173>BD-B511>BD-B315>BD-B180>BD-B015>BD-B161。對黃瓜根結(jié)線蟲的校正死亡率超過80%的菌株有BD-B061-3、BD-B198、BD-B118，其校正死亡率分別為97.47%、91.65%、81.37%。

處理48 h后，10株白僵菌菌株發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲的毒力大小依次為：BD-B061-3>BD-B173>BD-B198>BD-B180>BD-B008-2>BD-B118>BD-B511>BD-B015>BD-B315>BD-B161。對黃瓜根結(jié)線蟲校正死亡率超過90%的菌株有BD-B173、BD-B061-3、BD-B198，其校正死亡率分別為96.53%、98.73%、95.27%。雖然菌株BD-B180、BD-B008-2、BD-B118、BD-B511毒力也較高，在處理黃瓜根結(jié)線蟲48 h后校正死亡率均達(dá)到80%以上，但尚未達(dá)到篩選標(biāo)準(zhǔn)。因此，處理24 h及48 h對黃瓜根結(jié)線蟲的校正死亡率超過80%及90%的菌株有BD-B061-3、BD-B198、BD-B118、BD-B173，這4株可以作為對黃瓜根結(jié)線蟲有高毒性潛力的生防菌株。

白僵菌菌株BD-B015和BD-B180的發(fā)酵液在處理黃瓜根結(jié)線蟲24 h與48 h的校正死亡率存在顯著性差異。BD-B015處理黃瓜根結(jié)線蟲24 h后的校正死亡率為19.71%，48 h后的校正死亡率為78.98%；BD-B180處理黃瓜根結(jié)線蟲24 h后的校正死亡率為28.68%，48 h后校正死亡率達(dá)到89.51%。

表2 白僵菌發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲的室內(nèi)毒力

2.3 白僵菌發(fā)酵液對小卷蛾斯氏線蟲的室內(nèi)毒力

小卷蛾斯氏線蟲是研究最多的昆蟲病原線蟲種類，用其作靶標(biāo)對白僵菌菌株發(fā)酵液進(jìn)行篩選有重要意義。由表3可知，10種白僵菌菌株發(fā)酵液對小卷蛾斯氏線蟲的活性均較低，處理24 h和48 h校正死亡率均在10%以下，表明這10種菌株對昆蟲病原線蟲小卷蛾斯氏線蟲均無強(qiáng)毒殺作用。

表3 白僵菌發(fā)酵液對小卷蛾斯氏線蟲的室內(nèi)毒力

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，10種白僵菌菌株發(fā)酵液對植物線蟲的毒力存在特異性，篩選出4株對山藥短體線蟲具有高毒力的菌株，分別為BD-B173、BD-B180、BD-B061-3、BD-B315，以及4株對黃瓜根結(jié)線蟲具有高毒力的菌株，分別為BD-B061-3、BD-B198、BD-B118和BD-B173。其特異性的原因可能是白僵菌菌株發(fā)酵液中含有多種殺線蟲活性物質(zhì)，不同物質(zhì)對不同種類線蟲的作用位點不同,所以不同菌株的發(fā)酵液對線蟲的生物活性存在差異，這與陳立杰等[21]的研究結(jié)果相同。研究還發(fā)現(xiàn)，白僵菌菌株BD-B173和BD-B061-3的發(fā)酵液對山藥短體線蟲和黃瓜根結(jié)線蟲均有較高毒力，表現(xiàn)出較寬的殺蟲譜。陳立杰等[21]研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌發(fā)酵液對生防線蟲小桿線蟲表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，被殺死的小桿線蟲體壁以及蟲體內(nèi)部物質(zhì)不同程度消解，但本研究篩選出的對植物線蟲具有高毒力的白僵菌菌株發(fā)酵液對昆蟲生防線蟲小卷蛾斯氏線蟲均無強(qiáng)毒殺作用。至于這些白僵菌菌株發(fā)酵液有效殺線蟲活性成分以及殺蟲機(jī)制等問題，還有待進(jìn)一步的研究。

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Bioactivities of Fermentation Filtrate of 10BeauveriabassianaStrains on Plant Nematode and Entomopathogenic Nematode

LU Wenya1,ZHANG Li2,GUAN Meijuan1,DONG Jianzhen1*

(1.College of Plant Protection，Hebei Agricultural University，Baoding 071000,China；2.Plant Protection and Quarantine Station of Hebei Province，Shijiazhuang 050000,China)

To obtain efficient biocontrol resources for controlling nematodes,this study evaluated the to-xicity of fungal culture filtrates of 10Beauveriabassianastrains to two target nematodes,Pralylenchussp.andMeloidogynesp..Then their bioactivity was measured againstSteinernemacarpocapsaeAll,an entomopathogenic nematode.Results showed that BD-B173,BD-B180,BD-B061-3 and BD-B315 were high virulence strains forPralylenchussp..After 24 h,the corrected mortalities were 97.20%,96.50%,91.16% and 90.32%;After 48 h,the corrected mortalities were 97.30%,97.67%,92.45% and 94.40%,respectively.BD-B061-3,BD-B198,BD-B118 and BD-B173 were high virulence strains forMeloidogynesp..After 24 h,the corrected mortalities were 97.47%,91.65%,81.37% and 68.92%;After 48 h,the corrected mortalities were 98.73%,95.27%,87.53% and 96.53%,respectively.After treated with fermentation filtrates of 10Beauveriabassianastrains for 24 h and 48 h,the corrected mortality ofSteinernemacarpocapsaeAll was less than 10%.In comparison,there were significant differences among 10Beauveriabassianastrains in virulence against two species of plant nematodes.Almost all of the 10Beauveriabassianastrains had lower activity againstSteinernemacarpocapsaeAll.

Beauveriabassiana; fermentation filtrates; nematodes; biological activity

2015-07-01

河北蔬菜線蟲防治專項；河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科研發(fā)展基金計劃項目(1502013)

路文雅(1990-)，女，河北衡水人，在讀碩士研究生，研究方向：害蟲生物防治。E-mail：xiaoyaya820815@163.com

*通訊作者：董建臻(1959-)，男，河北博野人，教授，主要從事害蟲生物防治和系統(tǒng)發(fā)育研究。E-mail：djz116@sina.com

S476.1

A

1004-3268(2016)02-0082-05