不同類型分子標(biāo)記在苜?；蚪M中的檢測效率分析

王健勝，侯桂玲，謝永鳳(.平頂山學(xué)院，河南 平頂山 467000； .中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0000)

不同類型分子標(biāo)記在苜?；蚪M中的檢測效率分析

王健勝1，侯桂玲1，謝永鳳2
(1.平頂山學(xué)院，河南 平頂山 467000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

為選擇適合苜蓿基因組檢測的分子標(biāo)記，以19份國內(nèi)外苜蓿種質(zhì)為材料，比較分析了ISSR、SCoT、RAPD 3種標(biāo)記在苜?；蚪M中的檢測效率。結(jié)果表明，不同分子標(biāo)記檢測效率差異較大，引物篩選率以RAPD標(biāo)記最高，達(dá)到41.18%；擴(kuò)增總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)均以RAPD標(biāo)記最多，多態(tài)性條帶百分比以ISSR最高，為 96.25%；SCoT標(biāo)記的有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)值均高于ISSR、RAPD標(biāo)記?？梢?，不同分子標(biāo)記在不同檢測指標(biāo)方面各有優(yōu)劣，應(yīng)綜合應(yīng)用。

苜蓿； 分子標(biāo)記； 檢測效率

苜蓿是重要的多年生豆科牧草[1]，其不僅具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、營養(yǎng)豐富等特點，還具有耐旱、抗寒、抗鹽堿等較強的抗逆性，這也使得苜蓿成為我國栽培面積最大的豆科牧草，其在我國西北、華北、東北的大部分地區(qū)均有廣泛分布。隨著我國對生態(tài)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)發(fā)展的不斷重視，苜蓿在生態(tài)治理、畜牧業(yè)發(fā)展和種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中發(fā)揮著越來越重要的作用。

苜蓿種質(zhì)資源研究是苜蓿新品種培育的重要基礎(chǔ)，也是促進(jìn)苜蓿相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要條件，而遺傳多樣性分析是苜蓿種質(zhì)資源研究的主要內(nèi)容之一。傳統(tǒng)方法對苜蓿種質(zhì)資源的研究主要是基于苜蓿的表型特征，該方法具有直接、簡便等特點，但由于其受環(huán)境、生育期等因素的影響，使得形態(tài)標(biāo)記在苜蓿遺傳多樣性研究中的應(yīng)用受到一些限制。分子標(biāo)記技術(shù)作為重要研究手段在植物種質(zhì)資源研究中得到了極為廣泛的應(yīng)用。由于苜蓿分子標(biāo)記研究起步較晚，導(dǎo)致苜蓿專有分子標(biāo)記開發(fā)數(shù)量較少，因此現(xiàn)有苜蓿研究中利用的分子標(biāo)記主要以隨機標(biāo)記為主。目前，包括AFLP[2]、RAPD[3-5]、ISSR[6-7]、SCoT[8]等多種類型分子標(biāo)記都逐步被應(yīng)用于苜蓿種質(zhì)資源研究中。眾所周知，由于不同類型分子標(biāo)記是基于不同原理設(shè)計的，特定的設(shè)計特點決定了其在苜?；蚪M中具有不同的檢測效率，而選擇檢測效率高的分子標(biāo)記對提高苜蓿遺傳多樣性的研究效率甚為重要。前人利用分子標(biāo)記對苜蓿遺傳多樣性進(jìn)行了較多的研究，但有關(guān)不同類型分子標(biāo)記檢測效率比較的研究報道甚少?；诖?，本研究利用RAPD、ISSR、SCoT對來自國內(nèi)外的苜蓿種質(zhì)作了研究，著重比較了不同分子標(biāo)記在苜蓿基因組中的檢測效率，以期為分子標(biāo)記在苜蓿研究中的高效利用提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

苜蓿材料共19份，其中國內(nèi)種質(zhì)14份，國外種質(zhì)5份，具體見表1。

表1 供試材料基本信息

序號名稱/系列編號來源單位142IQ百綠國際草業(yè)(北京)有限公司25S43百綠國際草業(yè)(北京)有限公司3賽迪7Saidi7百綠國際草業(yè)(北京)有限公司4游客Youke百綠國際草業(yè)(北京)有限公司500385中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所600399中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所700038中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所805234中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所9三得利Sandeli百綠國際草業(yè)(北京)有限公司1008452中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所1108432中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所1208443中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所1308464中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所1408451中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所1508440中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所1608462中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所1708446中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所1808428中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所1908426中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所

1.2 DNA提取

每份材料隨機選取10～15個單株幼嫩葉片等量混合，采用改良的SDS法混合提取基因組總DNA[9]，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度后，稀釋至適合工作濃度，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分子標(biāo)記檢測

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf PCR擴(kuò)增儀上完成。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系的組成根據(jù)不同類型分子標(biāo)記的特點對基因組DNA、引物、10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq酶和ddH2O進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

SCoT-PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性1 min，在引物Tm值復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

ISSR-PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，47個循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。

RAPD-PCR 擴(kuò)增程序： 94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，3個循環(huán)； 94 ℃ 30 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，37個循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。

以上擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)上保存分析，每個反應(yīng)均重復(fù)3次以上。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

用0、1、9標(biāo)記SCoT擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為9，并建立分子數(shù)據(jù)矩陣。采用POPGEN 32軟件估算SCoT標(biāo)記的主要遺傳多樣性參數(shù)，包括引物擴(kuò)增總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性條帶百分比、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)和多態(tài)性信息含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型分子標(biāo)記多態(tài)引物篩選率比較

多態(tài)性引物的篩選率對苜蓿遺傳多樣性研究具有較大的影響，通常情況下，多態(tài)性引物篩選率越高，該類型分子標(biāo)記在苜蓿多樣性檢測中的研究效率也就越高。從表2可以看出，3種類型分子標(biāo)記在苜蓿基因組多態(tài)性檢測中表現(xiàn)差異較大，其中，RAPD標(biāo)記的多態(tài)性篩選率最高，達(dá)到了41.18%；其次是ISSR標(biāo)記，其篩選率為36.36%；SCoT標(biāo)記的多態(tài)性篩選率最低，只有21.54%。不同類型分子標(biāo)記多態(tài)性篩選率的差異與其設(shè)計特點密切相關(guān)。

表2 不同分子標(biāo)記在苜蓿中的篩選率

指標(biāo)標(biāo)記類型ISSRSCoTRAPD引物總數(shù)/條336517多態(tài)性引物數(shù)/條12147篩選率/%36．3621．5441．18

2.2 不同類型分子標(biāo)記擴(kuò)增譜帶信息比較

分子標(biāo)記引物擴(kuò)增條帶數(shù)是開展苜蓿遺傳多樣性分析的重要影響因素，而獲得理想的多態(tài)性擴(kuò)增位點數(shù)對苜蓿遺傳多樣性研究甚為關(guān)鍵。從表3可知，不同類型分子標(biāo)記在苜蓿基因組中擴(kuò)增表現(xiàn)差異較大，其在擴(kuò)增總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)及多態(tài)性條帶百分比方面都存在一定差異。在擴(kuò)增總條帶數(shù)方面，RAPD表現(xiàn)最好，其單個引物最多擴(kuò)增出了12條帶，略高于ISSR標(biāo)記和SCoT標(biāo)記的最大擴(kuò)增條帶數(shù)，RAPD的平均擴(kuò)增條帶數(shù)達(dá)到7.29條，明顯高于ISSR標(biāo)記的5.92條和SCoT標(biāo)記的5.57條。在多態(tài)性條帶數(shù)方面，3種標(biāo)記的表現(xiàn)差異較小，3種標(biāo)記多態(tài)性條帶數(shù)的分布范圍與其總擴(kuò)增條帶數(shù)分布范圍完全一致，存在差異的主要體現(xiàn)在多態(tài)性條帶平均數(shù)上， 單個引物擴(kuò)增平均多態(tài)性條帶數(shù)大小順序依次為RAPD>ISSR>SCoT。與擴(kuò)增條帶數(shù)不同，多態(tài)性條帶百分比可以比較有效地反映出不同分子標(biāo)記的多態(tài)性檢測效率，從表3可以看出，3種分子標(biāo)記多態(tài)性條帶百分比表現(xiàn)均較好，都在90%以上，其中ISSR標(biāo)記的多態(tài)性條帶百分比最高，達(dá)到了96.25%；其次是RAPD標(biāo)記，其多態(tài)性條帶百分比為95.24%；SCoT標(biāo)記的多態(tài)性條帶百分比最低，為92.24%。綜上，在苜蓿基因組擴(kuò)增方面，ISSR和SCoT表現(xiàn)相對較好。

表3 不同分子標(biāo)記在苜?；蚪M中的擴(kuò)增信息

指標(biāo)項目標(biāo)記類型ISSRSCoTRAPD擴(kuò)增總條帶數(shù)/條最大值9912最小值323平均值5．925．577．29多態(tài)性條帶數(shù)/條最大值9912最小值323平均值5．755．147．14多態(tài)性條帶百分比/%96．2592．2495．24

2.3 不同類型分子標(biāo)記主要遺傳多樣性參數(shù)比較

本研究也對不同分子標(biāo)記的主要遺傳多樣性參數(shù)作了比較分析，具體結(jié)果見表4。從表4可以看出，不同分子標(biāo)記在3種主要遺傳參數(shù)方面差異較大。在有效等位基因數(shù)方面，3種標(biāo)記中SCoT表現(xiàn)最好，其平均值最大，達(dá)到了1.53個；其次是ISSR標(biāo)記，平均值為1.45個，RAPD的有效等位基因數(shù)最低，只有1.48個。同時可以看出，每種標(biāo)記不同引物間有效等位基因數(shù)變化都較大，其中以SCoT的變化為最大。在Nei’s基因多樣性指數(shù)方面，不同類型標(biāo)記間差異相對較小，其中SCoT的Nei’s基因多樣性指數(shù)最大，其次是ISSR，RAPD相對最小。3種標(biāo)記的Shannon’s信息指數(shù)變化趨勢與前2個參數(shù)類似，其中，ISSR和SCoT的Shannon’s信息指數(shù)相對較大，都達(dá)到了0.46；RAPD的Shannon’s信息指數(shù)最小，只有0.44。從3種分子標(biāo)記主要遺傳多樣性參數(shù)來看，SCoT綜合表現(xiàn)相對較好。

表4 不同分子標(biāo)記主要遺傳多樣性參數(shù)

指標(biāo)項目標(biāo)記類型ISSRSCoTRAPD有效等位基因數(shù)/個最大值1．741．781．67最小值1．311．171．32平均值1．501．531．48Nei’s基因多樣性指數(shù)最大值0．420．430．38最小值0．210．120．23平均值0．300．310．29Shannon’s信息指數(shù)最大值0．550．630．55最小值0．340．210．38平均值0．460．460．44

2.4 不同類型分子標(biāo)記多態(tài)性信息含量比較

多態(tài)性信息含量是進(jìn)行分子標(biāo)記評價的重要參數(shù)，從表5可以看出，每種分子標(biāo)記的多態(tài)性信息含量變化均較大，其極差介于0.18～0.39，其中SCoT標(biāo)記變化最大，而RAPD標(biāo)記的變化最小。從多態(tài)性信息含量的最大值表現(xiàn)來看，SCOT表現(xiàn)最好。多態(tài)性信息含量平均值可以較均衡地反映出不同分子標(biāo)記間的差異，從平均值可以看出，ISSR和RAPD標(biāo)記多態(tài)性信息含量整體表現(xiàn)較好，其平均值均達(dá)到了0.33；而SCoT多態(tài)性信息含量較低，為0.31。從3種分子標(biāo)記多態(tài)性信息含量的綜合表現(xiàn)來看，RAPD和ISSR相對最好。

表5 不同分子標(biāo)記的多態(tài)性信息含量

項目標(biāo)記類型ISSRSCoTRAPD最大值0．410．480．41最小值0．190．090．23極差0．220．390．18平均值0．330．310．33

3 結(jié)論與討論

分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用有效促進(jìn)了苜蓿種質(zhì)資源保護(hù)、鑒定和科學(xué)利用的研究進(jìn)展，而在分子標(biāo)記應(yīng)用中，基因組多態(tài)性檢測分析是較為重要的內(nèi)容，也是選擇理想分子標(biāo)記類型的重要依據(jù)。近年來，隨著新的分子標(biāo)記技術(shù)的不斷開發(fā)，越來越多的分子標(biāo)記被逐步應(yīng)用于苜蓿研究中，而不同分子標(biāo)記的設(shè)計特點決定了其在苜?；蚪M多態(tài)性檢測中具有不同的效率。因此，開展不同分子標(biāo)記檢測效率的比較分析具有重要意義。

本研究以19份國內(nèi)外苜蓿種質(zhì)為材料，選取了在苜蓿研究中應(yīng)用較廣的ISSR標(biāo)記和RAPD標(biāo)記以及應(yīng)用較少的新型SCoT標(biāo)記，研究這3種標(biāo)記在苜?；蚪M多態(tài)性檢測效率方面的差異，結(jié)果表明，不同分子標(biāo)記在不同檢測指標(biāo)方面表現(xiàn)各有優(yōu)劣，RAPD在引物篩選率方面表現(xiàn)最好，ISSR在多態(tài)性條帶百分比方面表現(xiàn)最為突出，而SCoT的主要遺傳多樣性參數(shù)最高，3種標(biāo)記的多態(tài)性信息含量差異較小。出現(xiàn)以上結(jié)果的原因可能是由不同類型分子標(biāo)記的設(shè)計特點所致，RAPD標(biāo)記是以單一的隨機寡聚核苷酸(通常為10個堿基)作引物對基因組DNA進(jìn)行隨機擴(kuò)增，而ISSR標(biāo)記是以簡單序列重復(fù)(SSR)的3′或5′端錨定的1～4個堿基作引物進(jìn)行基因組DNA的擴(kuò)增，與前2種標(biāo)記不同，SCoT標(biāo)記是利用植物基因組中ATG翻譯起始位點側(cè)翼保守序列來設(shè)計引物，對偏向候選功能基因區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[10-13]?？梢?，3種標(biāo)記所具有的不同擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域及特點導(dǎo)致了其擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生不同的多態(tài)性。本研究結(jié)果為苜蓿分子標(biāo)記的高效利用提供一定科學(xué)依據(jù)。

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Analysis on Detection Efficiency of Different Types of Molecular Markers in Alfalfa Genome

WANG Jiansheng1,HOU Guiling1,XIE Yongfeng2
(1.Pingdingshan University,Pingdingshan 467000,China; 2.Grassland Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Hohhot 010010,China)

In order to select the suitable molecular marker for detection of alfalfa genome,19 domestic and foreign alfalfa germplasm as materials,the detection efficiency in alfalfa genome was compared for several types of molecular markers including ISSR,SCoT and RAPD.Results showed that there was great difference among the different types of molecular markers.The higher screening ratio of primer was found for RAPD,and it reached 41.18%.The higher number of total loci and polymorphic loci were also detected for RAPD.ISSR had the higher percentage of polymorphic loci,and its percentage of polymorphic loci reached 96.25%.For the effective allele number,Nei’s gene diversity index,Shannon’s information index,SCoT performed better than other types of molecular markers.These results demonstrated that the different molecular markers had advantages and disadvantages in different detection index, and these molecular markers should be used comprehensively.

alfalfa; molecular markers; detection efficiency

2015-10-24

河南省科技廳科技攻關(guān)項目(KJT142102110171)；平頂山市科技計劃項目(2014086)

王健勝(1978-)，男，陜西禮泉人，講師，博士，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail:wjsheng1998@163.com

S816

A

1004-3268(2016)04-0130-04