血清（尿）鈣檢測(cè)方法中影響因素的綜述

靳丹虹，梁芳慧，牛艷秋，董麗丹，藺首睿，高雅靜長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林長(zhǎng)春　130031

血清（尿）鈣檢測(cè)方法中影響因素的綜述

靳丹虹，梁芳慧，牛艷秋，董麗丹，藺首睿，高雅靜
長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長(zhǎng)春130031

血清（尿）鈣檢測(cè)能為臨床評(píng)價(jià)病患肌體鈣離子的代謝水平和疾病診斷提供重要的參考依據(jù)。通過(guò)對(duì)臨床常用血清（尿）鈣檢測(cè)的基本原理、影響測(cè)定結(jié)果的因素及改進(jìn)措施等關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行探討，為血清（尿）鈣檢測(cè)方法的改進(jìn)和臨床準(zhǔn)確檢驗(yàn)提供參考。

尿鈣；血清鈣；檢測(cè)方法

［Abstract］Serum（urine）calcium detection can provide important reference basis for clinical evaluation of metaboilic level of body calcion of patients and disease diagnosis.The paper provides reference for the improvement and clinical accurate test of the serum （urine）calcium detection method by studying the key issues of the basic principle of the common serum （urine）calcium detection in clinic，influencing factors of test results and improvement measures.

［Key words］Urine calcium；Serum calcium；Test method

血清（尿）鈣的檢測(cè)是臨床常用的化驗(yàn)項(xiàng)目，血清（尿）鈣的變化能反映機(jī)體鈣的代謝變化，血清鈣和尿鈣的變化具有一定的相關(guān)性，兩者對(duì)疾病的診斷、監(jiān)測(cè)和治療具有重要的臨床意義［1］。血清（尿）鈣檢測(cè)方法有多種，但是未見(jiàn)對(duì)分析原理和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響的各因素的探討。每種分析方法由于原理不同，血清（尿）標(biāo)本成份復(fù)雜，存在的影響因素也各有差異。因此，有必要對(duì)臨床檢測(cè)過(guò)程中的各影響因素進(jìn)行探討，為技術(shù)開(kāi)發(fā)人員和化驗(yàn)室分析人員對(duì)血清（尿）鈣檢測(cè)方法的改進(jìn)和化驗(yàn)室的臨床準(zhǔn)確檢測(cè)提供參考。

1　EDTA滴定法

乙二胺四乙酸二鈉鹽簡(jiǎn)稱EDTA。標(biāo)本中的鈣離子在堿性溶液中與鈣紅指示劑結(jié)合生成可溶性的紅色絡(luò)合物，使溶液呈淡紅色；當(dāng)用EDTA滴定液滴定已加入少量鈣紅指示劑的標(biāo)本時(shí)，EDTA先與游離的鈣離子反應(yīng)，當(dāng)游離鈣離子較少時(shí)EDTA奪取紅色化絡(luò)合物中的鈣，鈣紅指示劑游離，溶液的顏色由鈣紅指示劑—鈣絡(luò)合物的紅色轉(zhuǎn)變?yōu)殁}紅指示劑的藍(lán)色停止滴定。根據(jù)血清（尿）的體積、EDTA滴定液的濃度和消耗的體積計(jì)算鈣的含量。EDTA滴定法能準(zhǔn)確反映肌體24 h鈣的代謝變化值［2］。EDTA滴定法中用10%的NaOH溶液調(diào)pH 12～13，在此pH下鎂離子生成沉淀可以避免對(duì)鈣測(cè)定的干擾。鈣紅指示劑在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定褪色快，導(dǎo)致終點(diǎn)不易掌握，在NaOH中加入硫脲作為穩(wěn)定劑可以提高鈣紅指示劑在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)退色時(shí)間。血清中少量的Mg2+，Hb，總膽紅素，脂濁對(duì)測(cè)定無(wú)影響［2-3］。

2　甲基百里香酚藍(lán)比色法

甲基百里香酚蘭（又稱甲基麝香草酚蘭，MTB）是一種優(yōu)良的金屬絡(luò)合劑。鈣離子在堿性溶液中與甲基百里香酚藍(lán)結(jié)合生成藍(lán)色的絡(luò)合物，利用藍(lán)色絡(luò)合物在可見(jiàn)光區(qū)對(duì)光的吸收值與標(biāo)本中鈣的量成正比。甲基百里香酚藍(lán)比色法已有試劑盒在臨床使用［4］。標(biāo)本中加入8-羥基喹啉能消除鎂離子對(duì)測(cè)定的干擾，標(biāo)本中NaCl的濃度變化對(duì)血清鈣離子的測(cè)定有一定影響，離子強(qiáng)度增加鈣離子的測(cè)定產(chǎn)生正誤差，血清中少量的Mg2+、Hb、總膽紅素、脂濁對(duì)測(cè)定無(wú)影響［5］。

3　鄰甲酚酞絡(luò)合酮法

鄰甲酚酞絡(luò)合酮法為中等實(shí)驗(yàn)室測(cè)定血清鈣的常規(guī)方法，鄰甲酚酞絡(luò)合酮（OCPC）在堿性溶液如二乙胺中能與鈣絡(luò)合生成OCPC-鈣紫紅色絡(luò)合物，OCPC-鈣紫紅色絡(luò)合物在575～600 nm附近有吸收峰，吸光度值與鈣的量成正比，絡(luò)合物的吸光度值在1 h內(nèi)穩(wěn)定［6］。

試劑8-羥基喹啉可以掩蔽鎂離子，8-羥喹啉易被氧化失去掩蔽Mg2+的作用，故工作液應(yīng)新鮮配備使用或配成酸性儲(chǔ)備液試劑中加入KCN可以掩蔽Mg2+以外的其他重金屬，增加反應(yīng)穩(wěn)定性［7］。孫慶艷等［8］的研究表明，堿性條件下鄰甲酚酞絡(luò)合酮不穩(wěn)定，加入二甲基亞砜作為穩(wěn)定劑，亦可使輕度脂血標(biāo)本反應(yīng)液澄清，并可消除蛋白影響。該法中鈣的測(cè)定結(jié)果與血液pH值呈負(fù)相關(guān)，樣本暴露于空氣中會(huì)引起pH變化，因此最好實(shí)時(shí)檢測(cè)。

試劑盒所需試劑的加入順序?qū)y(cè)定結(jié)果有一定的影響［9］，針對(duì)不同的產(chǎn)品在投入臨床檢驗(yàn)前應(yīng)對(duì)試劑的加入順序做對(duì)比研究。采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定鈣時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)［10-11］測(cè)定其他項(xiàng)目使用的胱抑素C（CysC）試劑，尿酸酶-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)法試劑等對(duì)鈣的測(cè)定有干擾。因此使用全自動(dòng)生化分析儀時(shí)要注意對(duì)每項(xiàng)檢測(cè)所用器皿進(jìn)行徹底清洗，避免交叉污染。

4　偶氮胂Ⅲ法

游離的偶氮胂Ⅲ（ArenazoⅢ）呈紫紅色，在堿性條件下ArenazoⅢ與鈣絡(luò)合形成藍(lán)紫色ArenazoⅢ—鈣的絡(luò)合物。當(dāng)用EDTA滴定有少量ArenazoⅢ指示劑的標(biāo)本時(shí)，EDTA與游離鈣結(jié)合完畢后，繼續(xù)滴入的EDTA將奪取ArenazoⅢ—鈣絡(luò)合物中的鈣，ArenazoⅢ—鈣絡(luò)合物被解離，在660 nm附件反應(yīng)液吸光度的下降值與鈣濃度在一定范圍內(nèi)成正比，吸光度值在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

血清鈣檢測(cè)過(guò)程中黃疸較深、乳糜血的標(biāo)本采用氮胂Ⅲ法測(cè)定時(shí)應(yīng)做樣本空白對(duì)照試驗(yàn)，少量的膽紅素、結(jié)合膽紅素、乳糜、抗壞血酸、血紅蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)明顯干擾［12］。采用全自動(dòng)生化儀分析時(shí)其他測(cè)定項(xiàng)目中加入的生化試劑、酶類試劑或有酶促反應(yīng)的試劑中所添加的EDTA、EGTA、檸檬酸鹽等螯合劑，若處理不當(dāng)易發(fā)生交叉污染，標(biāo)本盛放器皿選擇不當(dāng)對(duì)測(cè)定亦能產(chǎn)生干擾［13-15］。

5　酶法分析

酶的選擇性高，一般酶只催化一種反應(yīng)，或者說(shuō)只能催化某種特定的化合物或?qū)μ囟ǖ幕瘜W(xué)鍵起作用［16］。Ca2+激活的豬胰腺α一直鏈淀粉酶方法，標(biāo)本中的Ca2+可激活α-淀粉酶反應(yīng)體系產(chǎn)生CNP，CNP濃度的增加與鈣離子濃度成正比關(guān)系，監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系405 nm處吸光度的變化可以獲得血清（尿）中Ca2+的含量。

脲酰胺酶（EC3，5，1，4，5）谷氨酸脫氫酶（GLDH，EC1，4，1，4）測(cè)定血清鈣和尿鈣。其反應(yīng)機(jī)理可能是鈣影響了酶-ATP-Mg復(fù)合物對(duì)尿素的羧化，鈣和鎂以及鈣和三磷酸腺苷（ATP）之間的抑制是非競(jìng)爭(zhēng)性的，這種酶的抑制作用與鈣離子濃度成正比，檢測(cè)340 nm處的吸光度變化可以獲得鈣離子濃度［17］。

豬胰腺α一直鏈淀粉酶法不受各種正離子特別是鎂離子、血清蛋白及其他物質(zhì)的影響，為了消除氯的影響，防止Ca2+與淀粉酶的過(guò)快結(jié)合在試劑中加入適量的NaCl和絡(luò)合劑BAPTA，GEDTA等［16］。采用脲酰胺酶（EC35.1.45）谷氨酸脫氫酶（GLDH.EC1.4.1.4）測(cè)定血清鈣，適宜的pH7.5～8.0，可以排除內(nèi)源性銨離子的干擾。試劑中加入適量NaCl及綜合劑（如GEDTA）可消除Cl-的干擾，調(diào)整Ca2+與酶的結(jié)合速度。脲酰胺酶法測(cè)定血清鈣時(shí)標(biāo)本的黃疸較深和乳糜血等對(duì)結(jié)果影響較大，溶血、重度黃疸、嚴(yán)重脂血的標(biāo)本應(yīng)做樣本空白對(duì)照試驗(yàn)，少量的NH4+、Mg2+對(duì)測(cè)定無(wú)干擾［17］。

6　離子選擇電極法

鈣電極是對(duì)離子鈣活度具有選擇性電位響應(yīng)的一種離子選擇性電極。楊憲園等［18］采用離子選擇電極法測(cè)定血清和尿液中鈣離子濃度對(duì)失重性骨丟失進(jìn)行評(píng)價(jià)。標(biāo)本的pH對(duì)血清（尿）鈣測(cè)定結(jié)果有一定影響［19-22］。尿液在空氣中長(zhǎng)時(shí)間放置pH值會(huì)升高將引起離子平衡的移動(dòng)，導(dǎo)致尿離子鈣濃度下降，因此尿樣在分析前不宜在空氣中曝露放置過(guò)久。血清樣本在酸性條件下會(huì)促使蛋白結(jié)合鈣解離，使得測(cè)得的鈣濃度增高。當(dāng)被測(cè)血清樣本的pH值偏堿性時(shí)，離子鈣和其他成分結(jié)合加強(qiáng)，使測(cè)得的血清鈣濃度降低。在實(shí)際工作中血液樣本長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中會(huì)導(dǎo)致pH值升高，此外體液酸堿紊亂患者的血清樣本直接測(cè)定血清（尿）鈣亦存在誤差，對(duì)上述情況將樣本pH值校準(zhǔn)到7.4的標(biāo)準(zhǔn)離子鈣值能增加測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。該方法不受溶血、黃疸、脂血的干擾。

磷濃度對(duì)離子鈣的測(cè)定有明顯的負(fù)影響，磷的濃度達(dá)到或超過(guò)2.5 mmol/L時(shí)離子鈣測(cè)定結(jié)果明顯受到影響，此時(shí)臨床要綜合考慮測(cè)定所用的方法、血磷的濃度等情況來(lái)指導(dǎo)臨床的診斷和治療［22］。

7　原子吸收光譜法

原子吸收法是用于微量元素檢測(cè)的金典方法，在臨床應(yīng)用廣泛［23］。標(biāo)本中鈣元素對(duì)其特征譜線光的吸收強(qiáng)度與其量在一定條件下呈線性關(guān)系，因此利用原子吸收分光光度計(jì)可以對(duì)血清（尿）中的鈣進(jìn)行定量分析。

在尿中存在著多種離子，在原子化過(guò)程中，可以形成穩(wěn)定的酸性復(fù)合物，從而降低鈣的原子化率［24］。鄧通洋等的研究［12，24］發(fā)現(xiàn)標(biāo)本中加入試劑EDTA、SrCl2、氯化鑭、硝酸鍶等能消除尿液樣本分析中的化學(xué)干擾，提高鈣的原子化率，血清出現(xiàn)嚴(yán)重溶血不干擾測(cè)定結(jié)果。尿液較黃時(shí)，稀釋可降低尿基質(zhì)對(duì)鈣測(cè)定的干擾［25］。

原子吸收法光譜儀在使用中還要注意，每天要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、燈的能量等進(jìn)行校正，選擇合適的燈電流（最大工作電流的1/3～2/3左右）、燃燒器高度等儀器參數(shù)，確保檢測(cè)的準(zhǔn)確度［25］。

8　流動(dòng)注射法

流動(dòng)注射分析是一種管道化的連續(xù)流動(dòng)分析法。它主要包括將標(biāo)本溶液注入載流，標(biāo)本溶液與載流試劑混合和發(fā)生反應(yīng)，與載流混合反應(yīng)后的標(biāo)本在持續(xù)進(jìn)入系統(tǒng)載流的推動(dòng)下恒速地流進(jìn)紫外或熒光檢測(cè)器被檢測(cè)3個(gè)過(guò)程。

文獻(xiàn)報(bào)道［26］的流動(dòng)注射法利用的載流與鈣的顯色劑有甲基麝香草酚藍(lán)、鈣色素等。甲基麝香草酚藍(lán)顯色法適宜的反應(yīng)條件為:甲基麝香草酚藍(lán)的濃度0.08 mmol/ L，8-羥基喹啉的濃度2.0 g/L，聚乙烯吡咯烷酮的濃度1.5 g/L，鹽酸的濃度0.025 mol/L，無(wú)水亞硫酸鈉的濃度6.0 g/L，單乙醇胺的濃度5.5%。鈣色素顯色法適宜的測(cè)定反應(yīng)條件為:鈣色素濃度為0.020%，氫氧化鉀溶液0.020%。

臨床檢測(cè)前流動(dòng)注射法要根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品的吸光度（熒光）強(qiáng)度選擇最佳的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)管長(zhǎng)度、載流流速等實(shí)驗(yàn)條件，來(lái)確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

9　其他檢測(cè)方法

對(duì)血清（尿）鈣的檢測(cè)方法還有蘇氏試劑法、偶氮氯磷法等。熒光探針在其他體系中對(duì)鈣的測(cè)定研究正在廣泛開(kāi)展［27-28］，試劑盒簡(jiǎn)便宜操作適用于家庭的日常快速檢測(cè)［29］，未來(lái)或許會(huì)在血清（尿）鈣的臨床測(cè)定中廣泛發(fā)揮作用。

10　結(jié)語(yǔ)

血清（尿）鈣的檢測(cè)方法多樣，研發(fā)快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單適用于臨床準(zhǔn)確檢測(cè)和家庭日常定期、快速檢測(cè)的儀器與試劑盒是檢驗(yàn)儀器發(fā)展的目標(biāo)。臨床檢驗(yàn)和分析儀器研發(fā)人員不但要掌握血清（尿）鈣檢測(cè)方法的原理，同時(shí)應(yīng)注意排除化驗(yàn)中的各影響因素才能為臨床提供穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠的血清（尿）鈣結(jié)果。

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Review of Influencing Factors in the Serum（Urine）Calcium Detection Method

JIN Dan-hong，LIANG Fang-hui，NIU Yan-qiu，DONG Li-dan，LIN Shou-rui，GAO Ya-jing
Changchun Medical College，Changchun，Jilin Province，130031 China

R446

A

1672-5654（2016）05（a）-0195-04

靳丹虹（1965-），女，吉林通化人，本科，教授，主要從事檢驗(yàn)儀器分析、分析化學(xué)的教育與研究工作。

2016-01-28）