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    研究基因沉默途徑的幾種篩選系統(tǒng)概述

    2016-02-06 18:47:21陳黃曌劉延波余海尤鄧曉旭王永芬
    中國農(nóng)業(yè)信息 2016年11期
    關(guān)鍵詞:突變體擬南芥甲基化

    陳黃曌,劉延波,余海尤,鄧曉旭,王永芬

    (河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院生物工程學(xué)院,鄭州 450046)

    研究基因沉默途徑的幾種篩選系統(tǒng)概述

    陳黃曌,劉延波,余海尤,鄧曉旭,王永芬

    (河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院生物工程學(xué)院,鄭州 450046)

    在真核生物中,基因表達的表觀遺傳控制,在應(yīng)對病毒入侵、轉(zhuǎn)座子易位和轉(zhuǎn)基因片段插入過程中,發(fā)揮著重要作用。在植物中,轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因的沉默,主要通過轉(zhuǎn)錄基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)或者轉(zhuǎn)錄后基因沉默途徑(posttranscriptional gene silencing,PTGS)。TGS通常是由轉(zhuǎn)入基因的多拷貝或由轉(zhuǎn)基因片段插入到了染色體的特定區(qū)域引起的,受內(nèi)源基因啟動子啟動的轉(zhuǎn)基因表達,可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因及該內(nèi)源基因的沉默,該過程可能通過RNAs介導(dǎo)完成。擬南芥屬雙子葉開花植物,花期較短,且已經(jīng)完成全基因組測序及注釋工作。目前,作為一種模式研究植物,植物表觀遺傳學(xué)研究者利用擬南芥,通過遺傳篩選結(jié)合蛋白和分子生物學(xué)方法,研究DNA甲基化、組蛋白修飾和基因表達調(diào)控的表觀遺傳分子機制,通過構(gòu)建不同的篩選系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),參與到RdDM(RNA-directed DNA methylation)及其它途徑中的新基因,并借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究工具,具體闡明該新發(fā)現(xiàn)基因,在整個甲基化調(diào)控中的作用機理。文章以甲基化調(diào)控為研究對象,對當(dāng)前具有代表性的篩選系統(tǒng)做概括介紹。

    DNA甲基化 基因沉默 RdDM 篩選系統(tǒng)

    與原核生物不同,真核生物的遺傳信息儲存,在以組蛋白八聚體包裹著DNA組成的核小體中,并以染色質(zhì)形式存在。因此,基因的表達調(diào)控就不可避免地受到DNA和組蛋白表觀遺傳修飾的影響,尤以DNA甲基化修飾最為常見[1]。DNA甲基化是指,在胞嘧啶堿基端添加一個甲基基團。在哺乳動物中,DNA甲基化專一性的發(fā)生在對稱的CG背景下,占到了整個基因組比例的70%~80%;在植物中,DNA甲基化發(fā)生在以下的序列背景:對稱的CG、CHG和不對稱的CHH(H = A T or C)。其中,CG和CHG序列背景下的甲基化,主要是由MET1 和CMT3兩個基因編碼蛋白維持的,而CHH序列背景下的DNA甲基化則由DRM2基因編碼蛋白從頭合成來維持的,與哺乳動物不同,植物中DNA甲基化,主要發(fā)生在轉(zhuǎn)座子和其它DNA重復(fù)序列原件[2]。

    植物中DNA甲基化的從頭合成,最初被發(fā)現(xiàn)是由小RNA介導(dǎo)的[3],目前已被命名為RdDM(RNA指導(dǎo)下的DNA甲基化)途徑,PolIV和PolV(DNA依賴的RNA聚合酶)是植物所編碼特有的兩個聚合酶,也是RdDM所必需的[4]。在RdDM途徑中,由PolIV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈RNA,經(jīng)RDR2(RNA依賴的RNA聚合酶)基因編碼蛋白被合成雙鏈,之后,由DCL3基因編碼蛋白被加工為24 nt siRNA,并以單鏈形式被轉(zhuǎn)載到AGO4蛋白上,形成AGO-siRNA復(fù)合體。同時,由PolV在靶位點轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的非蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄本作為支架[5]。研究表明,KTF1基因編碼蛋白可以結(jié)合由PolV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的scaffolds,并招募AGO4蛋白形成AGO-siRNA復(fù)合體,并與IDN2蛋白和DDR復(fù)合體形成更大的RdDM效應(yīng)子蛋白復(fù)合體,之后,該效應(yīng)子蛋白復(fù)合體,通過一種未知的機制招募到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶到基因組特定位點,從而實現(xiàn)對靶位點的甲基化沉默[6]。

    1 RD29Apro:LUC 篩選系統(tǒng)

    RD29A是植物逆境脅迫應(yīng)答基因,啟動子區(qū)域含有ABA、干旱、鹽和冷脅迫應(yīng)答元件[7]。朱健康實驗室將RD29A啟動子與LUC基因連接,構(gòu)建成為RD29Apro:LUC表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)入到野生型擬南芥C24中,轉(zhuǎn)基因的擬南芥因此獲得2個甚至以上RD29A啟動子的拷貝數(shù)。經(jīng)過多代篩選后,獲得RD29A-LUC轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達的株系,對該株系進行EMS誘變處理后,在M2代中,經(jīng)過鹽處理后篩選異常發(fā)光的突變體[8],經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)其中一個突變體,在經(jīng)過鹽脅迫處理后,失去發(fā)光能力。以此,將該突變體命名為ros1。通過圖位克隆,對該位點進行精細(xì)定位,并進行克隆測序,結(jié)果顯示,該ROS1基因編碼具有Ⅲ型核酸內(nèi)切酶功能域核蛋白,和參與DNA損傷修復(fù)的HhH-GPD超家族蛋白,具有顯著的相似性。關(guān)于其功能的描述有兩種假說:一種認(rèn)為ROS1蛋白可能參與阻止由smRNAs引發(fā)的DNA甲基化反應(yīng);另一種學(xué)說則認(rèn)為ROS1蛋白直接作用DNA的去甲基化反應(yīng),從而抑制特定DNA序列的過度甲基化水平[9]。該實驗結(jié)果得出的結(jié)論與后一種假說一致,在ros1突變體中,由于ROS1蛋白去甲基化功能的缺失,整個基因組甲基化水平處于較高的狀態(tài),因此,轉(zhuǎn)基因被沉默,報告基因不會發(fā)出熒光。在此基礎(chǔ)上,以該ros1突變體為背景,實驗室又構(gòu)建出一種篩選系統(tǒng),即RD29Apro:LUC/ros1篩選系統(tǒng)。

    2 SDCpro:GFP篩選系統(tǒng)

    研究表明,SDC(Suppressor of drm2cmt3)基因在擬南芥多個組織中的表達,受到DRM2和 CMT3的表達抑制,因此,SDC的表達沉默在drm2cmt3雙突變體中,而非各自單突變體中能夠得到釋放,SDC基因啟動子區(qū)域含有7個串聯(lián)重復(fù)區(qū)域,可招募結(jié)合DNA甲基化蛋白,進而引起該基因的沉默。通過分子操作實驗,將SDC啟動子和綠色熒光蛋白GFP連接構(gòu)建融合表達篩選系統(tǒng),將含有該SDCpro:GFP的融合載體,通過農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中,由于SDC啟動子區(qū)域串聯(lián)重復(fù)序列的存在,轉(zhuǎn)基因擬南芥中GFP基因的表達因此被沉默,通過EMS突變處理后,從中篩選出GFP基因表達沉默被釋放的突變體。Steven E. Jacobsen實驗室通過該種方法,成功尋找到參與到甲基化沉默途徑的新基因AtMORC6[10]。研究表明,基因編碼蛋白含有一保守的腺苷三磷酸酶結(jié)構(gòu)域[11],可能參與了染色質(zhì)超級結(jié)構(gòu)的重塑化過程,其作用機理可能是通過與RdDM途徑中的DMS3蛋白相互作用,參與到RdDM過程,實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控,也有的研究直接將AtMORC6/DMS11列為RdDM作用機制中的一個新成員基因。AtMORC6基因的發(fā)現(xiàn)證明,SDCpro:GFP篩選系統(tǒng),可以成功的用于篩選參與甲基化調(diào)控途徑的新成員基因,且SDC作為RdDM途徑直接作用的靶位點[12],受甲基化影響而沉默,使得該篩選系統(tǒng)更具有針對性。該系統(tǒng)的創(chuàng)新之處,就在于利用植物了內(nèi)源基因,啟動子區(qū)域特有的重復(fù)序列結(jié)構(gòu),作為研究途徑的靶位點兩大優(yōu)勢,特異性地篩選新功能基因。

    3 d35S:LUC-AP2篩選系統(tǒng)

    LUC(LUCIFERASE)常作為報告基因被轉(zhuǎn)入作為水稻和煙草中,通過與底物反應(yīng)發(fā)出熒光,借此研究轉(zhuǎn)基因表達。陳雪梅實驗室將兩個35S啟動子串聯(lián)排列,分別啟動LUC和NPTⅡ(抗性篩選標(biāo)記)基因表達,構(gòu)建雙元35S啟動子融合熒光素酶表達系統(tǒng)構(gòu)建篩選系統(tǒng),并與LUC基因末端融合一段AP2序列。該AP2序列包含miR172 結(jié)合位點,形成d35S:LUC-AP2和d35S:NPTⅡ結(jié)構(gòu)。該系統(tǒng)同時篩選分別參與RdDM和miRNAs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默途徑的新基因,為消除轉(zhuǎn)錄后基因沉默造成的影響,該表達系統(tǒng)通過農(nóng)桿菌被轉(zhuǎn)入到rdr6突變體中[13-14],分離得到LUC信號中等強度水平的株系,將其命名為LUCH(LUC repressed by CHH methylation),通過EMS誘變處理后,從中篩選熒光信號高和低強度的突變體,并通過該系統(tǒng)篩選得到已知的參與DNA甲基化修飾的MOM1和ROS1等基因。除此之外,該系統(tǒng)同時篩選得到一新基因AMP1。該基因編碼產(chǎn)物為一膜整合蛋白,與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和AGO1相關(guān)聯(lián),AGO1是與膜相關(guān)的主要miRNAs效應(yīng)子蛋白[15],表明該蛋白主要參與擬南芥miRNAs介導(dǎo)的翻譯抑制過程[14],miRNAs主要通過作用于target mRNAs實現(xiàn)翻譯的抑制調(diào)控。但,該發(fā)生過程的亞細(xì)胞定位一直沒有被闡明,通過對AMP1亞細(xì)胞定位的鑒定和miRNAs作用的target mRNAs的分布研究,證實了miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制過程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

    目前,文獻已報道的篩選系統(tǒng),遠(yuǎn)不止于以上3種,調(diào)控植物甲基化的方式也不止于RdDM、

    DDM1等。從就目前已經(jīng)報道的篩選系統(tǒng)所得到的結(jié)果可看出,某些基因,如典型的RdDM途徑蛋白AGO4及不依賴于RdDM途徑的MOM1蛋白,在不同的篩選系統(tǒng)中,幾乎都可以被重復(fù)篩到,表明基因沉默的機理本身十分復(fù)雜,不同的沉默途徑之間并不是嚴(yán)格獨立的,相互之間可能存在著功能上的部分重疊,甚至是相互作用。隨著研究的深入,多數(shù)篩選系統(tǒng)對新基因的發(fā)掘趨于飽和,使新基因的發(fā)掘越來越有限。未來的研究,可能要通過構(gòu)建更加具有針對性的篩選系統(tǒng),對介導(dǎo)甲基化沉默的不同通路之間的相互作用,進行深入探究,進一步揭示表觀遺傳學(xué)的分子機理。

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