Micro-CT分辨率對松質骨微觀結構測量的影響

閻國強 ， 舒 熊 ， 劉莉莉 ， 趙丹慧， 謝富強

(1. 北京市創(chuàng)傷骨科研究所， 北京西城100035; 2. 北京積水潭醫(yī)院， 北京西城100035；3.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院， 北京海淀100193)

Micro-CT分辨率對松質骨微觀結構測量的影響

閻國強1,2， 舒 熊1,2， 劉莉莉2， 趙丹慧1,2， 謝富強3

(1. 北京市創(chuàng)傷骨科研究所， 北京西城100035; 2. 北京積水潭醫(yī)院， 北京西城100035；3.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院， 北京海淀100193)

目的：探索Micro-CT在研究小鼠骨小梁結構參數時的最適分辨率。方法：Micro-CT掃描正常小鼠股骨得到松質骨結構參數, 掃描分辨率為5 μm，通過對合并像素點將分辨率降低至10 μm到50 μm，分別測量不同分辨率下松質骨標本的結構參數，應用統(tǒng)計學分析比較結構參數在不同分辨率下的差異。結果：隨著分辨率從5 μm到50 μm按5 μm一個梯度的降低，BV/TV、BS/BV、Tb.N和Tb.Pf呈現下降趨勢，Tb.Th和Tb.Sp呈現上升趨勢，而SMI和DA的變化趨勢不明顯。BS/BV、Tb.N和Tb.Pf分別在40 μm、20 μm和10 μm時與對照組出現明顯統(tǒng)計學差異，Tb.Th和Tb.Sp也分別在25 μm和50 μm時出現顯著性差異，BV/TV、SMI和DA未出現顯著性差異。結論：該試驗證實了不同分辨率對Micro-CT測量小鼠松質骨顯微結構有顯著影響。Tb.Pf對分辨率的變化敏感度很高，最合適分辨率為5 μm；若不考慮Tb.Pf，其余七個參數的最合適分辨率是20 μm。

小鼠；松質骨；Micro-CT；結構參數；分辨率

傳統(tǒng)的組織形態(tài)學在評價骨組織微觀結構形態(tài)方面有很多不足。因為松質骨的主要特點在于其骨結構的多孔性[1-3]，而骨小梁的結構如只能顯示很小一部分的組織形態(tài)，且只是在二維(two dimension, 2D)層面做出診斷，不能確切地描述骨小梁的三維立體結構。

近年來微型計算機斷層掃描(micro-computed tomography, Micro-CT)在科學研究中的應用日趨廣泛，如骨骼、牙齒和生物材料等領域[4]。和其他檢測手段相比，Micro-CT的獨到之處在于，能夠以非常高的分辨率對標本進行檢測的同時，不破壞檢測對象的內部結構[5]。

伴隨Micro-CT在松質骨小梁的分辨率的要求也越來越高(幾微米到亞微米級)。而使用高分辨率的直接結果就是圖片像素高，占用存儲空間大。當使用軟件對數據進行分析時，一個標本往往要花數個小時甚至十幾個小時，導致分析的效率顯著下降。為了解決這個問題，本試驗采用原始高分辨率圖像通過合并像素點降低分辨率后再進行分析，尋求最適合的分析分辨率，以達到既不影響數據的準確性，又能大大節(jié)省分析數據的時間。

1 材料與方法

1.1 標本準備

SPF級C57雌性小鼠5只，體重(18～25)g，3月齡。均購自北京維通利華實驗動物中心[SCXK(京)2013-0011]，飼養(yǎng)于北京積水潭醫(yī)院動物實驗室SPF屏障設施[SYXK(京)2012-0027]內的IVC籠盒內，個體自由取水和飼料，24 h恒溫恒濕。室溫維持在(25±2)℃，濕度保持在(55±5)%，每天保持12 h的晝夜循環(huán)。

適應性飼養(yǎng)2周后，麻醉并實施安樂死術，取左側后肢去除軟組織后，將股骨置于福爾馬林中固定。掃描前將標本從福爾馬林中取出并置于生理鹽水中過夜。所有操作符合實驗倫理委員會的要求。

1.2 Micro-CT掃描

將左側股骨放置于圓柱形的聚丙烯掃描杯中，使用Micro-CT(SKYSCAN 1172，Belgium)掃描，掃描范圍是股骨遠端1/3部分。掃描參數包括：球管電壓45 kv；電流165 μA；曝光時間500 ms；旋轉角度和步長分別是180°和0.4°；采用0.5 AL的filter；掃描分辨率為5 μm。掃描完畢后，采用設備自帶的重構軟件NRecon(V1.6.9.4)對掃描圖像進行重構得到立體分辨率為5 μm的bmp圖像。

使用CTan(V1.14.4)對數據進行分析，興趣區(qū)域(Region of Interest,ROI)為股骨遠端生長板上方100層至500層(共401層，見圖1)，厚度為2 005 μm的皮質骨內側松質骨。將原始圖像的分辨率按5 μm一個梯度降低，得到每個標本5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、45 μm、50 μm的圖像。本試驗中按分辨率共分10個組，其中5 μm組為對照組。通過Micro-CT自帶的軟件CTan計算8個結構參數(BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N、Tb.Pf、SMI和DA)(見表1)。

表1 小鼠骨小梁結構參數

圖1 小鼠股骨遠端骨小梁ROI選取范圍(以生長板為基準線)

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 10.0進行數據分析。比較不同的分辨率組和對照組(5 μm)之間的差異。在此方法中，圖像分辨率的改變是一個被處理因素，采用單因素方差分析進行比較,當P<0.05時，差異有顯著意義；當P<0.01時，差異有極顯著意義。

2 結果

從小鼠股骨遠端骨小梁的立體圖中可看到(見圖2)，隨著分辨率的降低，骨小梁丟失逐漸增加，同時伴隨分辨率的降低，各結構參數的變化不盡相同。 在本試驗中，隨著分辨率的降低，BV/TV、BS/BV、Tb.N和Tb.Pf呈現下降趨勢，Tb.Th和Tb.Sp呈現上升趨勢，而SMI和DA的變化趨勢不明顯。BS/BV、Tb.N和Tb.Pf分別在40 μm、40 μm和10 μm時與對照組出現明顯統(tǒng)計學差異。Tb.Th和Tb.Sp也分別在25 μm和50 μm時出現顯著性差異見圖2。而在本試驗中，隨著分辨率降低，BV/TV、SMI和DA未出現顯著性差異。Tb.Pf對分辨率的變化敏感度很高，最適分辨率為5 μm；若不考慮Tb.Pf，其余7個參數的最適分辨率是20 μm(見表2)。

圖2 小鼠股骨遠端骨小梁立體圖(5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、45 μm、50 μm)

圖3 各結構參數隨分辨率降低的變化趨勢
(*:P<0.05， **:P<0.01)

表2 各結構參數適用的分辨率范圍

3 討論

Micro-CT是一臺精密儀器，可用于骨科學、材料學等領域。有不少學者發(fā)現，Micro-CT得出的結構參數都對分辨率有強烈的依賴性[6]。但高精度的掃描數據導致掃描和重建的數據量龐大，分析時間耗費巨大。例如在本試驗中，使用Micro-CT進行小鼠股骨遠端分辨率為5 μm掃描并重建后的數據約占用硬盤空間12GB，而對這一數據進行CTan軟件分析時，一個樣本則耗時近10個小時，而這只是一個樣本的數據。若進行整體實驗數據分析時，不論是對數據的儲存空間還是分析時間，都是一個難題。所有我們推測，在理論上存在一個臨界分辨率，采用此臨界分辨率，既不影響數據的準確性，又能大大節(jié)省分析數據的時間。

Perilli E[7]曾做過關于關于人腰椎結構參數隨著分辨率變化的試驗，他采用17 μm，34 μm，68 μm三個分辨率對骨小梁的BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N和SMI這5個參數進行比較分析，隨分辨率降低的變化趨勢和本試驗基本一致，但都在分辨率降低一倍時，即34 μm時都出現了顯著差異或極顯著差異。而本試驗中發(fā)現BV/TV、SMI對分辨率的變化不敏感，即在10-50 μm范圍內未出現顯著差異，且Tb.Th、Tb.Sp和Tb.N分別在25 μm、50 μm和40 μm時出現顯著差異，即他們分別是在5倍、10倍和8倍最高分辨率時出現顯著差異。差異的原因可能有以下幾點：一、動物間的種屬差異。本試驗采用的C57小鼠屬于近交系，個體差異很小。相比之下，人類脊柱的椎體骨小梁之間的差異會略大；二、機器型號的差異。本試驗使用的機器是專門用來掃描離體樣本的Micro-CT 1172，而Perilli E所使用的MIcro-CT 1076主要適用于活體樣本的掃描。對離體樣本來說，兩者在分辨率和精確性上差異較大；三、骨小梁厚度的差異。正常小鼠骨小梁厚度約30～40 μm，而人類骨小梁的厚度約80～120 μm。本試驗中可看到，隨著分辨率的降低，骨小梁丟失逐漸增加。同時伴隨分辨率的降低，各結構參數的變化不盡相同。但分辨率在20 μm時，除Tb.Pf外的七個結構參數并未表現出顯著差異。因此，本試驗認為當無Tb.Pf時，進行正常小鼠骨小梁分析時的最適分辨率為20 μm。

當然，本試驗尚存在一些不足之處。由于電腦運行速度的影響因素較多，如電腦配置、溫濕度、電腦運行時間等，本試驗未對各分辨率節(jié)省的時間做統(tǒng)計分析。另外，未對有骨質疏松的小鼠進行比較。下一步我們將分析不同的骨小梁結構和動物種屬與分辨率之間的關系。

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[3] El M F, Sapin D B E, Rhissassi K,etal. Apparent Young's modulus of vertebral cortico-cancellous bone specimens [J]. Computer Methods in Biomechanics & Biomedical Engineering, 2011, 15(1): 23-28.[4] Clark D P, Badea C T. Micro-CT of rodents: State-of-the-art and future perspectives [J]. Physica Medica, 2014, 30(6): 619-634.

[5] Isaksson H, T Yr S J, Hakulinen M,etal. Structural parameters of normal and osteoporotic human trabecular bone are affected differently by microCT image resolution [J]. Osteoporosis International, 2011, 22(22): 167-177.

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Theeffect of micro-CT resolution on measuring microstructure parameters of trabecular Bone

YAN Guo-qiang1, SHU Xiong1, LIU Li-li2, ZHAO Dan-hui1,XIE Fu-qiang3

(1. Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035 China; 2. Beijing Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing 100035, China; 3.College of Veterinary Medicine，China Agriculture University，Beijing 100193，China)

To explore the optimal resolution of Micro-CT in the study of the structural parameters of trabecular bone in mice.The trabecular bone of mice was scanned by micro-CT with the scanning resolution of 5μm, decreasing the resolution to 10μm ～50μm through the study of the multiplication of resolution so as to obtain the reduced-resolution micro-CT data. Then, the microstructural parameters were calculated by these images. Then the differences of structural parameters by these micro-CT data of different resolution were analyzed. Different parameters had different correlations with variations of the resolution. The value of BV/TV, BS/BV, Tb.Th and Tb.Pf declined, while the value of Tb.Pf and Tb.Sp increased when decreasing the resolution. In addition, there was no effect on the SMI and DA with variations of the resolution. BS/BV, Tb.N and Tb.Pf had statistically significant difference in 40μm, 20μm and 10μm compared with control group, respectively. Tb.Th and Tb.Sp had significant difference respectively in 25μm and 50μm, and BV/TV, SMI and DA had no significant difference. There is a significant effect of different resolutions on the accuracy of the micro-CT, when measuring the microarchitectural parameters of the trabecular bone. The change of Tb.Pf resolution sensitivity is high, the most suitable resolution was 5μm; without considering Tb.Pf, the most appropriate resolution of the remaining seven parameters is 20μm.

Mice; Trabecular bone; Micro-CT; Architectural parameters; Resolution

s:ZHAO Dan-hui; XIE Fu-qiang

2016-11-15

閻國強(1982—)，男，技師，碩士，研究方向為動物影像學和實驗動物，E-mail：117629867@qq.com

趙丹慧，E-mail：zhaodanhui@263.net；謝富強，E-mail：xiefuqiang@cau.edu.cn

S858.32

A

0529-6005(2016)12-0063-03