5-HT與慢傳輸型便秘相關(guān)性的研究

趙兵 孔鵬飛 吳至久 唐學(xué)貴

?論著?

5-HT與慢傳輸型便秘相關(guān)性的研究

趙兵 孔鵬飛 吳至久 唐學(xué)貴

目的通過建立大鼠慢傳輸型便秘模型，檢測(cè)便秘大鼠結(jié)腸5-HT的表達(dá)情況，探討5-HT與慢傳輸型便秘是否存在相關(guān)性。方法SD大鼠48只隨機(jī)分為4組：空白組，模型組，莫沙必利治療組，麻仁丸治療組?？瞻捉M大鼠用生理鹽水灌胃，便秘模型組和治療組大鼠用復(fù)方地芬諾酯灌胃，建立大鼠慢傳輸型便秘（STC）模型。模型建立后，治療組大鼠分別用莫沙必利、麻仁丸灌胃，觀察各組大鼠大便粒數(shù)及大便濕重。治療結(jié)束后將大鼠集體處死，取大鼠近端結(jié)腸標(biāo)本，用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸5-HT的表達(dá)情況。使用彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽性表達(dá)的平均光密度值（MD）進(jìn)行半定量分析。4組數(shù)據(jù)之間的比較采用方差分析。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示：便秘組結(jié)腸5-HT的MD值（0.453±0.028）大于空白對(duì)照組（0.148±0.011）、莫沙必利治療組（0.316±0.012）及麻仁丸治療組（0.291±0.010），t值分別為34.209、15.307、18.296，P均＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；莫沙必利治療組（0.316±0.012）和麻仁丸治療組（0.291±0.010）的MD值均大于空白對(duì)照組（0.148±0.011），t值分別為35.983、31.919，P均＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論便秘大鼠結(jié)腸5-HT的表達(dá)增高，可能影響腸神經(jīng)傳導(dǎo)功能，從而導(dǎo)致便秘的發(fā)病。

5-HT；慢傳輸型便秘；實(shí)驗(yàn)研究

便秘是由多種原因?qū)е碌拇竽c功能失常所致，以排便間隔時(shí)間延長，大便干結(jié)難解或雖有便意而排出困難為臨床表現(xiàn)的病癥。同時(shí)，便秘也是某些急慢性疾病中的一個(gè)癥狀，長時(shí)間便秘不及時(shí)治療，往往會(huì)給病人帶來痛苦和精神壓力，甚至引起嚴(yán)重后果，尤其是心腦血管意外［1］。慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是臨床上的常見病及多發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。目前對(duì)其病因研究主要是集中在以下幾個(gè)方面：藥物的濫用、不良的生活習(xí)慣、內(nèi)分泌疾病、心理因素等，而其發(fā)病機(jī)制的研究則主要集中在腸道動(dòng)力、腸神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸神經(jīng)肽、Cajal間質(zhì)細(xì)胞這幾個(gè)方面［2］。其中，對(duì)腸神經(jīng)遞質(zhì)的研究是近年來研究慢傳輸型便秘病因的熱點(diǎn)方向之一。5-HT作為重要的腸神經(jīng)遞質(zhì)，參與了腸道的動(dòng)力及感覺調(diào)節(jié)過程。為求進(jìn)一步探索5-HT與慢傳輸型便秘發(fā)病之間的關(guān)系，我們?cè)O(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立SD大鼠慢傳輸型便秘模型，探究5-HT在STC發(fā)病過程中的作用機(jī)制。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠48只，雌雄各半，體重（200±20）g，清潔級(jí)，由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

（二）實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

復(fù)方地芬諾酯（國藥準(zhǔn)字：H41023169，河南鼎昌藥業(yè)有限公司提供）。莫沙必利（國藥準(zhǔn)字：H20031110，成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供）。麻仁丸（國藥準(zhǔn)字：Z50020517，太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司提供）。大鼠5-HT一抗免疫組化試劑，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兔SP檢測(cè)試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

（三）主要儀器

主要儀器有微波爐，切片機(jī)，-80 ℃、-20 ℃、-4 ℃低溫冰箱，電子天平，Olypmus光學(xué)顯微鏡，微量移液器，電熱恒溫水浴鍋。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）動(dòng)物分組

48只SD大鼠，隨機(jī)分為4組：空白組、便秘模型組、莫沙比利治療組、麻仁丸治療組。

（二）動(dòng)物造模

根據(jù)萬錦州等［3］復(fù)方地芬諾酯造模方法稍作改進(jìn)，空白組大鼠每日給予生理鹽水0.2 mL/10 g，便秘模型組和治療組大鼠每日給予復(fù)方地芬諾酯10 mg/kg加入生理鹽水配制成混懸液灌胃，正常進(jìn)水進(jìn)食，連續(xù)7 d作為1個(gè)療程，連用3療程，療程間停藥1 d。第三療程末次給藥后記錄各組大鼠24 h內(nèi)大便粒數(shù)和大便濕重，確定慢傳輸型便秘模型的建立。

（三）藥物治療方法

空白組，不造模，不治療；模型組，只造模，不治療。便秘模型建立成功后：莫沙必利組，按2.5 mg/kg用藥量，加入生理鹽水配制成混懸液4 mL，通過灌胃給藥，連續(xù)3 d作為1個(gè)療程，共給藥2個(gè)療程，療程間停藥1 d，整個(gè)過程正常喂食進(jìn)水。麻仁丸組，按3.0 g/kg 用藥量，加入生理鹽水配制成混懸液4 mL，通過灌胃給藥，連續(xù)3 d作為1個(gè)療程，共給藥2個(gè)療程，療程間停藥1 d，整個(gè)過程正常喂食進(jìn)水。

（四）標(biāo)本采集

動(dòng)物模型建好后，用頸椎脫臼法集體處死所有大鼠，剖腹取近端結(jié)腸6 mm～8 mm，在生理鹽水中清洗干凈，放入4%多聚甲醛中固定，室溫保存。

（五）免疫組化檢測(cè)

取組織塊，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片；將組織切片放在60 ℃恒溫電烤箱中1 h后取出；切片經(jīng)脫蠟水化，抗原修復(fù)：滴加3% H2O2，在37 ℃下孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；滴加山羊血清封閉液，在37 ℃下孵育15 min；滴加一抗（1：100），4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜；滴加二抗（生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG），37 ℃孵育30 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃孵育15 min；DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，自來水充分沖洗。蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化；常規(guī)脫水、透明、封片及鏡檢。

所有切片都設(shè)陰性對(duì)照（不滴加一抗，PBS代替一抗），染色陽性結(jié)果為：5-HT陽性產(chǎn)物呈棕褐色或棕紅色。每張切片均隨機(jī)選取5個(gè)具有代表性的高倍鏡視野（×400），用高分辨率圖像分析儀Image-Proplus 6.0提供的工具來測(cè)定各視野的平均光密度（density mean，MD）值，MD值越大說明陽性細(xì)胞越多。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS19.0 軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用ANOVA方法分析，多組均數(shù)差別的多重比較應(yīng)用SLD和SNK方法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

各組大鼠近端結(jié)腸5-HT免疫組化結(jié)果示：主要表達(dá)于大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿，粘膜層及粘膜下肌層也有表達(dá)，呈棕紅色?？瞻捉M大鼠神經(jīng)元細(xì)胞陽性表達(dá)分布均勻；模型組與空白組相比，陽性表達(dá)較空白組增高。莫沙必利治療組、麻仁丸治療組與模型組相比，陽性表達(dá)降低，但與空白組相比，陽性表達(dá)升高（圖1～4）。

各組大鼠近端結(jié)腸5-HT表達(dá)平均光密度值（MD）統(tǒng)計(jì)顯示：空白組分別和便秘組（t值=34.209，P＜0.001）、莫沙必利組（t值=35.983，P＜0.001）、麻仁丸組（t值=31.919，P＜0.001）相比，其MD值低于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；便秘模型組分別和莫沙必利組（t值=15.307，P＜0.001）、麻仁丸組（t值=18.296，P＜0.001）相比，其MD值高于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；莫沙必利組和麻仁丸組的MD值比較（t值=5.488，P＜0.001），其MD值高于麻仁丸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

圖1 大鼠近端結(jié)腸5-HT免疫組化結(jié)果。5-HT蛋白主要表達(dá)于大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)無細(xì)胞胞漿，粘膜層及粘膜下肌層也有表達(dá)，呈棕紅色。圖1A 空白組結(jié)腸5-HT的表達(dá)（×400）；圖1B 便秘組結(jié)腸5-HT的表達(dá)（×400）；圖1C 莫沙必利組結(jié)腸5-HT的表達(dá)（×400）；圖1D 麻仁丸組5-HT的表達(dá)（×400）

討 論

隨著人們對(duì)慢傳輸型便秘研究的不斷深入，腸神經(jīng)遞質(zhì)在便秘發(fā)病機(jī)制中的作用越來越引起人們的重視。近年來，有關(guān)5-HT和便秘發(fā)病的研究逐漸增多。5-HT為一種吲哚類衍生物，又名血清素，能增強(qiáng)血管和平滑肌收縮。5-HT能神經(jīng)元廣泛的分布于胃腸道各層組織中，能調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)、感覺及分泌。5-HT與胃腸道受體（5-HT3、5-HT4受體）結(jié)合起作用，而通過5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在突觸間隙的再攝取滅活。因此，5-HT的合成和釋放過程，以及受體狀態(tài)等異常都可能導(dǎo)致系列的臨床癥狀改變。

作為腸神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT在引發(fā)胃腸蠕動(dòng)及調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺中起關(guān)鍵作用［4］。前期已經(jīng)有部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，5-HT與便秘的發(fā)病存在一定的相關(guān)性。如：雷懷成等［5］研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩型便秘腸神經(jīng)系統(tǒng)5-HT免疫反應(yīng)的異常變化，可能是結(jié)腸遲緩性便秘的神經(jīng)病理基礎(chǔ)。童衛(wèi)東等［6］通過免疫組化檢測(cè)慢傳輸型便秘患者乙狀結(jié)腸肌間叢一氧化氮和5-HT的變化，結(jié)果表明一氧化氮及5-HT免疫反應(yīng)性增強(qiáng)是患者結(jié)腸傳輸減慢的神經(jīng)病理基礎(chǔ)。Crowell MD等［7］認(rèn)為腸嗜鉻細(xì)胞和5-HT的信號(hào)改變可能導(dǎo)致胃腸動(dòng)力障礙，內(nèi)臟高過敏性以及腸道分泌的異常，5-HT參與腹瀉和便秘型腸易激綜合癥，慢傳輸型便秘的病理生理過程。陸敏等［8］通過對(duì)便秘患者結(jié)腸粘膜5-HT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，便秘患者5-HT表達(dá)明顯高于對(duì)照組。Sj?lund等［9］用免疫組化的方法檢測(cè)慢傳輸型便秘患者結(jié)腸粘膜神經(jīng)遞質(zhì)的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，便秘組患者升結(jié)腸的5-HT陽性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多。Shin等［10］研究發(fā)現(xiàn)高選擇性5-HT4受體激動(dòng)劑對(duì)慢性便秘的治療具有很高的安全性和可靠性。有學(xué)者通過臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-HT4受體激動(dòng)劑對(duì)功能性便秘的腸道傳輸功能具有明顯的改善作用［11］。Lee等［12］研究發(fā)現(xiàn)一種新型的5-HT4受體激動(dòng)劑可以增強(qiáng)小鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能。JM Hoffman等［13］研究認(rèn)為激活結(jié)腸粘膜5-HT4受體能夠增強(qiáng)腸道的傳輸功能。

表1 組大鼠結(jié)腸免疫組化5-HT表達(dá)平均光密度值（MD）比較（±s）

表1 組大鼠結(jié)腸免疫組化5-HT表達(dá)平均光密度值（MD）比較（±s）

注：*與空白組比較t值分別為34.209、35.983、31.919，P值均小于0.001；#與便秘模型組比較t值分別為15.307、18.296，P值均小于0.001；#組間比較t值=5.488，P＜0.001

分組 例數(shù) 5-HT平均光密度值空白對(duì)照組 12 0.148±0.011便秘模型組 12 0.453±0.028*莫沙比利治療組 12 0.316±0.012*#麻仁丸治療組 12 0.291±0.010*#

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，5-HT主要表達(dá)于大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿，粘膜層及粘膜下肌層也有表達(dá)。便秘模型組與空白組相比，陽性表達(dá)較空白組增高。經(jīng)莫沙必利、麻仁丸治療后，兩治療組與模型組相比，陽性表達(dá)降低。由此，我們推斷5-HT作為重要的腸神經(jīng)遞質(zhì)，通過在結(jié)腸的高表達(dá)，影響腸神經(jīng)傳導(dǎo)，從而形成結(jié)腸傳輸障礙，可能是導(dǎo)致便秘的作用機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)研究的發(fā)現(xiàn)，為我們探索便秘的發(fā)病機(jī)制及臨床藥物治療靶點(diǎn)提供了新的方向。

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Experimental study on the relationship between 5-HT and slow transit constipation

Zhao Bing,Kong Pengfei,Wu Zhijiu,Tang Xuegui.Anorectal Department,The Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China

Tang Xuegui,Email:txg668nc@sohu.com

ObjectiveTo detect the expression of 5-HT in the colon of rats with constipation by establishing the model of slow transit constipation(STC),and to explore the correlation between 5-HT and STC.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into 4 groups:blank group,model group,mosapride group,maren pill group.The rats of blank group were given normal saline by gastric irrigation,while the rats of model group and treatment groups were given diphenoxylate by intragastric administration before treated.When established the model of STC,the rats of treatment groups were respectively given mosapride,maren pills,and the stool grain and stool wet weight were observed.The proximal colons were collected.Expression of 5-HT in the proximal colon by immunohistochemistry were detected.The staining results were analyzed semi-quantitively by computerized color image analyzer as the following parameter:mean density.Data were analyzed by ANOVA.ResultsThe density means(MD)of 5-HT in the colon of model group(0.453±0.028)was greater than the control group(0.148±0.011)(t=34.209,P＜0.001),mosapride group(0.316±0.012)(t=15.307,P＜0.001),maren pill group(0.291±0.010)(t=18.296,P＜0.001),and the difference was statistically signifcant;The density means(MD)of mosapride group(0.316±0.012)(t=35.983,P＜0.001)and maren pill group(0.291±0.010)(t=31.919,P＜0.001)were higher than control group,which the difference was statistically significant.ConclusionThe increased expression of 5-HT in the colon of rats with constipation may affect on the intestinal nerve conduction function,which led to the incidence of constipation.

5-HT;Slow transit constipation;Experimental study

2016-10-17）

（本文編輯：楊明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.06.009

四川省杰出青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后續(xù)資助計(jì)劃（No.2011JQ0052）

637000 南充，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肛腸科

唐學(xué)貴，Email：txg668nc@sohu.com

趙兵,孔鵬飛,吳至久,等.5-HT與慢傳輸型便秘相關(guān)性的研究[J/CD].中華結(jié)直腸疾病電子雜志,2016,5(6):499-502.