應(yīng)用ITS2序列對(duì)八角茴香及其混偽品的分子鑒定研究

劉 鏞 李斯璐 林 好

1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣東省東莞市 523808 2廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省湛江市 524023

3廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 廣東省東莞市 523808 4廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 廣東省廣州市 510006

應(yīng)用ITS2序列對(duì)八角茴香及其混偽品的分子鑒定研究

劉 鏞1,2李斯璐3林 好4

1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣東省東莞市 523808 2廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省湛江市 524023

3廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 廣東省東莞市 523808 4廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 廣東省廣州市 510006

目的：對(duì)中藥材八角茴香及其混偽品進(jìn)行分子鑒定，為控制藥材質(zhì)量和指導(dǎo)臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。方法：通過(guò)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載中藥材八角茴香與其混偽品的DNA條形碼ITS2序列，利用MEGA6.06軟件進(jìn)行種內(nèi)、種間遺傳距離分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，應(yīng)用ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站預(yù)測(cè)其ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果：八角茴香與其混偽品的ITS2序列間存在明顯差異，基于ITS2序列的NJ樹(shù)及其ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)均可以將八角茴香與其混偽品明顯區(qū)分。結(jié)論：ITS2作為DNA條形碼序列能夠有效的鑒別八角茴香及其易混偽品。

八角茴香；DNA條形碼；混偽品；ITS2序列；分子鑒定

八角茴香為雙子葉植物藥木蘭科八角茴香（Illicium Verum）的干燥成熟果實(shí)，別名大茴香、廣茴香、大料，性辛、溫，具有溫陽(yáng)散寒、理氣止痛、健胃止咳的功效[1]。近年來(lái)，市場(chǎng)上發(fā)現(xiàn)有用莽草（Illicium lanceolatum）、大八角（Illicium majus）、平滑葉八角（Illicium leiophyllum）、厚皮香八角（Illicium ternstroemioides）、紅茴香（Illicium henryi）、紅花八角（Illicium dunnianum）、野八角（Illicium simonsii）、地楓皮果實(shí)（Illicium difengpi）等偽品冒充正品八角茴香使用。而八角茴香的鑒定方法主要是從基原、性狀、顯微、理化等方面進(jìn)行鑒別[2]，這些傳統(tǒng)的鑒定方法對(duì)操作人員的專業(yè)知識(shí)要求較高，存在主觀性強(qiáng)、穩(wěn)定性與重復(fù)性較差等方面的不足，不能夠快速準(zhǔn)確地鑒別八角茴香及其混偽品，難以滿足中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的要求。因此，亟需建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的鑒定中藥材八角茴香及其混偽品的方法。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)是分子鑒定技術(shù)的最新進(jìn)展，它是指用標(biāo)準(zhǔn)的、短的DNA片段作為物種標(biāo)記而建立的一種新的生物物種鑒定方法，由加拿大動(dòng)物學(xué)家、皇家學(xué)會(huì)會(huì)員Paul Hebert于2003年首先提出[3]。隨著分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)物種進(jìn)行鑒定已逐漸成為中藥材分類學(xué)的研究熱點(diǎn)[4]。其中，作為分子系統(tǒng)進(jìn)化研究中最重要的標(biāo)記之一，ITS2（internal transcribed spacer 2, ITS2）已被提出作為藥用植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列。然而，利用ITS2對(duì)八角茴香的相關(guān)鑒定研究尚未發(fā)現(xiàn)有專門(mén)報(bào)道。本研究利用ITS2序列對(duì)八角茴香及其混偽品進(jìn)行分子鑒定，為八角茴香的快速準(zhǔn)確鑒定及其開(kāi)發(fā)利用和安全用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所用材料包括八角茴香及其混偽品莽草、大八角、平滑葉八角、厚皮香八角、紅茴香、紅花八角、野八角、地楓皮果實(shí)共9個(gè)品種20份樣品，所用的ITS2系列來(lái)自Genbank下載，并且經(jīng)NCBI-Blast比對(duì)確認(rèn)為正確序列。

1.2 數(shù)據(jù)分析

用MEGA6.06軟件基于Kimura twoparameter（K2P）模型分析種內(nèi)、種間遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)鄰接樹(shù) (Neighbor-Joining tree，NJ Tree)，并利用Bootstrap法[5]（1000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分枝的支持率，對(duì)八角茴香及其同科屬植物進(jìn)行鑒定分析。用Schultz等人的研究方法（http//its2. bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/cgibin/index.pl）預(yù)測(cè)各物種ITS2的二級(jí)結(jié)構(gòu)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角茴香及其混偽品種內(nèi)及種間差異分析

利用MEGA6.06軟件計(jì)算八角茴香及其混偽品種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離，可以得到基于K2P模型的遺傳距離（詳見(jiàn)表1），計(jì)算結(jié)果顯示八角茴香與其他混偽品的種間最小遺傳距離均明顯大于八角茴香的種內(nèi)最大遺傳距離，表明K2P遺傳距離可以鑒別八角茴香及其混偽品。

表 1：八角茴香種內(nèi)及其與混偽品種間K2P距離

2.2 八角茴香與其混偽品ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由圖1可知，八角茴香及其混偽品的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)臂夾角幾乎類同，但是臂的長(zhǎng)度、莖環(huán)大小、莖環(huán)數(shù)目以及環(huán)與環(huán)之間的距離均有差異。

2.3 NJ樹(shù)聚類分析

基于ITS2序列構(gòu)建的八角茴香及其混偽品的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）中可以看出，八角茴香獨(dú)立聚為一枝，與其它易混品可明顯區(qū)分（支持率均大于50%）。

3 討論

圖1：八角茴香及其混偽品藥用植物ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

圖2：基于ITS2序列構(gòu)建的八角茴香與其混偽品的NJ樹(shù)

DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定以及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用研究已成為現(xiàn)代生物學(xué)最活躍的研究領(lǐng)域和新的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，也是未來(lái)物種鑒定的發(fā)展趨勢(shì)[7]。陳士林課題組在國(guó)內(nèi)率先提出將DNA條形碼技術(shù)用于中藥材的鑒定，并建立了藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關(guān)鍵技術(shù)分析[8]。基于ITS2的DNA條形碼技術(shù)為中藥材的快速準(zhǔn)確鑒定提供了誘人的前景，受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注[9]。

八角茴香中藥材在臨床與養(yǎng)生應(yīng)用十分廣泛，但市場(chǎng)上八角茴香的混偽品多而混雜。本研究基于ITS2條形碼序列研究八角茴香及其混偽品的種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以及分析ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，能夠準(zhǔn)確區(qū)分八角茴香及其混偽品。因此，作為DNA條形碼的ITS2序列為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地鑒定八角茴香及其混偽品提供了新的分子鑒定方法，為控制藥材質(zhì)量穩(wěn)定和指導(dǎo)臨床合理用藥及中藥材的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:4-5.

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[8]陳士林,宋經(jīng)元,姚輝,等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關(guān)鍵技術(shù)分析[J].中國(guó)天然藥物,2009,7(05):322-327.

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劉鏞（1982-），男，廣東省茂名市人。碩士學(xué)位?，F(xiàn)為廣東醫(yī)科大學(xué)講師。研究方向?yàn)橹兴幏肿予b定和分子藥理學(xué)。

林好（1992-），男，廣東省梅州市人。現(xiàn)為廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生在讀學(xué)生。研究方向?yàn)橹兴幏肿予b定。

李斯璐（1983-），女，廣東省韶關(guān)市人。碩士研究生學(xué)歷?，F(xiàn)為廣東醫(yī)科大學(xué)講師。研究方向?yàn)榛A(chǔ)醫(yī)學(xué)。