大花黃牡丹種子萌發(fā)相關(guān)特性及生根技術(shù)的初步研究

仇云云，張蕾，倪圣武，袁濤

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083；2.國家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083；3.花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，北京 100083；4.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 100083；5.大連億達(dá)房地產(chǎn)公司，遼寧 大連 116026；6.杭州市園林文物局，浙江 杭州 310000)

?

大花黃牡丹種子萌發(fā)相關(guān)特性及生根技術(shù)的初步研究

仇云云1,2,3,4，張蕾5，倪圣武6，袁濤1，2，3，4

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083；2.國家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083；3.花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，北京 100083；4.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 100083；5.大連億達(dá)房地產(chǎn)公司，遼寧 大連 116026；6.杭州市園林文物局，浙江 杭州 310000)

【目的】 研究大花黃牡丹種子萌發(fā)相關(guān)特性，找到較好的生根技術(shù).【方法】 以大花黃牡丹種子為試驗材料，檢測種子安全含水量、種皮透水透氣性及種子中萌發(fā)抑制物存在部位，并用不同的激素處理種子以促進(jìn)生根.【結(jié)果】 大花黃牡丹種子的安全含水量為 12.98%；種皮具有一定的透水透氣性障礙；種皮粗提液對白菜籽萌發(fā)的抑制作用較強(qiáng)；胚乳粗提液對白菜籽的萌發(fā)幾乎無影響；種子生根前的胚粗提液對白菜籽萌發(fā)影響較大，種子生根及萌發(fā)后胚粗提液對白菜籽萌發(fā)的影響較??；500 mg/L赤霉素浸種24 h,可以有效促進(jìn)大花黃牡丹種子生根.【結(jié)論】 抑制大花黃牡丹種子萌發(fā)的主要原因是種皮和胚中存在大量抑制物質(zhì)；赤霉素能解除其部分休眠，促進(jìn)種子生根.

大花黃牡丹種子；抑制物質(zhì)；生根

大花黃牡丹為芍藥科芍藥屬牡丹組植物，為我國特有.僅分布于西藏雅魯藏布江藏布峽谷長約100 km的開闊河谷地帶[1-2]，由于自身生物學(xué)特性和人為破壞等原因，其野外存活數(shù)極少，分布范圍日益縮小[3],目前處于極危狀態(tài)[4]，已被列入西藏自治區(qū)重點野生植物名錄[5].

自然條件下大花黃牡丹僅靠種子繁殖[6]，且發(fā)芽率極低，耗時長，2～3 a才能發(fā)芽成苗.因此，研究大花黃牡丹種子特性，提高種子發(fā)芽率，對保護(hù)大花黃牡丹具有十分重要的意義，前人對大花黃牡丹的研究多集中于其野生種群特性及生境上[7-13]，對大花黃牡丹種子特性的研究也有相關(guān)報道.趙世虎等[14]的研究顯示，沙藏、乙醇、赤霉素3種方法處理均可增加大花黃牡丹種子的出苗率，大花黃牡丹種子經(jīng)赤霉素處理后當(dāng)年播種,不僅能提高種子成苗率,還能顯著促進(jìn)出苗的整齊度,縮短苗期.倪勝武[15]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，赤霉素與低溫混合處理大黃花牡丹種子，對于提高種子發(fā)芽率、種苗整齊性的效果要顯著優(yōu)于其他的處理方法.馬宏等[16]認(rèn)為大花黃牡丹種子理想的萌發(fā)條件為：播種前常溫清水浸泡7 d，于15 ℃恒溫培養(yǎng)；待根生長至3 cm以上時，以300 mg/L GA3浸泡2 h，置于15 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)芽歷期約120 d，發(fā)芽率達(dá)95%以上.郝海平等[17]對大花黃牡丹種子根長與上胚軸休眠破除關(guān)系的研究顯示，只有當(dāng)根長≥6 cm后，大花黃牡丹種子的上胚軸休眠才可以被低溫層積所打破.前人分析了激素、溫度及根長對大花黃牡丹種子破眠的影響，并沒有分析大花黃牡丹種子萌發(fā)抑制物質(zhì)存在的位置.

基于前人的研究，為了找到大花黃牡丹種子休眠的原因并找到相應(yīng)的破眠方法，本試驗在初步研究大花黃牡丹種子特性的基礎(chǔ)上，分析了種子中萌發(fā)抑制物質(zhì)的存在部位，嘗試了高效促進(jìn)大花黃牡丹種子生根的方法，為大花黃牡丹的保護(hù)利用提供了一定的理論依據(jù)和實踐指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

9月于西藏林芝地區(qū)采集蟹黃色的蓇葖果，室內(nèi)陰干，待果莢自然開裂后收集種子，裝入網(wǎng)袋中，于溫度23.3 ℃，濕度20%的實驗室內(nèi)儲存一個月備用.

1.2 試驗方法

1.2.1 種子安全含水量測定 讓種子在室內(nèi)裸露自然失水，每隔24 h隨機(jī)抽取10粒種子，采用TTC染色法測定種子生活力；同時隨機(jī)取出相同粒數(shù)的種子，采用二次烘干法測定種子含水量，種子含水量的計算公式為：

式中，S1為第一次測定的含水量百分率；S2為第二次測定的含水量百分率.

1.2.2 種皮透水透氣性研究 種皮透水試驗：做完整種子、剝皮種子、用蠟封種孔種子3種處理，每處理20粒.將種子浸于水中，室溫20 ℃條件下，利用間隔滲透法，每日用吸水紙吸干種子表面水分后稱質(zhì)量，直至恒質(zhì)量，每處理3次重復(fù)，取平均值.

種皮透氣性試驗：用Li-6400光合儀分別測定完整、剝皮種子的呼吸強(qiáng)度.

1.2.3 種子萌發(fā)抑制物測定 種皮水浸液生物鑒定：取20粒白菜籽放入90 cm的培養(yǎng)皿中，分別加入浸泡種皮0、24、48、72 h的蒸餾水，使水沒過種子，將培養(yǎng)皿放入20 ℃的氣候箱中，進(jìn)行白菜種子萌發(fā)試驗，48 h后統(tǒng)計白菜種子發(fā)芽率.重復(fù)3次，取平均.

種子各部位萌發(fā)抑制物質(zhì)生物鑒定：種子生根前、生根后、萌發(fā)出苗后隨機(jī)取種40粒，分離外種皮、內(nèi)種皮、胚乳和胚(或幼苗)，然后將各部分分別用80%甲醇研碎、浸提、過濾后，用80%甲醇浸提殘渣，重復(fù)3次，合并濾液，減壓濃縮蒸干后用蒸餾水洗下，定容至5 mL，將已定容的浸提液用于白菜種子萌發(fā)試驗[18]，具體操作類似上步.重復(fù)3次，取平均.

1.2.4 種子生根試驗 采用赤霉素處理及3種激素混合處理兩種方法研究種子生根條件.具體如下：

赤霉素處理：溫水浸種24 h，分別用300、500和800 mg/L的赤霉素處理48 h，然后用沙子(經(jīng)高錳酸鉀消毒)層積，放置于10～15 ℃的恒溫箱中，注意保持沙子濕潤，定期觀察.以胚根伸長≥3 mm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn).每處理25粒種子，3次重復(fù)，取平均.

混合激素處理：溫水浸種24 h，用6-BA、赤霉素、乙烯利3種激素混合處理48 h，具體操作按三因素三水平正交試驗進(jìn)行.然后與上述赤霉素處理后的種子一同放置于10～15 ℃恒溫箱中沙藏層積(經(jīng)高錳酸鉀消毒)，注意保持沙子濕度，定期觀察.以胚根伸長≥3 mm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn).3次重復(fù)，取平均.三因素三水平正交試驗具體操作見表1-2.

表1 因素及水平Tab.1 Factors and levels (mg·L-1)

2 結(jié)果與分析

2.1 種子安全含水量

室溫條件下儲存38 d的大花黃牡丹種子含水量降至11.02%，此時出現(xiàn)喪失活力者，隨后喪失活力的種子數(shù)量迅速增加，至自然風(fēng)干第43天時，種子含水量降至6.38%，活力完全喪失(表4)，可見大花黃牡丹種子含水量較高，但種子活力喪失較快.龔洵等[19]得出黃牡丹在含水量為29.5%時，胚的生命力開始下降，降至14.1%時，所有種子喪失活力，因此，可初步認(rèn)為大花黃牡丹種子的耐旱能力要強(qiáng)于黃牡丹.

表3 大花黃牡丹種子安全含水量的測定結(jié)果Tab.3 The safe moisture content of Paeonia ludlowii seeds

2.2 種皮性質(zhì)

大花黃牡丹種皮透水性見圖1.吸水24 h之后，剝皮種子的吸水率明顯高于完整種子和蠟封種子，所以種皮的存在明顯影響了種子的吸水進(jìn)程；但48 h后剝皮種子的吸水率幾乎不變，而完整種子和蠟封種子的吸水率卻仍在大幅度增加并超過剝皮種子的吸水率，可見外種皮并不一直是大花黃牡丹種子吸水的主要障礙，反而可以保持水分，更有利于種子的保存.剝皮種子后期吸水率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于完整種子及蠟封種子的原因可能是種子長時間在水中浸泡導(dǎo)致了其中內(nèi)含物的外滲[20].

大花黃牡丹種皮透氣性試驗結(jié)果顯示，剝?nèi)シN皮的種子呼吸強(qiáng)度雖強(qiáng)于完整種子的呼吸強(qiáng)度，但二者的呼吸強(qiáng)度都隨著沙藏時間的增加而提高(圖2)，因此外種皮物理特性上的透氣障礙并不是導(dǎo)致休眠的主導(dǎo)因素.

圖1 種皮對大花黃牡丹種子透水影響Fig.1 Effects of seed coat on water permeation of Paeonia ludlowii seed

圖2 種皮對大花黃牡丹種子透氣影響Fig.2 Effects of seed coat on air permeation of Paeoina ludlowii seed

2.3 種子內(nèi)萌發(fā)抑制物的測定

白菜種子在不同水浸液中72 h后萌發(fā)狀況見表4.

用剝離的內(nèi)種皮、外種皮水浸液對白菜種子做萌發(fā)試驗，抑制作用十分明顯，但大花黃牡丹種子的24、48、72 h水浸液對白菜種子的生長幾乎沒有影響，白菜種子全部萌發(fā)，區(qū)別在于生長相對緩慢一些，且整齊度不如對照，子葉大小不一，邊緣偶有發(fā)黃現(xiàn)象，根部略微發(fā)黃，但根部的生長情況基本相同.

表4 不同水浸液中白菜種子生長情況Tab.4 The growth of Chinese cabbage seeds in different aqueous extracts

由此可知，抑制物質(zhì)在大花黃牡丹種皮中大量存在，且該抑制物質(zhì)可溶于水.然而，完整種子浸水卻近乎不能溶解種皮內(nèi)的抑制物質(zhì)，因此可推測，大花黃牡丹種皮中的抑制物質(zhì)雖可以溶于水，但水浸卻無法使之完全溢出.這可能與外種皮上覆蓋的蠟質(zhì)有關(guān).單純或短期水浸種不能完全去除休眠抑制物質(zhì)，從而高效促進(jìn)大花黃牡丹種子的萌發(fā).

種子生根前、生根后、萌發(fā)出苗后種子內(nèi)各部分粗提液對白菜種子萌發(fā)率的試驗結(jié)果見表5.

結(jié)果表明，1)內(nèi)外種皮粗提液對白菜種子萌發(fā)的抑制作用較強(qiáng)，特別是外種皮粗提液，在大花黃牡丹種子生根前后的抑制作用均非常明顯，說明外種皮自始至終都存在抑制大花黃牡丹種子萌發(fā)的物質(zhì)；種子生根后的內(nèi)種皮粗提液對白菜籽萌發(fā)的抑制作用有所下降，但仍較強(qiáng)，說明種子生根可能與內(nèi)種皮中萌發(fā)抑制物質(zhì)的下降有關(guān)系，可以試圖通過去除內(nèi)種皮中的萌發(fā)抑制物質(zhì)來促進(jìn)種子生根，因此，生產(chǎn)中建議播種前適度劃破大花黃牡丹種子后對其進(jìn)行水浸以促進(jìn)種子生根.2)與對照組相比，大花黃牡丹種子的胚乳粗提液對白菜籽的萌發(fā)幾乎無影響，說明胚乳中可能不含有抑制種子萌發(fā)的物質(zhì).3)不同時期的胚粗提液對白菜籽萌發(fā)試驗的結(jié)果顯示，種子生根前的胚粗提液對白菜籽萌發(fā)影響較大，雖然白菜籽全部萌發(fā)，但24 h后其胚根長僅為0.61 cm，而對照組為1.37 cm，種子生根及萌發(fā)后，大花黃牡丹的胚粗提液對白菜籽萌發(fā)的影響較小，24 h后白菜籽根長可達(dá)1.28 cm，與對照組相差不大，說明胚內(nèi)的抑制物質(zhì)在胚根伸長之后消失，而此時大花黃牡丹種子已生根.因此，如何消除胚內(nèi)的萌發(fā)抑制物質(zhì)可能會是解除上胚軸休眠的關(guān)鍵所在.

以種子生根前各部分種子浸提液對白菜種子萌發(fā)的影響為例，處理后的白菜種子生長狀況見圖3-8.

表5 種子萌發(fā)不同時期種子各部位浸提液對白菜種子萌發(fā)的影響

Tab.5 Effects of leach liquor from different parts of seeds in different germination time on Chinese cabbage seed germination

粗提液不同時期白菜種子萌發(fā)率/%24h后白菜種子胚根/cm種子生根前0<0.3外種皮粗提液種子生根后0<0.3種子發(fā)芽后0<0.3種子生根前0<0.3內(nèi)種皮粗提液種子生根后320.31種子發(fā)芽后280.33種子生根前1001.38胚乳粗提液種子生根后1001.32種子發(fā)芽后1001.34種子生根前1000.61胚粗提液種子生根后1001.28種子發(fā)芽后1001.27種子生根前1001.37蒸餾水對照(CK)種子生根后1001.33種子發(fā)芽后1001.35

圖3 蒸餾水處理的白菜籽Fig.3 Disposal of Chinese cabbage by water

圖4 胚的甲醇粗提液處理的白菜籽Fig.4 Disposal of Chinese cabbage by embryo methanol extracting fluid

圖5 內(nèi)種皮的甲醇粗提液處理的白菜籽Fig.5 Disposal of Chinese cabbage by inner coat methanol extracting fluid

圖6 外種皮的甲醇粗提液處理的白菜籽Fig.6 Disposal of Chinese cabbage by outer coat methanol extracting fluid

圖7 胚乳的甲醇粗提液處理的白菜籽Fig.7 Disposal of Chinese cabbage by endosperm methanol extracting fluid

2.4 種子生根試驗

不同處理對大花黃牡丹種子生根影響的試驗結(jié)果見表6-7.

由表6可知，大花黃牡丹種子經(jīng)500 mg/L赤霉素處理48 h，在10～15 ℃全黑暗條件下兩個月的生根率達(dá)57%，平均根長達(dá)到22 mm，而對照生根率僅為15%，根長極短，因此，500 mg/L赤霉素處理大花黃牡丹種子48 h能顯著提高種子生根率.而500 mg/L赤霉素+100 mg/L乙烯利、500 mg/L赤霉素+100 mg/L 6-BA、500 mg/L赤霉素+200 mg/L 6-BA+50 mg/L乙烯利混合處理48 h后種子的生根率都較小，可見赤霉素、6-BA、乙烯利3種激素混合處理無效果，混合處理反而影響了赤霉素的作用，降低了種子的生根率.

圖8 由左至右為大花黃牡丹種子內(nèi)種皮、外種皮、胚乳、胚的粗提液以及蒸餾水處理的白菜籽Fig.8 Disposal of brassica chinensis by inner coat,outer coat,endosperm,embryo ethanol extracting fluid

表6 赤霉素處理種子萌發(fā)情況(60 d)Tab.6 The germination of seeds treated with GA(60 d)

表7 3種激素混合處理種子萌發(fā)情況(60 d)

Tab.7 The germination of seeds treated with three hormone(60 d)

序號6卡基嘌呤/(mg·L-1)赤霉素/(mg·L-1)乙烯利/(mg·L-1)萌發(fā)率/%1010001120300508305001005410010050051003001000610050009720010010008200300009200500507

3 結(jié)論

1) 大花黃牡丹種子自然條件下貯藏活力喪失較快.因此，本研究建議對大花黃牡丹種子采收后盡量在一個月內(nèi)完成播種，若不及時播種，可暫時沙藏層積，以免種子失活.

2) 大花黃牡丹種子的種皮內(nèi)有大量萌發(fā)抑制物質(zhì)，但種皮表面覆蓋一層蠟質(zhì)，單純水浸種無法完全去除抑制物質(zhì).因此，建議先刻傷種皮再進(jìn)行水浸種，或用草木灰等堿類溶液浸泡種子以去除種皮表層蠟質(zhì)及油脂，提高種皮通透性，同時，促進(jìn)抑制物質(zhì)的浸出，但此方法有待進(jìn)一步試驗驗證.

3) 牡丹種子具有典型的雙胚軸休眠特性，即分為下胚軸和上胚軸兩個需溫不同的休眠階段，尤其以上胚軸休眠更為深沉，自然生根發(fā)芽時間漫長、生根發(fā)芽率低且不整齊，赤霉素處理和低溫有利于打破牡丹種子的休眠促使其萌發(fā)，本試驗僅對赤霉素對大花黃牡丹種子生根的影響進(jìn)行了研究，而對于赤霉素對大花黃牡丹種子上胚軸生長的影響有待進(jìn)一步研究.胚培養(yǎng)也是打破牡丹種子休眠，促使牡丹幼胚快速成苗的可行方法之一，對紫斑牡丹幼胚離體培養(yǎng)的研究表明，胚齡為盛花后75 d的種胚的離體培養(yǎng)，萌發(fā)率可達(dá)58.3 %,經(jīng)4 ℃低溫預(yù)處理后萌發(fā)率可達(dá)68.3 %[21]，而對于大花黃牡丹種子萌發(fā)的研究中，并未見其種胚離體培養(yǎng)的相關(guān)報道.因此，大花黃牡丹種胚的離體培養(yǎng)是今后研究其種子萌發(fā)的方向之一.

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].27卷.北京:科學(xué)出版社,1979：491-492

[2] 劉淑敏，王蓮英，吳滌新，等.牡丹[M].北京:中國建筑工業(yè)出版社,1987：5-6

[3] 傅立國.中國植物紅皮書--稀有和瀕危植物[M].北京:科學(xué)出版社,1991:532-533

[4] 汪松，解炎.中國物種紅色名錄[M].北京:高等教育出版社,2004

[5] 安措.《西藏自治區(qū)野生植物保護(hù)辦法》10月1日起施行[N].西藏商報，2009-08-13

[6] 成仿云，李嘉玨，陳德忠.中國野生牡丹自然繁殖特性研究[J].園藝學(xué)報，1997，24(2):180-184

[7] 楊小林，王秋菊，蘭小中，等.瀕危植物大花黃牡丹(Paeonialudlowii)種群數(shù)量動態(tài)[J].生態(tài)學(xué)報，2007(3):1242-1247

[8] 蘇建榮，劉萬德，郎學(xué)東，等.瀕危植物大花黃牡丹與生境地群落特征的關(guān)系[J].林業(yè)科學(xué)研究，2010，23(4):487-492

[9] 楊小林，羅健，鮑隆友.瀕危植物大花黃牡丹種群結(jié)構(gòu)與分布格局[J].西南林學(xué)院學(xué)報，2006，26(6):6-9

[10] 楊翔，盧杰.大花黃牡丹群落主要種群的生態(tài)位研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(1):314-318

[11] 楊翔.大花黃牡丹種群生態(tài)學(xué)研究[D].拉薩：西藏大學(xué),2010

[12] 邢震，張啟翔，次仁.西藏大花黃牡丹生境概況初步調(diào)查[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(4):250-253

[13] 周生軍，鮑隆友.瀕危植物大花黃牡丹的野生資源現(xiàn)狀與栽培研究[J].中國林副特產(chǎn)，2009(2):93-94

[14] 趙仕虎，秦臨喜，王琳，等.西藏大花黃牡丹繁殖方法初步研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2007(11):43-44

[15] 倪圣武.紫牡丹、黃牡丹、大花黃牡丹引種與遷地保護(hù)研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué),2009

[16] 馬宏，李正紅，張艷麗，等.大花黃牡丹種子休眠的解除[J].林業(yè)科學(xué)，2012，48(9):62-67

[17] Hao H,He Z,Li H,et al.Effect of root length on epicotyl dormancy release in seeds of Paeonia ludlowii,Tibetan peony[J].Annals of Botany，2014,113(3):443-452

[18] 王艷華.大山櫻種子休眠機(jī)理及催芽技術(shù)的研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué),2005

[19] 龔洵，武全安.瀕危植物黃牡丹受威脅因素初探[J].植物引種馴化集刊，1993(8):141-146

[20] 傅家瑞.種子生理學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,1985

[21] 安阿莉，蘇小玲，毛娟，等.紫斑牡丹幼胚離體培養(yǎng)試驗[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，44(6):63-68

(責(zé)任編輯 趙曉倩)

Preliminary study on characteristics related to germination and rooting technology ofPaeonialudlowiiseeds

QIU Yun-yun1,2,3,4,ZHANG Lei5,NI Sheng-wu6,YUAN Tao1,2,3,4

(1.School of Landscape,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.National Engineering Research Center for Floriculture,Beijing 100083,China;3.Key Laboratory of Flower Germplasm Innovation and Breeding in Beijing City,Beijing 100083,China;4.Beijing Urban and Rural Ecological Environment Laboratory,Beijing 100083,China;5.Dalian Yida Real Estate Company,Dalian 116026,China;6.Hangzhou Municipal Gardens Bureau of Cultural Relics,Hangzhou 310000,China)

【Objective】 To study the germination characteristics and find a good rooting method ofP.ludlowiiseeds. 【Mehtod】 The seeds were used as experiment material,the safe moisture content of seeds,water permeability,breathability of seed coats and the location of germination inhibitors were detected. Moreover,different hormones were tried to promote rooting. 【Result】 The safe moisture content of seeds was 12.98%. Certain permeability barriers existed in seed coats.Seed coat extracts had strongly impact on Chinese cabbage seed germination;Endosperm extracts had little impact on Chinese cabbage seed germination;Embryo extracts taken before seed germination impacted more greatly on Chinese cabbage seed germination which would less impacted by embryo extracts taken after seed germination. Soaking seeds at 500 mg/L GA3for 2 days was found effective to release the inhibitors and promote seed germination.【Conclusion】 The main reason for seed germination inhibition ofP.ludlowiiwas lots of inhibitory substances existing in the seed coat and embryo. GA3could release seed dormancy and promote seed rooting.

Paeonialudlowiiseeds;inhibition substances;rooting

仇云云(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為園林植物栽培養(yǎng)護(hù).E-mail:qiuyunyunsg@163.com

袁濤，女，副教授，研究方向為園林植物栽培養(yǎng)護(hù).E-mail:yuantao1969@163.com

西藏自治區(qū)科研院所社會公益研究專項“藏東南特有林木資源的評價與共享技術(shù)研究”(2004DIB3J097).

2015-11-06；

2015-12-04

S 722.1

A

1003-4315(2016)06-0058-06