沙冬青總黃酮體外抗BPIV-3的試驗(yàn)研究

張嘉男，陶波，黃志浩，方梅，賈寧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

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沙冬青總黃酮體外抗BPIV-3的試驗(yàn)研究

張嘉男，陶波，黃志浩，方梅，賈寧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

【目的】 研究沙冬青總黃酮體外抗牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV-3)的作用，并對(duì)其抗病毒作用機(jī)制進(jìn)行探討.【方法】 以細(xì)胞存活率和抑制率為指標(biāo)，采用MTT比色法檢測(cè)沙冬青總黃酮抗BPIV-3活性.分別以感染病毒同時(shí)給藥、給藥后接種病毒、先感染病毒后給藥3種方式觀察沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3病毒的抑制效果.【結(jié)果】 沙冬青總黃酮的安全濃度為0.187 mg/mL，病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)為10-7.733/0.1 mL.在安全濃度范圍內(nèi)，沙冬青總黃酮具有良好的抗BPIV-3作用，且這種作用呈一定的量效關(guān)系.當(dāng)濃度為0.187 mg/mL時(shí)，BPIV-3抑制率達(dá)89.43%，細(xì)胞存活率高達(dá)96.66%;當(dāng)濃度為0.187 mg/mL時(shí)，阻斷抑制率達(dá)68.36%，而細(xì)胞存活率達(dá)到86.98%；當(dāng)濃度為0.187 mg/mL時(shí)，對(duì)BPIV-3復(fù)制抑制效果最明顯，達(dá)到50.55%，而細(xì)胞存活率達(dá)到78.81%.同時(shí)，在安全濃度范圍內(nèi)，沙冬青總黃酮直接殺滅BPIV-3病毒的效力較阻斷作用和抑制作用更強(qiáng).【結(jié)論】 沙冬青總黃酮具有良好體外抗牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV-3)的作用.

沙冬青總黃酮；抗病毒作用；BPIV-3；體外試驗(yàn)

牛副流感是由BPIV-3 (牛副流感病毒Ⅲ型)引起牛的一種以發(fā)熱、氣喘、流涎為特征的急性熱性傳染病，尤其多見于奶牛[1-2].本病流行范圍很廣，幾乎全球所有奶牛養(yǎng)殖國均有該病爆發(fā)，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的威脅[1-4].到目前為止，本病尚無有效的化學(xué)治療藥物[2-3].已有研究表明，黃酮類化合物具有抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[5-9].沙冬青(AmmopiptanthusmongolicusCheng f.)為豆科旱生植物，主要分布于我國的西北地區(qū)以及蒙古、俄羅斯等國家.周建勝等[10]研究報(bào)道了沙冬青總黃酮具有抗BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)作用，且量效關(guān)系良好.本研究擬進(jìn)行沙冬青總黃酮體外抗BPIV-3研究，以期為深入探索沙冬青總黃酮的抗病毒作用提供依據(jù)，另一方面也為利用沙冬青總黃酮抑制BPIV-3奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 沙冬青總黃酮的提取與制備

從甘肅省民勤縣種子公司購入沙冬青種子，經(jīng)洗凈、曬干、粉碎備用.稱取沙冬青種子干燥粉末，加75%乙醇，浸漬過夜.然后，在85～90 ℃水浴中回流循環(huán)提取，每次浸提2 h，提取3次，冷卻，過濾，合并3次提取液.濾液經(jīng)55 ℃減壓濃縮成稠膏，加入50 ℃水?dāng)嚢枞芙夂?，采用石油醚萃取兩次進(jìn)行脫脂，萃取上液石油醚回收利用，下液面進(jìn)一步用乙酸乙酯萃取(每次萃取按1∶1加乙酸乙酯)，經(jīng)多次萃取直到萃取液為無黃色物質(zhì)為止.對(duì)乙酸乙酯萃取液用5%Na2CO3水溶液萃取，堿水溶液用濃鹽酸調(diào)整pH 5～6后，再采用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮乙酸乙酯，60 ℃恒溫干燥至恒量，即獲得棕黃色的總黃酮類化合物.定量稱取沙冬青種子總黃酮，加入二甲基亞砜(DMSO)溶解，原液濃度為12 mg/mL的沙冬青總黃酮濃度，用細(xì)胞維持液稀釋成所需濃度，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 試驗(yàn)用細(xì)胞和BPIV-3

尕里巴牛腎原代細(xì)胞(MDBK)和BPIV-3(牛副流感病毒Ⅲ型)(批號(hào)217320，貨號(hào)VR-739)由甘肅蘭州民海生物公司提供.將液氮中凍存的MDBK細(xì)胞取出，放入40 ℃恒溫水浴中迅速融化(1 min內(nèi)).用750 mL/L乙醇擦拭凍存管，在無菌條件下，將細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中，加10 mL MEM生長液，37 ℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).傳代時(shí)，移去舊培養(yǎng)液，加入3 mL PBS浸洗細(xì)胞2次，棄去緩沖液.加入2.5 g/L胰蛋白酶消化液輕搖培養(yǎng)瓶，放入37 ℃培養(yǎng)箱中消化3 min.棄消化液，加入10 mL MEM生長液，懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，添加5～10 mL MEM生長液.置于37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至傳代.所有試驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞.

1.3 病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)的測(cè)定

取MDBK細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層，接種連續(xù)稀釋10倍的10-1-10-10濃度的病毒液，每孔接種病毒稀釋液100 μL，每個(gè)稀釋度接種8孔，另設(shè)細(xì)胞正常對(duì)照，37 ℃吸附2 h，棄病毒液，用PBS液洗3次，每孔加維持液200 μL，將培養(yǎng)板置37 ℃ 50 mL/L CO2溫箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，記錄病變程度和孔數(shù)，待細(xì)胞病變不再繼續(xù)判定結(jié)果.按Reed-Muench公式計(jì)算TCID50.

1.4 沙冬青總黃酮對(duì)MDBK細(xì)胞的毒性試驗(yàn)

將沙冬青總黃酮母液(12 mg/mL)分別用細(xì)胞維持液按二倍遞次稀釋，組成濃度梯度.取對(duì)數(shù)生長期的MDBK細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(200 μL/孔)，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長成單層細(xì)胞后，將不同濃度的含藥維持液0.1 mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)濃度重復(fù)8孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組.培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察CPE(細(xì)胞病變)程度，棄培養(yǎng)液上清，每孔加入0.5 mg/mL MTT 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，棄MTT上清，每孔加二甲基亞砜(DMSO) 100 μL，振蕩5～10 min，待結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè) 570 nm處的光密度(OD值)，根據(jù)下面公式計(jì)算不同藥物濃度時(shí)細(xì)胞存活率.

細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)孔D值/對(duì)照孔D值)×100%

1.5 沙冬青總黃酮體外抗BPIV-3試驗(yàn)

在安全濃度基礎(chǔ)上將沙冬青總黃酮倍比稀釋成8個(gè)稀釋度，取用100TCID50的BPIV-3病毒液0.1 mL感染MDBK細(xì)胞，設(shè)不同的實(shí)驗(yàn)組，包括細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組和沙冬青總黃酮組(8個(gè)濃度組).采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每一濃度8孔.試驗(yàn)采用3種給藥方式：藥物對(duì)BPIV-3的直接作用：將病毒和藥物同時(shí)加入MDBK細(xì)胞中；藥物對(duì)BPIV-3的阻斷作用：先將藥物加入MDBK細(xì)胞中37 ℃培養(yǎng)6 h后，再接種病毒；藥物對(duì)BPIV-3復(fù)制的抑制作用：先將病毒感染MDBK細(xì)胞37 ℃培養(yǎng)2.5 h后，再加入不同濃度的藥物.上述各組細(xì)胞置于37 ℃、50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察CPE情況，當(dāng)病毒對(duì)照組CPE達(dá)到達(dá)到75%以上時(shí)，細(xì)胞對(duì)照組正常時(shí)，記錄CPE情況.然后采用MTT比色法，測(cè)定570 nm處的D值，并計(jì)算藥物對(duì)BVDV病毒的病毒抑制率.試驗(yàn)重復(fù)3次.

病毒抑制率(%)=

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 TCID50的測(cè)定結(jié)果

由表1按Reed-Muench氏法計(jì)算，BPIV-3在MDBK細(xì)胞中的TCID50為10-7.733/0.1 mL.既將該病毒稀釋10-7.733接種100 μL可使50%的MDBK細(xì)胞發(fā)生病變.

表1 BPIV-3半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)Tab.1 The TCID50 of BPIV-3

2.2 沙冬青總黃酮對(duì)MDBK細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，沙冬青種子總黃酮對(duì)MDBK作用在當(dāng)藥物濃度達(dá)到0.187 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到了104.27%，細(xì)胞存活率超過了100%，表明對(duì)MDBK無不良影響，CPE觀察也顯示與對(duì)照組細(xì)胞無明顯差異，表明沙冬青總黃酮低于0.187 mg/mL對(duì)MDBK無毒性作用.因此，沙冬青種子總黃酮的安全濃度為0.187 mg/mL.

2.3 沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3作用結(jié)果

2.3.1 沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3的直接殺滅作用 由表3可知，沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3的直接殺滅作用效果明顯.試驗(yàn)所設(shè)沙冬青總黃酮的8個(gè)濃度組對(duì)BPIV-3都有一定的一直殺滅作用，且隨著作用濃度的增大殺滅效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.187 mg/mL時(shí)BPIV-3抑制率達(dá)89.43%，細(xì)胞存活率高達(dá)96.66%，其D570值與細(xì)胞對(duì)照比差異不顯著(P>0.05)，在顯微鏡下，MDBK病變程度比病毒對(duì)照組明顯減輕.說明沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3具有良好的直接滅活效果.

表2 沙冬青種子總黃酮對(duì)MDBK細(xì)胞存活的影響

Tab.2 The effect of total flavonoid ofAmmopiptanthuson MDBK survival rate

重復(fù)孔數(shù)藥量/(mg·mL-1)D570nm細(xì)胞存活率/%8120.0828.74860.11612.37830.15616.6381.5000.19720.9180.7500.50553.8480.3750.77382.4180.1870.978104.2780.0930.982104.688細(xì)胞對(duì)照0.937

表3 沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3的抑制作用

Tab.3 The inhibition of total Flavonoid fromAmmopiptanthuson BPIV-3

處理藥量/(mg·mL-1)重復(fù)孔數(shù)直接作用D570nm細(xì)胞存活率/%病毒抑制率/%阻斷作用D570nm細(xì)胞存活率/%病毒抑制率/%抑制作用D570nm細(xì)胞存活率/%病毒抑制率/%10.18780.52396.6689.440.44186.9868.360.38078.8150.5520.09480.49190.4269.870.409*80.5152.580.352*72.6236.1130.05080.44782.6245.170.372*73.3735.270.332*68.6926.9340.02580.438*80.6738.960.370**72,9034.100.324*67.1123.2550.01280.430*79.2534.410.360**71.0229.480.307**63.4814.7960.00680.422**77.6929.460.349**68.8724.270.294**60.938.7670.00380.421**77,4528.690.346**68.2222.710.290**60.026.7080.00280.413**76.0224.200.333**65.4816.050.286**59.194.77病毒對(duì)照80.3710.2990.276細(xì)胞對(duì)照80.5440.5070.483

與細(xì)胞對(duì)照組比較，未標(biāo)記表示差異不顯著(P>0.05)， *表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01).

2.3.2 沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3的阻斷作用 由表3可知，沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3的阻斷作用也較明顯.沙冬青總黃酮的8個(gè)濃度對(duì)BPIV-3均具有一定的阻斷抑制作用，且隨著沙冬青總黃酮濃度的增大阻斷作用效果也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.187 mg/mL時(shí)對(duì)BPIV-3阻斷抑制率達(dá)68.36%，而細(xì)胞存活率達(dá)到86.98%，其D570值與細(xì)胞對(duì)照比差異不顯著(P>0.05)，在顯微鏡下，MDBK病變程度也比病毒對(duì)照組有較明顯的減輕.表明沙冬青總黃酮能有效阻斷BPIV-3對(duì)細(xì)胞的侵入，具有較好的預(yù)防感染作用.

2.3.3 沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3的抑制作用 由表3可知，沙冬青總黃酮8個(gè)濃度組對(duì)BPIV-3復(fù)制都有一定的抑制作用，且隨著沙冬青總黃酮濃度的增大作用復(fù)制抑制效果也不斷增強(qiáng).當(dāng)濃度為0.187 mg/mL時(shí)對(duì)BPIV-3復(fù)制抑制效果最明顯，達(dá)到50.55%，而細(xì)胞存活率達(dá)到78.81%，其D570值與細(xì)胞對(duì)照比差異不顯著(P>0.05)，在顯微鏡下，MDBK病變程度與病毒對(duì)照組比較也有減輕.表明沙冬青總黃酮也能有效抑制BPIV-3復(fù)制.

3 討論

本研究首次證明沙冬總青總黃酮具有明顯抑制BPIV-3增殖和減輕BPIV-3病毒感染引起MDBK細(xì)胞的CPE病變程度.研究結(jié)果表明，沙冬青總黃酮在安全濃度范圍內(nèi)，對(duì)BPIV-3的抑制率與的作用濃度之間呈一定的量效關(guān)系.在不同的給藥方式和不同的藥物劑量組中，沙冬青總黃酮均表現(xiàn)出程度不等的抗BPIV-3作用，對(duì)BPIV-3感染MDBK細(xì)胞具有不同程度的抑制，尤其在直接作用試驗(yàn)中，當(dāng)沙冬青總黃酮濃度為0.187 mg/mL時(shí)，對(duì)BPIV-3病毒感染MDBK細(xì)胞的抑制率高達(dá)89.44%(P<0.05)，顯示沙冬青總黃酮具備良好的抗BPIV-3病毒特性.由于沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3的抑制作用與其作用劑量有一定依賴性，因此，可適當(dāng)提高沙冬青總黃酮的作用劑量來增強(qiáng)其抗BPIV-3的活性.

從沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3病毒直接殺滅作用、阻斷作用和抑制作用來看，其直接殺滅BPIV-3病毒的效力要明顯強(qiáng)于抑制BPIV-3病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生物合成以及預(yù)防BPIV-3病毒吸附于細(xì)胞的能力.因此，沙冬青總黃酮對(duì)BPIV-3病毒的主要抑制來自對(duì)BPIV-3的直接殺滅作用，同時(shí)也具有一定預(yù)防BPIV-3病毒入侵細(xì)胞或在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行相關(guān)生物合成的作用.本研究也表明，沙冬青總黃酮在對(duì)BPIV-3直接殺滅作用中對(duì)BPIV-3病毒感染的MDBK細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，細(xì)胞存活率明顯提高，而在阻斷作用和抑制作用中，這種保護(hù)作用不如直接殺滅作用明顯，推測(cè)可能因沙冬青總黃酮對(duì)在細(xì)胞內(nèi)正在復(fù)制擴(kuò)增的BPIV-3病毒抑制作用較弱或因沙冬青總黃酮作用時(shí)間不足導(dǎo)致細(xì)胞未能完全吸收所致，具體機(jī)制尚待深入研究.

本研究利用CPE觀察和MTT比色法檢測(cè)沙冬青總黃酮對(duì)MDBK細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，在安全作用劑量范圍內(nèi)，當(dāng)沙冬青總黃酮作用劑量降低到一定范圍時(shí)，與對(duì)照組比較不僅對(duì)MDBK細(xì)胞沒有毒性，而且還具有明顯促進(jìn)MDBK細(xì)胞增殖的作用，表現(xiàn)出使培養(yǎng)MDBK細(xì)胞生長狀況更好，細(xì)胞層明顯加厚，具有明顯促進(jìn)MDBK細(xì)胞增殖的作用.因此，沙冬青總黃酮也可成為MDBK細(xì)胞保護(hù)劑.

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(責(zé)任編輯 李辛)

Effect of the total flavonoid ofAmmopiptanthusmongolicaon BPIV-3invitro

ZHANG Jia-nan,TAO Bo,HUANG Zhi-hao ,FANG Mei ,JIA Ning

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

【Objective】 To study the anti-viral effect of the total flavonoid ofAmmopiptanthusmongolicaagainst BPIV-3 virus in vitro and its antiviral mechanism.【Method】 Cell survival rate and inhibition rate were used as index to evaluate antiviral activity of the total flavonoid ofA.mongolicaby MTT.Cell survival rate and inhibition rate were measured by three administration ways of infecting virus-and-applying hypericin,inoculating virus-after-applying hypericin,infecting virus before applying hypericin,respectively.【Result】 The results showed that safe concentration of total flavonoid ofA.mongolicawas 0.187 mg/mL,BPIV-3TCID50was 10-7.733/0.1 mL,within the concentration it had good inhibition effect on the replication of BPIV-3 and showed certain dose-effect.Compared with the virus control group,at the concentration of 0.187 mg/mL,BPIV-3 inhibition rate reached 89.43%,cell viability up to 96.66%.At the concentration of 0.187 mg /mL,blocking inhibition rate reached 68.36% and cell survival rate was 86.98%.At the concentration of 0.187 mg/mL,replication inhibiting effect on BPIV-3 was most obvious reaching 50.55% and cell survival rate 78.81%.The effect of direct killing on BPIV-3 was better than blocking and inhibiting effect.【Conclusion】 The total flavonoid ofA.mongolicahas obvious effect against BPIV-3 virusinvitro.

total flavonoid ofAmmopiptanthusmongolica;antiviral effect;BPIV-3 virus;invitrotest

張嘉男(1990-)，男，碩士研究生，主要從事動(dòng)物病理學(xué)及新獸藥研發(fā).E-mail：623409818@qq.com

賈寧，男，教授，博士，主要從事動(dòng)物疾病病理與免疫病理學(xué)研究.E-mail：jianing@gansu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(31560686)項(xiàng)目.

2015-12-08；

2016-03-28

S 853.75

A

1003-4315(2016)06-0006-05