羊口瘡病毒B2L基因的原核表達、純化及反應原性分析

石正旺，劉華南，胡永浩，鄭海學

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，甘肅 蘭州 730046)

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羊口瘡病毒B2L基因的原核表達、純化及反應原性分析

石正旺1，2，劉華南2，胡永浩1，鄭海學2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，甘肅 蘭州 730046)

【目的】 克隆和表達羊口瘡病毒(ORFV)的B2L基因，進而純化并分析其反應原性.【方法】 根據(jù)GenBank已發(fā)表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列設計一對特異引物，以提取陽性臨床樣品的總DNA為模板，通過PCR方法獲得ORFV的B2L基因，將該基因片段連接至原核表達載體pET-30a(+)上，獲得重組質粒pET-30a(+)-B2L.將此重組質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行擴大培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導獲得重組融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting對表達的目的蛋白進行分析.【結果】 成功獲得重組質粒pET-30a(+)-B2L，讀碼框正確.獲得了43 ku的表達產(chǎn)物，與預期目的蛋白大小相符；純化后的目的蛋白能與ORFV陽性血清發(fā)生特異反應.【結論】 成功對ORFV-B2L蛋白進行了原核表達，且純化后蛋白具有良好的反應原性.

羊口瘡病毒；B2L基因；原核表達；純化；反應原性分析

羊口瘡病毒(orf virus，ORFV)即羊傳染性膿瘡病毒(ecthyma contagiosum virus)，是痘病毒科(Poxviridae)脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)副痘病毒屬(Parapoxvirus)成員[1].副痘病毒屬是一類引發(fā)動物上皮組織發(fā)生病變的相關病毒，可感染綿羊、山羊、駱駝、紅鹿、糜、松鼠、海豹、麝牛、羚牛和人[2-11]，本屬成員還有牛丘疹性口內炎病毒(bovine papular stomatitis virus，BPSV)和假牛痘病毒(pseudocowpox virus，PCPV)，均呈世界范圍流行，包括北美和南美，新西蘭、芬蘭、德國、挪威、日本、中國、意大利、英國、澳大利亞和南非一些國家，甚至南極洲[12-14].ORFV感染后動物的口、眼、鼻周圍皮膚出現(xiàn)水泡，然后形成痂皮或者疣狀病變[15]，此癥狀一般持續(xù)3-4周，之后動物會出現(xiàn)伏地不起，食欲不振等癥狀[16]，該病發(fā)病率高，但死亡率低，康復動物會出現(xiàn)二次感染，且極度虛弱[17].自19世紀50年代起，在我國10余省份就有相關疫情的報道，其主要流行于我國西北地區(qū).由于其具有高度傳染性，及目前高效疫苗的匱乏，該病危害嚴重，被OIE列為法定必報的動物傳染病之一，在我國被列為I類動物傳染病[14].

ORFV為雙鏈DNA病毒，基因組長138 kb，編碼132個蛋白[18]，該基因組中，中心區(qū)域主要編碼病毒結構蛋白，兩側區(qū)域主要編碼和病毒宿主嗜性及毒力相關蛋白[19].ORFV的B2L基因編碼一種囊膜蛋白，該基因在不同分離株間具有很高的同源性，因此該基因可用于病毒PCR檢測方法的靶標蛋白[17]，此基因全長1 137 bp，位于ORFV基因組5′端，編碼產(chǎn)生43 ku大小的囊膜蛋白，囊膜蛋白能刺激宿主機體產(chǎn)生很強的中和抗體，是一種重要的免疫原性蛋白[16].本試驗旨在對ORFV-B2L基因進行擴增，并構建原核表達重組載體pET-30a(+)-B2L，轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，進行原核表達，并對表達產(chǎn)物進行純化及反應原性分析，為進一步開發(fā)ORFV診斷試劑奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 ORFV陽性病料、載體及菌株

病料和陽性血清由蘭州獸醫(yī)研究所王光祥助理研究員饋贈，pET-30a(+)表達載體由病毒基因工程課題組保存，E.coliBL21(DE3) 購自寶生物(大連)生物工程公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 引物的設計與合成 參照GenBank中登錄的ORFV-B2L基因序列(GQ328006)， 應用Primer 5.0軟件設計擴增ORFV-B2L基因的引物，引物由蘇州金維智生物科技公司合成，上游引物序列：5′-CGCGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCATCCCCGTG-3′；下游引物序列：5′-CCG CTCGAG TTATTAATTTATTGGTTTGCAG AACTC-3′,上游引物和下游引物分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(下劃線處為酶切位點).

1.3.3ORFV-B2L基因擴增與純化ORFV-B2L基因的擴增體系：10×LA PCRTMBufferII 5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 8 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，補加RNase Free dH2O 至50 μL.PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s，共35個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物.

1.3.4ORFV-B2L基因原核表達載體的構建與鑒定 將PCR回收產(chǎn)物和pET-30a(+)載體均用BamHⅠ和XhoⅠ，37 ℃，酶切4 h.對雙酶切產(chǎn)物進行純化，分別取目的片段6 μL，載體1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，T4 DNA Ligase buffer 2 μL，16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行培養(yǎng)，提取質粒，進行雙酶切鑒定，將鑒定為陽性克隆送至蘇州金維智生物科技公司測序.

1.3.5 重組表達菌的誘導表達 將陽性質粒轉化BL21感受態(tài)細胞，涂布于Kan+(100 μg/mL)抗性的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng).挑取單克隆菌落，分別于5 mL Kan+抗性的LB培養(yǎng)基中37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)，當D600值達到0.6～0.8時，保存菌液，后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，繼續(xù)搖菌5 h.吸取箘液1 mL，12 000 r/min離心收菌，加入80 μL 8 mol/L的尿素，渦旋混勻后室溫靜置20 min,加入20 μL 5×loading buffer,煮沸8 min后上樣8 μL，進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，脫色.

2) 從左上角的第一個像素點開始，與設置的5級燒傷顏色閾值進行比較，得出該點的燒傷級別，若無燒傷則標記為0，再統(tǒng)計出已發(fā)生燒傷的各像素點的個數(shù)。

1.3.6 重組蛋白的可溶性分析 將陽性種子液，擴大200 mL體系培養(yǎng)，并在上述條件下誘導，12 000 r/min離心收取菌粒后，用裂解液懸浮，反復凍融3次，冰浴條件下超聲破碎20 min(超聲6 s，停8 s)，離心15 min(10 000 r/min ，4 ℃)，收取上清，將沉淀用與上清等量體積的PBS渦旋混勻，分別取上清與沉淀溶液80 μL，加入20 μL 5×loading buffer,煮沸8 min后上樣8 μL，進行SDS-PAGE電泳，之后用考馬斯亮藍染色，脫色.

1.3.7 重組蛋白純化 將1.3.6中收集到的沉淀懸浮液，4 ℃ 10 000 r/min離心15 min，棄去上清，按照Protein Refolding Kit說明書純化包涵體，后取純化產(chǎn)物80 μL，加入20 μL 5×loading buffer,煮沸8 min后上樣8 μL，進行SDS-PAGE電泳分析.

1.3.8 重組蛋白的Western-blotting分析 將純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳后，用半干轉膜電泳儀轉至硝酸纖維素膜上(15 V，25 min)，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，用TBST洗膜3次(水平搖床，10 min/次)，加入1∶500 TBS稀釋ORFV感染后羊的陽性血清，搖床4℃孵育過夜，洗膜3次，加入1∶5 000 TBS稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG，搖床室溫孵育2 h，洗膜3次，加入ECL顯色試劑，之后進行顯影.

2 結果與分析

2.1 ORFV B2L基因片段的擴增

對提取的病毒DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物約為1 137 bp，與預期相符(圖1)，說明通過PCR方法成功獲得了B2L基因.

M:DNA分子量標準；1：ORFV-B2L基因擴增產(chǎn)物.圖1 ORFV-B2L基因的PCR擴增Fig.1 PCR product for ORFV-B2L gene

2.2 重組質粒的鑒定

將構建的重組質粒pET-30a(+)-B2L經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定得到5382 bp左右的pET-30a(+)載體和1137 bp左右大小的B2L目的條帶，符合預期大小(圖2)，說明重組質粒構建成功.測序結果進一步表明重組質粒構建成功，且讀碼框正確.

M:DNA分子質量標準；1：重組質粒的BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物.圖2 重組質粒pET-30a(+)-B2L的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-30a(+)-B2L

2.3 重組表達菌的誘導表達

用12%的聚丙烯酰胺凝膠對未誘導樣品、誘導樣品分別進行檢測，結果表明誘導的樣品在43.0 ku處有一條特異蛋白條帶，與預期大小一致，未誘導樣品中則無(圖3).表明轉化重組質粒pET-30a(+)-B2L的工程菌，經(jīng)IPTG誘導后，成功地表達了重組蛋白B2L.

M:蛋白質分子質量標準；N:未誘導菌液樣品；1-4:誘導的菌液樣品.圖3 His-B2L在E.coli BL21中的誘導表達分析Fig.3 The expressed protein His-B2L in the E.coli BL21(DE3) cells

2.4 重組蛋白的可溶性分析

將誘導表達的重組菌進行超聲處理，離心后，分別收集上清和沉淀樣品，加入loading處理后，上樣SDS-PAGE進行檢測，結果表明重組蛋白B2L主要以包涵體的形式存在于宿主菌中(圖4).

M:蛋白質分子質量標準；N:未誘導菌液樣品；1-4：誘導菌液上清；5-8：誘導菌液沉淀.圖4 His-B2L可溶性分析Fig.4 Solubility analysis of His-B2L

2.5 重組蛋白的純化

將經(jīng)包涵體純化試劑盒Protein Refolding Kit 純化后的蛋白樣品進行SDS-PAGE檢測，結果表明對目的蛋白純化成功(圖5)，同時有部分雜帶，可能是純化過程中，IB buffer洗滌次數(shù)較少的原因.

M:蛋白分子質量標準；1-3：純化的包涵體.圖5 His-B2L蛋白純化Fig.5 The purified protein His-B2L

2.6 重組蛋白的Western-blot分析

將純化后的重組蛋白His-B2L經(jīng)Western-blot分析，發(fā)現(xiàn)在43.0 ku處有目的條帶，表明經(jīng)純化的目的重組蛋白BL2和ORFV感染血清具有很好的反應原性(圖6).

M:蛋白分子質量標準；1:純化的His-B2L蛋白.圖6 His-B2L蛋白Western-blot分析Fig.6 Western-blot analysis of the purified protein His-B2L

3 討論

羊傳染性膿瘡病是一種多發(fā)于羔羊的，以患病動物的口、眼、鼻周圍皮膚出現(xiàn)水泡，之后形成膿包，最后形成痂皮或者疣狀病變?yōu)樘卣鞯慕佑|性傳染病[20]，呈世界性分布，危害較為嚴重，近年來發(fā)病率逐年上升，是養(yǎng)殖業(yè)中需要重點防控的一類疾病[16].

羊口瘡病毒為雙鏈DNA病毒，基因全長134～139 kb，包含130個編碼病毒結構蛋白和非結構蛋白的基因，這些基因在基因組中的功能還沒有完全被研究清楚，編碼病毒毒力因子的基因有OVIFNR、Vil-10和GIF等[21].B2L基因主要編碼的囊膜蛋白，不同分離株間的同源性達到97%～98%[13].Gallina L等[22]在2006年首次基于ORFVB2L基因建立了一種關于ORF的real time PCR檢測方法.隨后，2006年Hosamani等[13]和2007年Chan等[23]基于ORFVB2L基因分別進行了毒株的鑒別和系統(tǒng)進化分析等工作.Abrahao J S等[24]于2012年對5株ORFV毒株基于B2L基因進行了系統(tǒng)進化分析工作，指出不同毒株間B2L基因在核苷酸和氨基酸水平發(fā)生了替換，常發(fā)生替換位點為009,041,079,111,126,185,196,245,249,256,267,294 和257，5株病毒的同源性為96.9%～99.9%.目前關于B2L蛋白的研究較少，其結構和功能還尚未得到深入的闡述.

在本試驗中，筆者嘗試優(yōu)化B2L蛋白原核表達的條件，例如調節(jié)培養(yǎng)溫度、轉速、IPTG濃度，使用不同類型的培養(yǎng)基.經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，溫度在37℃，轉速220 r/min，使用營養(yǎng)成分較高的培養(yǎng)基(2×YT)，有利于宿主菌的快速生長和外源蛋白表達量的增加，但在誘導5 h后，菌種生長進入平穩(wěn)期，此時，延長誘導時間，已不能有效增加蛋白表達量.同時，IPTG在0.4～1 mmol/L時，隨著誘導劑的增加，蛋白量呈現(xiàn)增加的趨勢，但當誘導劑超過1 mmol/L時，已不能有效地增加蛋白表達量.本試驗中，表達的B2L蛋白呈現(xiàn)包涵體形式，可能是受其序列本身和表達質粒的影響.在一些文獻中，研究者通過降低溫度、IPTG濃度、轉速等條件，來控制蛋白的可溶分泌表達，但在本試驗中，改變培養(yǎng)條件并未成功實現(xiàn)可溶誘導表達.在本試驗中獲得的包涵體B2L蛋白，具有和ORFV感染血清很好的反應原性，為進一步制備B2L相關抗體及ORFV臨床診斷試劑開發(fā)奠定了基礎.

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(責任編輯 胡文忠)

Prokaryotic expression,purification and reactogenicity of ORFVB2Lgene

SHI Zheng-wang1,2，LIU Hua-nan2,HU Yong-hao1，ZHEHai-xue2

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China； 2.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology,Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Lanzhou 730046,China)

【Objective】 To clone and express the B2L gene of ORFV,and then purify and analyze the reactogenicity.【Method】 A pair of primer was designed according to ORFVB2Lgene reported in Gen-Bank(GQ328006),taking the DNA of this virus extracted from the pathologic materials as template and the target gene was got by PCR.After purification,the product was cloned into pET-30a(+) vector to ob-tain the recombinant plasmid pET-30a(+)-B2L.After identification,the recombinant plasmid was trans-formed into BL21(DE3) competent cells and the single colony was picked to amplify and culture.After induction with IPTG,the recombinant fusion protein was expressed.The target protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting after purification.【Result】The results showed that theB2Lgene was successfully cloned into pET-30a(+),a protein was confirmed at position about 43 kDa by SDS-PAGE and could specifically react with ORFV positive serum identified by western-blot.【Conclusion】This ex-periment realize the prokaryotic expression of protein B2L,and the purified protein had good reactogenicity.

ORFV;B2Lgene;prokaryotic expression;purification;reactogenicity analysis

石正旺(1990-)，男，碩士研究生，主要從事動物傳染病的研究.E-mail:shizw2015@163.com

胡永浩，教授，主要從事預防獸醫(yī)學研究.E-mail:hyy0817@126.com.cn 鄭海學，研究員,主要從事獸醫(yī)微生物學及其分子生物學研究.E-mail:haixuezheng@163.com

國家“863”計劃項目(2011AA10A211-1);國際原子能機構項目(16025/R)；國家自然科學基金項目(31500617).

2015-12-04；

2016-01-27

S 852.6

A

1003-4315(2016)06-0001-05