EDTA依賴性血小板假性減少的實(shí)驗(yàn)分析及應(yīng)對(duì)措施

黃朝任,鄒光美

1.玉林市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西玉林537000;2.玉林市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西玉林537000

EDTA依賴性血小板假性減少的實(shí)驗(yàn)分析及應(yīng)對(duì)措施

黃朝任1,鄒光美2

1.玉林市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西玉林537000;2.玉林市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西玉林537000

目的分析使用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)出現(xiàn)假性減少的原因及復(fù)查方法。方法根據(jù)該實(shí)驗(yàn)室復(fù)檢標(biāo)準(zhǔn)，采用血小板出現(xiàn)假性減少的50例門診或住院患者作為研究對(duì)象，分析假性減少的原因及其復(fù)查方法。結(jié)果50例血小板假性減少樣本中，42例為乙二胺四乙酸依賴性，3例為大血小板，2例白細(xì)胞周圍衛(wèi)星現(xiàn)象，3例冷凝集現(xiàn)象,對(duì)這些患者進(jìn)行復(fù)查后可得到正常范圍的血小板結(jié)果。結(jié)論EDTA-PTCP患者經(jīng)鏡檢涂片發(fā)現(xiàn)聚集現(xiàn)象，可用枸櫞酸鈉抗凝、無(wú)抗凝劑即刻上機(jī)、手工計(jì)數(shù)復(fù)查血小板數(shù)值以避免誤診。

血小板計(jì)數(shù)；血小板聚集；血小板假性減少；EDTA

(Pseudo thrombocytopenia，PTCP)是一種體外多病因的現(xiàn)象，包括抗凝相關(guān)的血小板凝集、大血小板、血小板衛(wèi)星現(xiàn)象、冷凝集、微小的凝塊等。乙二胺四乙酸（EDTA）是臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用于全血細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類的一種最理想抗凝劑，同時(shí)也是引起血小板聚集而假性減少最常見(jiàn)的原因。乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少（EDTA-PTCP）導(dǎo)致血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)而出現(xiàn)血小板數(shù)量減少或明顯減少現(xiàn)象，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]其發(fā)生率為0.09%～0.21%。檢驗(yàn)出現(xiàn)假性減少結(jié)果會(huì)造成臨床患者的誤診、誤治，可能給患者造成不必要的骨髓穿刺和不恰當(dāng)?shù)闹委?，如輸注血小板，激素，甚至脾切除等[2]。此種假性PLT減少一般不需要治療，但在實(shí)際臨床工作中需要與真性血小板減少相鑒別，通過(guò)檢驗(yàn)科人為手段進(jìn)行對(duì)患者的血常規(guī)進(jìn)行特殊流程處理及糾正PLT結(jié)果，可以減少患者不必要的輔助檢查和治療，因此研究EDTA-PTCP正確的診斷方法來(lái)提高檢驗(yàn)人員血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性的能力，避免誤導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)患者的診斷和治療具有非常重要的意義。該研究報(bào)道近2年42例發(fā)現(xiàn)為EDTA-PTCP患者的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果分析及應(yīng)對(duì)措施報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有血常規(guī)標(biāo)本來(lái)自該院2014年6月—2016年6月門診及住院患者。于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的真空管中靜脈采血2 mL，充分混勻后在血細(xì)胞分析儀上按程序進(jìn)行檢測(cè),按本科室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）文件的復(fù)檢規(guī)則，對(duì)血小板低于70×109/L的標(biāo)本進(jìn)行手工涂片復(fù)檢，發(fā)現(xiàn)血小板明顯凝集現(xiàn)象均重新抽血復(fù)查。共收集50例EDTA所致的假性血小板減少病例，其中男32例，女18例，年齡1～74歲，平均36歲。ICU科3例，婦產(chǎn)科4例，兒科7例，風(fēng)濕科3例,呼吸內(nèi)科4例，消化內(nèi)科2例，神經(jīng)內(nèi)科2例，腎內(nèi)科1例，心內(nèi)科2例，血液科8例，外科7例，門診/急診7例。其中42例EDTA依賴性致血小板假性減少癥，3例聚集的為大血小板患者，2例血小板衛(wèi)星現(xiàn)象，3例為冷凝集誘發(fā)的聚集。

1.2 儀器與試劑

采用希森美康血細(xì)胞分析儀（SysmexXT4000i），試劑為希森美康專用血球原裝配套試劑試劑和相關(guān)質(zhì)控品。用(OLYMPUS CX31)顯微鏡油鏡下觀察PLT聚集分布和形態(tài)。

1.3 標(biāo)本采集

用EDTA-K2抗凝采集2 mL全血充分混勻,實(shí)驗(yàn)前儀器室內(nèi)質(zhì)控在控且標(biāo)本測(cè)定在1 h內(nèi)完成。對(duì)符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的患者標(biāo)本，排除標(biāo)本凝固問(wèn)題和檢測(cè)隨機(jī)誤差外，對(duì)確認(rèn)血小板聚集的患者再次采集枸櫞酸鈉抗凝和無(wú)抗凝劑各1管。該研究所用真空采血管均由湖南省瀏陽(yáng)市醫(yī)用科技發(fā)展有限公司提供。

1.4 涂片染色鏡檢及手工稀釋計(jì)數(shù)

EDTA抗凝全血涂片后用瑞氏-姬姆薩染液(自配)染色及鏡檢；手工稀釋計(jì)數(shù)為在清潔試管中加入稀釋液0.38 mL草酸銨(自配)加準(zhǔn)確吸取20 μL無(wú)抗凝劑全血,進(jìn)行手工計(jì)數(shù)血小板,方法均依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測(cè)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示；4種復(fù)查方法學(xué)差異性比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

EDPA依賴性致血小板假性減少癥（EDTA-PTCP）共有42例。該42例標(biāo)本首次采血后上機(jī)檢測(cè)結(jié)果血小板計(jì)數(shù)均低于80×109/L，取EDTA采樣的抗凝血涂片染色后鏡檢，低倍鏡下可見(jiàn)血小板聚集，成團(tuán)或成小堆存在，油鏡下可見(jiàn)數(shù)量較多的血小板聚集現(xiàn)象。對(duì)此患者當(dāng)場(chǎng)抽血2管，未加任何抗凝劑管立即上機(jī)檢測(cè)，枸櫞酸鈉抗凝管2 min之內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果均在正常范圍，與手工計(jì)數(shù)結(jié)果一致，均與首次上機(jī)檢測(cè)結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。用SPSS軟件對(duì)復(fù)查方法進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，枸櫞酸鈉抗凝與即刻上機(jī)復(fù)查，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021＜0.05），即刻上機(jī)復(fù)查與手工計(jì)數(shù)復(fù)查，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042＜0.05）。

2.2 其他原因組的結(jié)果分析

大血小板致血小板計(jì)數(shù)減少共3例，首次上機(jī)檢測(cè)及枸櫞酸鈉抗凝復(fù)查血小板結(jié)果均低于50×109/L，血細(xì)胞分析儀血小板直方圖2例出現(xiàn)聚集報(bào)警。涂片鏡下觀察，易見(jiàn)大血小板或較大血小板有聚集現(xiàn)象。手工計(jì)數(shù)或未加抗凝劑抽血立即上機(jī)后結(jié)果正常，與涂片估算結(jié)果較一致。血小板衛(wèi)星現(xiàn)象共2例，1例為儀器聚集報(bào)警，油鏡下觀察可見(jiàn)血小板附在中心性分葉核白細(xì)胞周圍，手工計(jì)數(shù)結(jié)果在正常范圍。冷凝聚3例，首次結(jié)果均未能檢測(cè)，將該標(biāo)本至37℃水浴30 min后上機(jī)檢測(cè)，血小板的結(jié)果在正常范圍；另外枸櫞酸鈉及無(wú)抗凝劑均在37℃水杯中進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果均有低于100×109/L，儀器血小板未見(jiàn)聚集提示，手工計(jì)數(shù)結(jié)果均在正常范圍。

表1 血小板假性減少原因分析及4種方法檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 血小板假性減少原因分析及4種方法檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：－表示無(wú)數(shù)據(jù)；血小板計(jì)數(shù)單位為×109/L。

原因例數(shù)EDTA抗凝結(jié)果枸櫞酸鈉抗凝結(jié)果無(wú)抗凝劑（即刻上機(jī)）結(jié)果（×109/L）手工計(jì)數(shù)結(jié)果EDTA-PTCP大血小板血小板衛(wèi)星現(xiàn)象冷凝聚42 323 56.5±16.28 32.33±8.14 52.5±6.36 -201.55±45.34 33.33±1.53 157.50±10.61 80.0±15.72 207.95±48.77 157.67±13.87 176.50±17.68 76.0±9.85 206.62±48.14 151.68±12.58 171.0±15.56 198.0±26.2

2.3 血小板直方圖及警報(bào)提示信息進(jìn)行分析

對(duì)首次EDTA抗凝檢測(cè)結(jié)果中血小板直方圖出現(xiàn)翹尾，警報(bào)框出現(xiàn)“血小板聚集？”等為有聚集提示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EDTA-PTCP組76.2%的血小板假性減少在血細(xì)胞分析儀上可出現(xiàn)聚集報(bào)警，見(jiàn)表2。采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算得出，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.77，P＜0.05）。

表2 血小板假性減少在血常規(guī)儀器上聚集提示報(bào)警情況

3 討論

在該院2014年6月—2016年6月期間住院的26 923例患者，在他們進(jìn)行血常規(guī)分析中發(fā)現(xiàn)42例EDTA -PTCP病例，其發(fā)生率為0.156%。與文獻(xiàn)報(bào)道[1,4]的發(fā)生率基本一致。該研究篩查患者血小板計(jì)數(shù)低于70×109/L的病例，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了血小板直方圖觀察和顯微鏡檢查有無(wú)聚集。可能漏檢一些血小板檢測(cè)數(shù)量較高即使因EDTA原因聚集卻未降至70×109/L以下的病例，推測(cè)實(shí)際發(fā)生率可能會(huì)更高。排除血小板減少癥患者，已經(jīng)有學(xué)者[5]提出了幾種方法來(lái)防止血小板凝聚，如使用替代抗凝劑包括枸櫞酸鈉、肝素等。從該文表1結(jié)果表明，42例EDTA-PTCP可以用枸櫞酸鈉抗凝或無(wú)抗凝劑抽血立即上機(jī)可以加以糾正，其糾正數(shù)值手工計(jì)數(shù)結(jié)果相接近，與馮戟等[6-7]研究結(jié)果一致。用配對(duì)t檢驗(yàn)比較4種檢測(cè)血小板的均值（P＜0.05），結(jié)果表示EDTA抗凝與枸櫞酸鈉抗凝劑、無(wú)抗凝劑即刻上機(jī)及手工計(jì)數(shù)檢測(cè)血小板數(shù)值均有顯著性差異。對(duì)于使用枸櫞酸抗凝計(jì)數(shù)血小板標(biāo)本盡快檢測(cè)對(duì)結(jié)果影響較少，與Lin J等[4]研究要求在10 min內(nèi)檢測(cè)要求相近。另外該研究發(fā)現(xiàn)2例大血小板聚集患者對(duì)枸櫞酸鈉也發(fā)生聚集現(xiàn)象，有研究報(bào)道[8]枸櫞酸鈉抗凝血也可引起PLT計(jì)數(shù)假性減少，但對(duì)其引起血小板假性減少的機(jī)制尚不清楚。該研究中42例EDTA-PTCP患者標(biāo)本EDTA抗凝上機(jī)PLT直方圖90.5%提示聚集報(bào)警，但血涂片均見(jiàn)PLT明顯聚集現(xiàn)象。大血小板、血小板衛(wèi)星現(xiàn)象及冷凝集素引起血小板假性減少現(xiàn)象較少見(jiàn)，病例數(shù)非常有限，儀器提示聚集報(bào)警率較低37.5%。其中2例大血小板患者中使用枸櫞酸鈉抗凝，檢測(cè)結(jié)果仍很低，經(jīng)涂片血小板發(fā)現(xiàn)也有5～10個(gè)聚集情況，其發(fā)生機(jī)制也不明確。

EDTA-PTCP的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前病理生理尚不十分清楚。EDTA誘導(dǎo)PTCP在1969年首次由Gowland等人報(bào)道，根據(jù)Lin J等或Shabnam I等的研究[4,9]提及Ca2+的螯合作用可以使Ca2+依賴的血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，由于EDTA表面糖蛋白和陰離子磷脂引起的改變，在抗血小板抗體結(jié)合的作用下誘導(dǎo)血小板聚集。有學(xué)者[2]推測(cè)可能是某些EDTA-PTCP患者血漿存在自身抗體抗、抗心磷脂抗體、血小板抗體以及血小板表面可能存在的某些與聚集相關(guān)隱匿性抗原等，導(dǎo)致血小板發(fā)生聚集。有學(xué)者研究表明EDTA-PTCP患者血小板聚集與EDTA抗凝時(shí)間及室內(nèi)溫度有關(guān)，時(shí)間越長(zhǎng)溫度越低現(xiàn)象越頻繁。另外對(duì)EDTA-PTCP患者的危險(xiǎn)因素已被廣泛研究，住院治療，藥物治療或潛在的疾病被認(rèn)為是增加EDTA-PTCP患者危險(xiǎn)因素[10]。Saigo K等的綜述研究[11]提及EDTA-PTCP患者可能與自身免疫性疾病，病毒和細(xì)菌感染、慢性肝疾病，代謝綜合征，惡性腫瘤等疾病有關(guān)，然而沒(méi)有研究明確具體的疾病和EDTA-PTCP患者的發(fā)生密切相關(guān)。

對(duì)EDTA-PTCP患者誤診的可能存在以下原因：①血小板減少的復(fù)查制度及處理流程不夠完善；②科員對(duì)血涂片鏡檢及手工計(jì)數(shù)血小板的能力有待提高；③住院患者血常規(guī)標(biāo)本采集到上機(jī)檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致血小板聚集更顯著；④部分檢驗(yàn)人員及臨床醫(yī)生對(duì)EDTAPTCP認(rèn)識(shí)不足、重視不夠，兩者可能溝通不到位等。因此必須提高醫(yī)務(wù)人員對(duì)EDTA-PTCP患者的應(yīng)對(duì)策略，具體措施如下：①本科室的血小板減少的復(fù)查制度：PLT＞1 000×109/L或PLT＜70×109/L或儀器提示血小板聚集及血小板直方圖有翹尾異常均要涂片鏡檢復(fù)查。該科室處理流程為對(duì)于鏡檢血小板有聚集疑似EDTAPTCP患者，首先查看標(biāo)本質(zhì)量是否合格，是否出現(xiàn)凝塊；同時(shí)查看儀器提示警報(bào)是否出現(xiàn)提示PLT聚集及PLT直方圖異常；第二與臨床醫(yī)生或患者溝通是否出現(xiàn)皮膚紫癜、淤點(diǎn)淤斑、牙齦出血、鼻出血、胃腸道出血等PLT減少病癥，當(dāng)血小板減低與患者臨床癥狀或病史不符則必須涂片染色鏡檢[10]；第三顯微鏡觀察血小板分布情況，如易見(jiàn)血小板成團(tuán)或成小堆聚集則通知患者重新采血手工計(jì)數(shù)復(fù)查或重新抽血無(wú)抗凝劑或枸櫞酸鈉抗凝的真空管立即上機(jī)復(fù)查3種方法選其中一進(jìn)行復(fù)查，必要時(shí)選兩種）。②加強(qiáng)科員對(duì)PLT鏡檢及手工計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)?zāi)芰Γ匾氖亲R(shí)別血小板計(jì)數(shù)假性減少的能力，初步結(jié)合儀器報(bào)警提示、PLT直方圖、血涂片鏡檢綜合分析及時(shí)有效處理，避免患者不必要的治療。③檢驗(yàn)人員提高工作責(zé)任心，高度重視PLT假性減少病例，加強(qiáng)與臨床醫(yī)患人員溝通交流。④對(duì)于出現(xiàn)冷凝集素、大血小板、血小板衛(wèi)星現(xiàn)象所引起的血小板假性減少，可進(jìn)行草酸銨法手工計(jì)數(shù)血小板進(jìn)行糾正更為準(zhǔn)確[12]。手工計(jì)數(shù)法是血小板測(cè)定的參考方法，雖然精密度與儀器相比較差，但可計(jì)數(shù)2～3次取均值來(lái)減少實(shí)驗(yàn)誤差，是對(duì)血小板假性減少的復(fù)查中一種經(jīng)典有效的方法。⑤用枸櫞酸鈉抗凝劑或無(wú)抗凝劑立即上機(jī)進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)復(fù)查，可能檢測(cè)結(jié)果與手工計(jì)數(shù)結(jié)果存在一些差異，同時(shí)不能作為結(jié)果報(bào)告僅供檢驗(yàn)人員復(fù)查參考，但其對(duì)于排除EDTA-PTCP引起的血小板假性減少也是可行的快捷方法。

綜上所述，當(dāng)出現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)結(jié)果減少、儀器有報(bào)警提示或者PLT直方圖有異常時(shí)，檢驗(yàn)人員應(yīng)引起足夠重視，采取相應(yīng)的措施進(jìn)行全面、綜合的復(fù)查處理，避免發(fā)出錯(cuò)誤檢驗(yàn)結(jié)果，必須為臨床醫(yī)患人員提供正確可靠的檢驗(yàn)報(bào)告，減少醫(yī)療糾紛構(gòu)建和諧醫(yī)患關(guān)系。但目前EDTA-PTCP發(fā)生的機(jī)制不是很明確[4]，如抗血小板抗體產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，血小板在受EDTA抗凝劑作用后的變化機(jī)制，EDTA誘導(dǎo)血小板聚集與抗凝時(shí)間、溫度還沒(méi)有很好的定論，為何這種聚集現(xiàn)象只發(fā)生在極少數(shù)人，與疾病、用藥、機(jī)體本身抗體或相關(guān)生化免疫指標(biāo)有何關(guān)聯(lián)等都有待進(jìn)一步探討研究。

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Experimental Analysis and Countermeasures of Edta-dependent Pseudo-reduction of Platelet

HUANG Chao-ren1,ZOU Guang-mei2
1.Department of Clinical Laboratory,the Traditional Chinese Medicine of Yulin City,Yulin,Guangxi Province,537000 China；2.Department of Clinical Laboratory,the First People’s Hospital of Yulin City,Yulin,Guangxi Province,537000 China

ObjectiveTo analyze the cause and reexamination method of pseudo-reduction of platelet by the blood cell analyzer.Methods50 cases of patients with pseudo-reduction of platelet were selected as the research objects according to the reexamination standards,and the causes and reexamination method were analyzed.ResultsIn the 50 cases of samples, Ethylenediaminetetraacetic acid–dependent occurred to 42 cases,giant platelet occurred to 3 cases,and white blood cell satellite phenomenon occurred to 2 cases,and cold agglutination occurred to 3 cases,and the platelet results within the normal range could be obtained after reexamination.ConclusionThe gather phenomenon is found in patients with EDTA-PTCP after the microscopy smear,and the platelet figure can be reexamined by the manual counting to avoid the misdiagnosis.

Platelet count;Platelet aggregation;Pseudo-reduction of platelet;EDTA

R55

A

1672-5654（2016）12（b）-0049-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.35.049

2016-09-14）

黃朝任（1981.2-），男，壯族，廣西南寧人，本科，主管技師，主要從事臨床生化及血液研究工作。