亞臨界水耦合冷凍干燥法制備芹菜素納米分散體

田濟(jì)陽(yáng)，鄒源佐，蒲源，王丹

（1 北京化工大學(xué)有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100029； 2 北京化工大學(xué)教育部超重力工程研究中心，北京100029）

引 言

芹菜素(apigenin,C15H10O5)，又名4,5,7-三羥基黃酮，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1(a)所示，是一種天然存在的黃酮類(lèi)化合物。芹菜素純品呈淺黃或黃綠色，無(wú)嗅無(wú)味，不溶于水，微溶于乙醇、溶于稀KOH 溶液和二甲基亞砜(DMSO)[1]，大量存在于歐芹、芹菜、桔子、百里香和橙子等各種蔬菜水果及從植物提取的飲料,如茶及啤酒和葡萄酒中[2-3]。天然來(lái)源的芹菜素?zé)o毒，無(wú)遺傳毒性[4]，具有多種藥理活性。現(xiàn)有研究表明芹菜素優(yōu)良的生物學(xué)特性包括抗抑郁[5-6]、抗炎癥[7-8]、肝 保 護(hù)[9-10]、抗 癌[11-12]、抑 制 衰 老[13]，抗 氧 化[14]等。但由于芹菜素水溶性較差，在生物體內(nèi)溶解度水平低，導(dǎo)致其在使用過(guò)程中生物利用率低，這在很大程度上影響了它的進(jìn)一步應(yīng)用[15]。通過(guò)減小藥物尺寸使藥物納米化，可提高藥物與介質(zhì)的有效接觸面積，從而有效提高藥物溶解度，增加生物利用率[16]。現(xiàn)使用的藥物納米化方法主要包括機(jī)械粉碎法[17]、沉淀法[18]、超臨界流體法[19]等，其中溶劑反溶劑沉淀法被認(rèn)為是制備納米顆粒的有效途徑[20]。目前已有文獻(xiàn)采用機(jī)械粉碎耦合高壓均質(zhì)法[21]、超臨界CO2抗溶劑法[22]、制備負(fù)載有芹菜素的脂質(zhì)體[23]等方式對(duì)芹菜素[原料SEM 圖見(jiàn)圖1(b)]進(jìn)行納米化及改性，制備出了粒徑在100～400 nm 不等的芹菜素顆粒。但是存在高能耗、有機(jī)物殘留、顆粒粒徑分布寬等問(wèn)題，導(dǎo)致需要對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行復(fù)雜的洗滌與純化過(guò)程。亞臨界水(subcritical water, SBCW)是指溫度在100～374℃的范圍內(nèi)，通過(guò)施加壓力使水保持為液體狀態(tài)[24]，亦可稱(chēng)為加壓熱水。亞臨界水的極性可以通過(guò)改變溫度在很大范圍內(nèi)進(jìn)行控制，根據(jù)相似相溶原理使其更像有機(jī)溶劑[25]，因此能夠在不使用有機(jī)溶劑的前提下溶解更多極性和非極性化合物?，F(xiàn)已有使用亞臨界水法制備其他藥物納米顆粒的文獻(xiàn)報(bào)道，包括醋酸甲地孕酮[26]、克拉霉素[27]等，在減小藥物尺寸、提高藥物溶解度方面均取得了不錯(cuò)進(jìn)展，但仍無(wú)采用亞臨界水法制備超細(xì)芹菜素納米顆粒的先例。本文在溶劑(亞臨界水)-反溶劑(去離子水)體系下，利用溶劑反溶劑沉淀耦合冷凍干燥法，將溶有藥物的亞臨界水迅速?lài)娙氲蜏厝ルx子水，并即刻加入液氮迅速冷凍后進(jìn)行冷凍干燥處理，此過(guò)程極大地縮短了藥物結(jié)晶生長(zhǎng)時(shí)間，有利于保持顆粒的原始形貌，最終制備出了尺寸較小的芹菜素納米顆粒，為納米芹菜素顆粒的綠色制備提供一種有效途徑。

圖1 芹菜素化學(xué)結(jié)構(gòu)式及原料藥掃描電鏡圖Fig.1 Chemical structure of apigenin and SEM image of the raw material

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料與試劑

芹菜素(純度98%，購(gòu)自上海賢鼎生物科技有限公司)，去離子水(實(shí)驗(yàn)室自制)，γ-環(huán)糊精(化學(xué)純，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)，吐溫20、吐溫40(分析純，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司)，羥丙基甲基纖維素(化學(xué)純，購(gòu)自天津希恩思生化科技有限公司)，高純氮?dú)?純度99.999%，購(gòu)自北京順安奇特氣體有限公司)，甲醇(色譜純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，KOH(分析純，購(gòu)自北京化工廠(chǎng))。

1.2 設(shè)備與工藝

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備概述 實(shí)驗(yàn)裝置由反應(yīng)釜(美國(guó)Parr 公司)、4848 反應(yīng)控制器(美國(guó)Parr 公司)及D260型Teledyne Isco 高壓高精度柱塞泵(美國(guó)TeLedyne Isco公司)組成，如圖2所示。

圖2 亞臨界水法制備芹菜素納米顆粒實(shí)驗(yàn)裝置Fig.2 Schematic diagram of apigenin nanoparticles preparation by using SBCW method

1.2.2 實(shí)驗(yàn)原理及過(guò)程 圖3簡(jiǎn)要描述了以亞臨界水為溶劑，去離子水為反溶劑，通過(guò)溶劑反溶劑法制備芹菜素納米顆粒的主要原理及步驟。首先是實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備過(guò)程：向75 ml去離子水中加入20 mg 芹菜素原料藥，超聲分散30 min 形成渾濁溶液，而后將其轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中。安裝反應(yīng)釜并檢查裝置氣密性，無(wú)誤后通過(guò)控制及檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)置反應(yīng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及反應(yīng)壓力。隨后通過(guò)高壓高精度柱塞泵將氮?dú)馔ㄈ敕磻?yīng)釜，排凈空氣。其次是溶解過(guò)程：開(kāi)啟加熱、攪拌裝置，同時(shí)開(kāi)啟高壓高精度柱塞泵恒定壓力控制器，保持實(shí)驗(yàn)壓力穩(wěn)定。待溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、壓力達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)定值后計(jì)時(shí)1 h，使芹菜素在亞臨界水中溶解，溶解過(guò)程中攪拌槳轉(zhuǎn)速均設(shè)定為200 r/min。最終造粒過(guò)程：溶解過(guò)程結(jié)束后，通過(guò)控制取樣閥門(mén)，將溶有芹菜素的亞臨界水溶液在高溫高壓下迅速?lài)娙胧⒎庞蟹慈軇┤ルx子水的容器中，取樣完畢時(shí)迅速加入液氮冷凍，隨后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干處理。同時(shí)為保證混合均勻，取樣容器中事先放入磁子，并在容器下方放置磁力攪拌裝置，從而實(shí)現(xiàn)去離子水與亞臨界水溶液的均勻混合。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，亞臨界水造粒過(guò)程后，反應(yīng)釜底部均有未完全溶解的芹菜素沉淀，因此可以判斷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中芹菜素在亞臨界水中是飽和狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芹菜素在亞臨界水中濃度小于20 mg/75 ml。芹菜素在不同溫度的亞臨界水中飽和溶解度的測(cè)定，以及不同濃度芹菜素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，有待進(jìn)一步探究。

1.3 實(shí)驗(yàn)表征方法

圖3 以亞臨界水為溶劑，去離子水為反溶劑，芹菜素納米顆粒的制備原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of apigenin nanoparticles by using SBCW as solvent and deionized water as anti-solvent

1.3.1 掃 描 電 鏡 分 析（scanning electronic microscopy，SEM） 使用日本電子(JEOL)JEOLJSM-6360LV 型掃描電子顯微鏡觀(guān)察所制備顆粒的大小與形貌。將冷凍干燥后得到的固體粉末加入一定量去離子水超聲分散，再使用移液槍取少量芹菜素混懸液滴于硅片上，經(jīng)室溫干燥后將其黏在貼有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，噴金處理(噴金條件：使用Pelco Model 3 高精度噴金儀，在氬氣保護(hù)下，電流50 mA，時(shí)長(zhǎng)30 s)后將樣品放入樣品室內(nèi)觀(guān)察顆粒大小和形貌。

1.3.2 傅里葉紅外光譜分析（Fourier transform infrared spectrophotometry，F(xiàn)TIR） 使用美國(guó)尼高力(Nicolet)公司8700 型傅里葉紅外光譜儀測(cè)定樣品FTIR 光譜圖。測(cè)試時(shí)取微量?jī)龈珊蟮玫降墓腆w粉末與KBr 混合并研磨，而后壓片制樣，使用傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內(nèi)對(duì)樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，對(duì)比判斷其化學(xué)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變。

1.3.3 X 射線(xiàn)衍射分析（X-ray diffraction，XRD）使用日本津島(Shimadzu)公司XRD-6000 衍射儀對(duì)所制備樣品的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)試分析。測(cè)試開(kāi)始前將樣品填滿(mǎn)樣品池并壓實(shí)，測(cè)試時(shí)設(shè)置掃描速率為5(°)/min，掃描步長(zhǎng)為0.05，掃描范圍為5°～90°。

1.3.4 紫外可見(jiàn)光吸光度測(cè)試（ultraviolet-visible，UV-Vis） 使用Shimadzu UV-2600紫外分光光度計(jì)對(duì)樣品的吸光度進(jìn)行測(cè)試。提前配置稀KOH 溶液，并將芹菜素原料藥及所制備樣品溶解于其中，超聲充分溶解后，放入儀器進(jìn)行吸光度檢測(cè)。通過(guò)對(duì)比紫外吸收光譜圖分析判斷原料藥及所制備樣品官能團(tuán)及化學(xué)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。

1.3.5 質(zhì)譜分析（mass spectrometry，MS） 使用UPLC/Premier液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。將樣品溶解在甲醇中，采用直接進(jìn)樣-負(fù)模式對(duì)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析所測(cè)試樣品的質(zhì)譜圖，判斷樣品質(zhì)量是否發(fā)生變化，從而判斷所制備樣品是否變質(zhì)。

1.3.6 比表面積分析（brunaue-emmett-teller，BET） 采用美國(guó)康塔儀器公司Quadrasorb 型比表面積分析儀在液氮低溫條件下測(cè)量芹菜素原料藥及被γ-環(huán)糊精包覆的納米顆粒的比表面積。開(kāi)始測(cè)量前需準(zhǔn)確稱(chēng)量樣品及樣品管質(zhì)量，而后脫氣(室溫30 min 后再在80℃下3 h)進(jìn)行預(yù)處理除去雜質(zhì)。脫氣完畢后再次稱(chēng)量樣品管加樣品質(zhì)量，而后開(kāi)始測(cè)試。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 反溶劑溫度對(duì)造粒的影響

通過(guò)單因素變量實(shí)驗(yàn)，選擇160℃為初始實(shí)驗(yàn)條件，反應(yīng)壓力設(shè)定為5 MPa，探究了反溶劑溫度對(duì)芹菜素顆粒形貌的影響。反溶劑溫度對(duì)芹菜素顆粒形貌及分散度的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)探究了25℃和0℃條件下造粒結(jié)果與反溶劑溫度間的關(guān)系。結(jié)果表明隨著反溶劑溫度的降低，芹菜素顆粒粒徑減小，且分散程度有明顯提升。這是由于隨著反溶劑溫度的降低，芹菜素在亞臨界水與去離子水混合體系中的溶解度更低，過(guò)飽和度更高，同時(shí)低溫環(huán)境降低了分子運(yùn)動(dòng)速率，限制溶質(zhì)分子從溶液主體向已成核晶體表面擴(kuò)散，減緩晶體生長(zhǎng)速率。較低的體系溫度也在一定程度上減緩了晶體間的不規(guī)則碰撞，降低顆粒團(tuán)聚概率。綜上，確定0℃為較優(yōu)反溶劑溫度。

2.2 溶劑與反溶劑體積比對(duì)造粒的影響

實(shí)驗(yàn)分別使用160℃亞臨界水和0℃去離子水作為溶劑及反溶劑，反應(yīng)壓力為5 MPa，探究溶劑與反溶劑體積比分別為1∶1、1∶3、1∶5 對(duì)造粒的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明溶劑與反溶劑體積比的變化對(duì)顆粒形貌及分散程度沒(méi)有顯著影響。這是由于本實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程與傳統(tǒng)溶劑與反溶劑過(guò)程有所區(qū)別，未將溶劑與反溶劑在反應(yīng)釜中進(jìn)行混合，從原理上解釋?zhuān)緦?shí)驗(yàn)中芹菜素納米顆粒最終的形貌及尺寸主要由溶劑(亞臨界水)與反溶劑(去離子水)瞬間接觸時(shí)驟增的過(guò)飽和度決定。在反應(yīng)釜內(nèi)高壓的推動(dòng)下，亞臨界水溶液從內(nèi)徑約1.5 mm 取樣口高速?lài)姵?，并瞬間被去離子水包裹，因此理論上反溶劑與溶劑的體積比為無(wú)限大。但為保證實(shí)驗(yàn)條件統(tǒng)一，所有實(shí)驗(yàn)均選用1∶3 的溶劑與反溶劑體積比。

2.3 亞臨界水溫度對(duì)造粒的影響

圖4 不同反溶劑溫度下芹菜素掃描電鏡圖Fig.4 SEM images of apigenin particles prepared at different anti-solvent temperature

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用0℃去離子水作為反溶劑，反應(yīng)壓力設(shè)定為5 MPa。探究亞臨界水溫度對(duì)造粒的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示。120℃時(shí)，顆粒尺寸較大，粒徑在80～100 nm 范圍內(nèi)。溫度提高至140℃時(shí)，顆粒尺寸有所減小，平均粒徑在30 nm 左右，但分散性較差，局部有較為明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。繼續(xù)提高溫度至160℃時(shí)，顆粒尺寸進(jìn)一步減小，平均粒徑在25 nm 左右，且分散性有所改善。溫度升高至180℃和200℃時(shí)，均發(fā)生較為明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，200℃時(shí)尤為明顯。這是由于過(guò)飽和度水平的高低主要體現(xiàn)在芹菜素在亞臨界水與去離子水中溶解度的差異。據(jù)文獻(xiàn)中亞臨界水造粒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著亞臨界水溫度的升高，藥物溶解度會(huì)有相應(yīng)提升，這直接導(dǎo)致了過(guò)飽和度的提高[28-29]。過(guò)飽和度愈大，成核速率愈快，析出的顆粒粒度愈細(xì)，當(dāng)過(guò)飽和度在短時(shí)間內(nèi)形成導(dǎo)致大量顆粒成核并快速消耗過(guò)飽和度時(shí)，可以得到粒度更細(xì)、分布更窄的顆粒[30]。但與此同時(shí)，隨著溫度的升高，過(guò)飽和度提升，重結(jié)晶得到的顆粒數(shù)量也會(huì)相應(yīng)有所增加，導(dǎo)致顆粒間碰撞加劇，引發(fā)顆粒的二次結(jié)晶，形成的顆粒粒徑變大。該過(guò)程也說(shuō)明了不同飽和溶解度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從而間接地探究了亞臨界水溶液中芹菜素濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。最終確定160℃為亞臨界水的較優(yōu)溫度。值得注意的是，雖然在該條件下造粒結(jié)果分散性較好，但穩(wěn)定性不高，靜置后沉降現(xiàn)象較為明顯，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)考慮使用表面活性劑來(lái)進(jìn)一步提高顆粒的分散及穩(wěn)定程度。

圖5 不同溶劑與反溶劑體積下芹菜素顆粒的SEM圖Fig.5 SEM images of apigenin particles obtained from different volume ratio of solvent/anti-solvent

2.4 反應(yīng)壓力對(duì)造粒的影響

實(shí)驗(yàn)使用160℃亞臨界水和0℃去離子水作為溶劑及反溶劑，探究不同反應(yīng)壓力對(duì)造粒的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示。結(jié)果表明反應(yīng)壓力為5 MPa和8 MPa 時(shí)對(duì)顆粒形貌影響不大，提高反應(yīng)壓力可使反應(yīng)體系壓力大于水在反應(yīng)溫度條件下的飽和蒸汽壓，使水保持為液態(tài)，同時(shí)通過(guò)向反應(yīng)體系內(nèi)通入氮?dú)?，達(dá)到排凈空氣的目的。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)壓力均采用5 MPa。

2.5 表面活性劑種類(lèi)及濃度對(duì)造粒的影響

表面活性劑是最常見(jiàn)的功能性輔料[31]，是一種能夠改變?nèi)芤盒再|(zhì)的表面活性物質(zhì)，其具有難溶性藥物增溶及增加藥物穩(wěn)定性等功效[32-33]。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地探究了表面活性劑種類(lèi)及濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.5.1 表面活性劑種類(lèi)對(duì)造粒的影響 該部分實(shí)驗(yàn)使用0℃去離子水和160℃亞臨界水作為溶劑及反溶劑，設(shè)置反應(yīng)壓力為5 MPa。選用相同濃度的γ-環(huán)糊精、吐溫20、吐溫40 及羥丙基甲基纖維素作為表面活性劑，探究表面活性劑種類(lèi)對(duì)造粒的影響，結(jié)果如圖8 所示。從電鏡圖中可以明顯看出使用γ-環(huán)糊精作為表面活性劑的效果最為明顯，形成的顆粒粒徑小，且分散均勻。使用吐溫20作為表面活性劑時(shí)，局部出現(xiàn)了團(tuán)聚現(xiàn)象。使用吐溫40及羥丙基甲基纖維素時(shí)，均出現(xiàn)了較為明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。因此選擇γ-環(huán)糊精作為最佳表面活性劑進(jìn)行后續(xù)濃度的探究實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所使用的γ-環(huán)糊精結(jié)構(gòu)式如圖9 所示，相比于吐溫20、吐溫40 及羥丙基甲基纖維素，γ-環(huán)糊精最為突出的特點(diǎn)為含有較多羥基，其外緣親水內(nèi)緣疏水，且分子中間含有空穴，這種空穴可作為主體包絡(luò)適當(dāng)?shù)目腕w，中心的疏水性?xún)?nèi)腔可與芹菜素通過(guò)氫鍵作用后將其包裹，增強(qiáng)藥物親水性，改善難溶性藥物水溶性，緩解藥物顆粒團(tuán)聚、結(jié)塊，這種特性在公開(kāi)文獻(xiàn)中已有報(bào)道[34]。這進(jìn)一步證明了γ-環(huán)糊精可作為當(dāng)前體系下的最佳表面活性劑。

圖6 不同亞臨界水溫度下芹菜素顆粒的電鏡圖Fig.6 SEM images of apigenin particles obtained from different temperatures of SBCW

圖7 不同壓力條件下芹菜素顆粒的電鏡圖Fig.7 SEM images of apigenin particles obtained from different pressure

圖8 使用不同表面活性劑制備的芹菜素顆粒掃描電鏡圖Fig.8 SEM images of apigenin particles prepared by using different surfactant

圖9 γ-環(huán)糊精化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.9 Chemical structure of γ-cyclooctapentylose

2.5.2 不同濃度γ-環(huán)糊精對(duì)造粒的影響 本部分實(shí)驗(yàn)中，使用不同濃度的γ-環(huán)糊精作為表面活性劑，亞臨界水溫度為160℃，反溶劑溫度為0℃，實(shí)驗(yàn)壓力為5 MPa。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10 所示，由上至下濃度依次為0、1%、2%、5%、10%、15%(質(zhì)量)。濃度為1%時(shí)，團(tuán)聚現(xiàn)象較為明顯，濃度提升至2%時(shí)，單分散顆粒開(kāi)始出現(xiàn)。當(dāng)濃度達(dá)到5%時(shí)，得到了分散性良好，大小均一，且粒徑較小的球形納米顆粒，粒徑約為20～30 nm。濃度繼續(xù)提高后，又出現(xiàn)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象，且團(tuán)聚程度較大。出現(xiàn)這種情況的主要原因是，隨著γ-環(huán)糊精濃度的提高，吸附在芹菜素納米顆粒表面的γ-環(huán)糊精數(shù)量增加，使得更多的芹菜素分子可以被其空穴包裹，因此出現(xiàn)的顆粒向著粒徑更小、形貌更均勻的趨勢(shì)發(fā)展。但當(dāng)濃度進(jìn)一步提升后，由于γ-環(huán)糊精含有較多羥基，過(guò)高濃度會(huì)促使分子間形成強(qiáng)度較大的氫鍵，在保持顆粒形貌良好的同時(shí)，加劇了顆粒間團(tuán)聚。綜上，將5%(質(zhì)量)定為γ-環(huán)糊精的最佳濃度。

2.5.3 γ-環(huán)糊精對(duì)顆粒穩(wěn)定性的影響 為觀(guān)察γ-環(huán)糊精對(duì)所制備納米分散體穩(wěn)定性的影響，分別將添加有γ-環(huán)糊精及未添加γ-環(huán)糊精的固體粉末超聲分散在去離子水中靜置后觀(guān)察，實(shí)驗(yàn)條件如下：亞臨界水溫度為160℃，反溶劑溫度為0℃，實(shí)驗(yàn)壓力為5 MPa。通過(guò)圖11(a)可以看出添加有γ-環(huán)糊精的納米分散體在靜置7 天后仍具有較好分散性，光源照射時(shí)有明顯丁達(dá)爾現(xiàn)象[圖11(b)]。而未添加γ-環(huán)糊精的顆粒[圖11(a)]在靜置3 天后發(fā)生明顯沉降，光源照射后未見(jiàn)顯著丁達(dá)爾現(xiàn)象[圖11(c)]。因此，γ-環(huán)糊精可極大程度地提高顆粒穩(wěn)定性，避免顆粒發(fā)生沉降和團(tuán)聚現(xiàn)象。

2.6 傅里葉紅外光譜分析（FTIR）

圖12為芹菜素原料藥、芹菜素納米顆粒與芹菜素/γ-環(huán)糊精納米顆粒的傅里葉紅外光譜分析對(duì)比圖。其中芹菜素原料藥的FTIR 圖與已有文獻(xiàn)報(bào)道保持一致[35]。結(jié)合圖片分析可以明顯看出芹菜素原料藥與通過(guò)亞臨界水耦合冷凍干燥法制備得到的芹菜素納米顆粒在400～4000 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)的特征峰出現(xiàn)位置相同且峰強(qiáng)保持一致。相比于原料藥，加入γ-環(huán)糊精的芹菜素納米顆粒在3200～3700 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)出現(xiàn)寬峰，這是因?yàn)榍鄄怂嘏cγ-環(huán)糊精分子間形成氫鍵，發(fā)生了締合作用，這也對(duì)γ-環(huán)糊精包覆的芹菜素納米顆粒具有較高分散度做了進(jìn)一步解釋。

圖10 不同濃度γ-環(huán)糊精條件下制備的芹菜素顆粒掃描電鏡圖Fig.10 SEM images of apigenin particles prepared at different concentrations of γ-cyclooctapentylose

2.7 X射線(xiàn)衍射分析（XRD）

圖13為芹菜素原料藥、芹菜素納米顆粒與芹菜素/γ-環(huán)糊精納米顆粒的XRD 譜圖。芹菜素原料藥的XRD 譜圖與已有報(bào)道相一致[36]。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，芹菜素原料藥衍射峰強(qiáng)度大，說(shuō)明其晶型明顯。經(jīng)過(guò)亞臨界水耦合冷凍干燥法及添加γ-環(huán)糊精后所制備的芹菜素納米顆粒衍射峰強(qiáng)度有所降低，這表明所制備的芹菜素納米顆粒的結(jié)晶度下降。最終制備的芹菜素/γ-環(huán)糊精納米顆粒的XRD 譜圖無(wú)明顯衍射峰出現(xiàn)，說(shuō)明其晶體呈無(wú)定形態(tài)，特別地，無(wú)定形態(tài)的藥物往往具有更好的溶出效果[37]。呈無(wú)定形態(tài)的藥物溶解度比穩(wěn)定態(tài)化合物的溶解度大，是因?yàn)槠渚哂休^高的Gibbs 自由能，故而在溶解時(shí)所需能量較少，使其更易溶解。

2.8 紫外可見(jiàn)光吸光度測(cè)試（UV-Vis）

圖14 為不同顆粒的紫外吸收光譜對(duì)比圖。從圖中可以看出三條曲線(xiàn)所對(duì)應(yīng)的吸收峰位置基本保持一致，且在270 nm 左右存在最大吸收峰，從而驗(yàn)證了在最優(yōu)條件下所制備出的納米顆粒相對(duì)于芹菜素原料藥在官能團(tuán)及化學(xué)結(jié)構(gòu)上未發(fā)生改變。

2.9 液相質(zhì)譜分析（MS）

采用直接進(jìn)樣-負(fù)模式對(duì)顆粒進(jìn)行液相質(zhì)譜分析(圖15)。芹菜素相對(duì)分子質(zhì)量為270.24 g/mol，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果顯示，芹菜素原料藥的相對(duì)分子質(zhì)量為269.92，所制備的芹菜素納米顆粒及芹菜素/γ-環(huán)糊精納米顆粒的相對(duì)分子質(zhì)量分別為269.95 和269.94。產(chǎn)物與芹菜素原料的相對(duì)分子質(zhì)量基本沒(méi)有變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。

圖11 γ-環(huán)糊精對(duì)所制備納米顆粒穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effects of γ-cyclooctapentylose on stability of nanoparticles

圖12 芹菜素原料藥與制備的納米顆粒紅外分析對(duì)比圖Fig.12 FTIR spectra of the raw materials and apigenin nanoparticles

2.10 比表面積分析（BET）

圖13 芹菜素原料藥與制備的納米顆粒XRD譜圖Fig.13 XRD patterns of raw materials and apigenin nanoparticles

圖14 芹菜素原料藥與制備的納米顆粒紫外可見(jiàn)吸收光譜對(duì)比圖Fig.14 UV-Vis spectra of raw materials and apigenin nanoparticles

圖15 芹菜素原料藥與制備的納米顆粒質(zhì)譜對(duì)比圖Fig.15 Mass spectra of raw and apigenin nanoparticles

本實(shí)驗(yàn)所制備出的芹菜素納米分散體相比于芹菜素原料藥，在顆粒尺寸上有了顯著減小，通過(guò)對(duì)比芹菜素原料藥SEM 圖[圖1(b)]和較優(yōu)條件下制備出的芹菜素納米顆粒掃描電鏡圖[圖10(d)]可以明顯觀(guān)察出此項(xiàng)結(jié)論。而納米級(jí)的藥物有一個(gè)顯著的特點(diǎn)就是能夠通過(guò)減小粒徑而增加藥物的比表面積，下面將通過(guò)測(cè)試驗(yàn)證顆粒比表面積的變化。經(jīng)測(cè)試，γ-環(huán)糊精包裹的芹菜素納米顆粒比表面積為25.281 m2/g，而芹菜素原料藥的比表面積為12.123 m2/g。 根 據(jù)Noyes-Whitney 方 程dC/dt =kDA(Cs-Ct)，隨著粒子比表面積的增大，將進(jìn)一步增大溶解速率[38]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造粒所得顆粒的有效粒子表面積A 擴(kuò)大二倍，在溶解速度常數(shù)kD、藥物飽和溶解度Cs和藥物濃度Ct一致的前提下，溶解速度dC/dt 也將提升一倍。故使用該方法得到的芹菜素納米顆粒相比于原料藥，將具有較高溶解度和溶解速率，從而提高了芹菜素的生物利用度。

3 結(jié) 論

(1)較優(yōu)造粒條件如下：反溶劑使用0℃去離子水，160℃亞臨界水作為溶劑，反應(yīng)壓力為5 MPa，表面活性劑選擇濃度為5%(質(zhì)量)的γ-環(huán)糊精。

(2)FTIR、XRD、UV、MS 圖譜分析和SEM 觀(guān)測(cè)結(jié)果都表明在較優(yōu)造粒條件下，制備出的顆粒粒徑分布在20～30 nm 范圍內(nèi)，分散均勻，呈現(xiàn)非晶態(tài)。相比于原料藥，其具有較大的比表面積，可穩(wěn)定保存，且化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)未發(fā)生改變。

(3)降低反溶劑溫度、在一定范圍內(nèi)提高亞臨界水溫度、添加適當(dāng)濃度的γ-環(huán)糊精，均可優(yōu)化造粒結(jié)果。

(4)根據(jù)Noyes-Whitney 方程，由于造粒得到的納米顆粒比芹菜素原料藥具有更大的比表面積，因此通過(guò)預(yù)測(cè)得出：通過(guò)本方法制備的芹菜素納米顆粒相比于原料藥具有更高的溶解速率，提升了芹菜素的生物利用度。

(5)如引言中所述，目前仍無(wú)人使用亞臨界水法制備超細(xì)芹菜素納米顆粒。本文提出的方法能夠通過(guò)瞬間冷凍的方式縮短藥物結(jié)晶時(shí)間，有利于保持顆粒的原始形貌。與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相比，本方法進(jìn)一步降低了芹菜素納米顆粒尺寸，且通過(guò)添加穩(wěn)定劑極大地提高了芹菜素納米分散體的穩(wěn)定性，同時(shí)實(shí)驗(yàn)全過(guò)程無(wú)有機(jī)溶劑參與。因此本研究為納米芹菜素顆粒的制備提供了一種全新的綠色、無(wú)污染的有效造粒途徑。