豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究進(jìn)展

宋淑英++張澤輝++王莊++徐煒++閆明

摘要：對豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行了綜述，進(jìn)一步弄清了豬瘟病毒的結(jié)構(gòu)，為豬瘟病毒的研究提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：豬；豬瘟病毒；研究進(jìn)展

中圖分類號：S852.65+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2015）12-0007-03

豬瘟由豬瘟病毒（classical swine fever virus， CSFV）引起，是在豬間流行的一種重要傳染病?；钾i會出現(xiàn)運(yùn)動失調(diào)、后肢無力、高熱、皮膚出現(xiàn)出血點(diǎn)或出血斑等癥狀[1]。該病致死率高且難以清除，隱性感染或治愈豬通常會成為潛在感染源。在被感染豬的多個器官，如扁桃體、皮膚、淋巴、脾臟等，都能夠檢測出豬瘟病毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年因豬瘟而造成的損失高達(dá)100億元以上[2]。

豬瘟造成的危害巨大，而其病原致病性，主要是通過病毒基因組RNA所編碼的蛋白實(shí)現(xiàn)的。研究表明，CSFV的基因組RNA主要由3部分組成，分別為3′非編碼區(qū)（3′-untranslated region， 3′UTR）、5′非編碼區(qū)（5′-untranslated region， 5′UTR）以及一個較大的開放閱讀框（ORF）[3]。在ORF編碼產(chǎn)生的蛋白中，結(jié)構(gòu)蛋白與病毒致病、免疫，以及防控疫苗研制等方面關(guān)系最為密切。本對CSFV結(jié)構(gòu)蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹，為探明病毒致病機(jī)理，更好防控豬瘟提供理論依據(jù)。

1 ORF

CSFV的ORF位于病毒的5′UTR與3′UTR之間。病毒基因組RNA全長約為12.3 kB，其大部分為ORF。該ORF編碼一個由3 898個氨基酸所構(gòu)成的多聚蛋白（polyprotein，PPro）。該蛋白能夠被宿主細(xì)胞的信號肽酶及病毒自身合成的蛋白酶所識別、加工[4]，進(jìn)而被分解為12種蛋白質(zhì)。按照編碼各種蛋白質(zhì)基因的順序，12種蛋白分別為Npro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B。其中C、Erns、E1及E2為病毒結(jié)構(gòu)蛋白[5]，其余8種為非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白共同作用，參與病毒復(fù)制、傳播等過程。

2 CSFV結(jié)構(gòu)蛋白

2.1 C蛋白

CSFV C蛋白，也稱核衣殼蛋白C。編碼該蛋白的基因大小為192 bp，是由PPro經(jīng)宿主細(xì)胞中的信號肽酶加工而成。構(gòu)成該蛋白的氨基酸具有較強(qiáng)的親水性。序列分析發(fā)現(xiàn)，組成該蛋白的多為帶正電荷的精氨酸及賴氨酸殘基，推測可能與基因組RNA結(jié)合作用有關(guān)[6]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，C蛋白在黃病毒科中的丙型肝炎病毒中，具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用。C蛋白能夠有效的抑制基因組中核糖體結(jié)合位點(diǎn)的活性，使病毒的復(fù)制、翻譯過程受到抑制，降低病毒的增殖效率，呈現(xiàn)持續(xù)感染的狀態(tài)。但C蛋白在CSFV中是否存在同樣功能尚不清楚。

2.2 Erns

Erns蛋白存在于PPro的268～494位，由227個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為44～48 kDa之間。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有9個潛在的糖基化位點(diǎn)，在病毒粒子中，通常以同源二聚體的形成存在[7]，二聚體分子量約為100 kDa。被感染的細(xì)胞能夠分泌大量的Erns蛋白。

對Erns功能研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白除是一種囊膜蛋白外，同時具有核糖核酸酶活性，對尿嘧啶具有較高專一性。在pH 6.0～6.5時活性最高，Mn2+與Zn2+為酶活性強(qiáng)抑制劑，Ca2+與Mg2+對其抑制作用較弱。該蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性，50～60 ℃時活性最強(qiáng)，在65 ℃時仍能夠保持75%的酶活性，而在37 ℃時的活性能夠保持在86%左右[8]。

Erns具有免疫抑制活性，同時具有一定神經(jīng)毒性及抗蠕蟲能力。蛋白的297位及346位氨基酸為酶活性必需氨基酸，該位點(diǎn)氨基酸發(fā)生突變后，Erns將失去核糖核酸酶活性，但仍能與相應(yīng)抗體結(jié)合。研究表明，Erns的核糖核酸酶活性在CSFV復(fù)制過程中具有重要作用，與自然宿主長期帶毒及隱性感染有關(guān)。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Erns對不同種屬的淋巴細(xì)胞蛋白合成均有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是對人、豬、羊和牛的淋巴細(xì)胞增殖，能夠完全抑制其增殖[9]。在Erns蛋白346位的組氨酸對CSFV的致病性具有決定性作用，當(dāng)該位點(diǎn)發(fā)生氨基酸突變時，病毒的致病力將完全消失，突變病毒雖能夠在細(xì)胞中穩(wěn)定傳代，但產(chǎn)毒量顯著降低。在病毒侵入細(xì)胞的過程中，Erns也發(fā)揮了重要作用。研究表明，Erns蛋白能夠與位于細(xì)胞表面的膜蛋白相互作用。在豬腎細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CSFV與腎細(xì)胞結(jié)合是通過Erns蛋白與細(xì)胞表面中的硫酸乙酰肝素相互作用而實(shí)現(xiàn)的[10]。

Erns蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生對CSFV的免疫能力。由于編碼Erns蛋白的核苷酸序列保守性相對較高，因此Erns可作為免疫防控豬瘟的靶蛋白。Erns的抗原決定簇可分為3個區(qū)域，AR1，AR2及AR3。3個區(qū)域單獨(dú)或共同都可以與感染CSFV的血清發(fā)生反應(yīng)。對Erns蛋白高級結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，與其他核糖核酸酶不同，Erns具有一個C-端延伸區(qū)域、一個截短的N-端以及一個大的富含半胱氨酸的插入?yún)^(qū)域。其中C-端延伸區(qū)域和蛋白的跨膜定位有關(guān)[11]。

2.3 E1

E1蛋白是CSFV的囊膜糖蛋白，位于PPro的495～689位氨基酸之間，由195個氨基酸殘基構(gòu)成，蛋白骨架的分子量約為21.8 kDa。有3個潛在的N-糖基化位點(diǎn)。E1蛋白是由糖基化酶、宿主細(xì)胞的信號肽酶及蛋白水解酶共同加工、成熟的。E1和E2蛋白可以通過二硫鍵構(gòu)成異源的二聚體。E1存在于病毒囊膜內(nèi)，無法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CSFV中和抗體[5]。

2.4 E2

E2蛋白同樣為病毒的囊膜糖蛋白，但與E1蛋白不同，E2是CSFV的主要保護(hù)性抗原蛋白。該蛋白由370個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約為41.5 kDa。蛋白位于PPro的690～1 060位氨基酸，存在5個潛在糖基化位點(diǎn)，每個位點(diǎn)都可以與分子量為2 kDu～3 kDa的低聚糖結(jié)合[12]。在蛋白N-端存在4個主要抗原位點(diǎn)，其上游為一段信號肽序列，C-端為一個由18個氨基酸組成的疏水側(cè)鏈而構(gòu)成的跨膜蛋白。E2蛋白同E1蛋白一樣，通常以二聚體形式存在于CSFV感染的細(xì)胞表面及病毒粒子內(nèi)。

E2蛋白含有刺激產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原決定簇，可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對CSFV的中和抗體。研究發(fā)現(xiàn)，E2蛋白抗原區(qū)域均存在于蛋白的N-端和690～866位氨基酸殘基區(qū)間，共包括4個部分，即A、B、C和D。而蛋白的其他區(qū)域不參與形成抗原表位構(gòu)象。A區(qū)又可以分為3個亞區(qū)，A1，A2和A3。在這些區(qū)域中，A1，A2保守性較高，B、C、D及A3容易發(fā)生變異。A1，B和C區(qū)為中和性抗原表位。另外，在E2蛋白的羧基端995～998位處，是一個以YYEP為核心序列的線性表位，該表位在整個瘟病毒屬中具有較高的同源性，為瘟病毒屬所共有的抗原表位。保護(hù)性試驗(yàn)表明，由A，B，C，D 4個抗原區(qū)域中任一區(qū)域誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，都能夠使豬獲得對CSFV強(qiáng)毒株的免疫能力[13]。

位于E2蛋白829～837位的氨基酸序列在CSFV中具有較高的保守性，而與瘟病毒屬中的其他病毒差異性則較大。因此可根據(jù)該段序列設(shè)計(jì)針對性的診斷及免疫試劑。而位于E2 N-端690～812位的123個氨基酸殘基中，推測含有與IgG結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域與其他瘟病毒無交叉反應(yīng)[14]，可用于CSFV血清學(xué)檢測。

在E2蛋白中共有15個半胱氨酸，其中位于蛋白N-端的6個半胱氨酸在蛋白形成正確折疊構(gòu)象中起重要作用。位于695和737位的半胱氨酸是B及C區(qū)與單抗結(jié)合的必需基團(tuán)，而位于792、818及856位的半胱氨酸與A區(qū)及D區(qū)的抗體結(jié)合有關(guān)。因此推測，可將E2蛋白的抗原性分為兩個相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單元，一個由B區(qū)和C區(qū)構(gòu)成的保守性相對較低的單元，另一個由A區(qū)和D區(qū)構(gòu)成的高度保守單元。其中B區(qū)與C區(qū)通過2個靠近N-端的半胱氨酸形成的二硫鍵連接，A區(qū)與D區(qū)則通過其他3個半胱氨酸形成的2對二硫鍵連接[15]。

E2蛋白與CSFV對宿主細(xì)胞的識別與吸附能力有關(guān)，能夠決定病毒對細(xì)胞的感染傾向性。研究發(fā)現(xiàn)，E2蛋白能夠與宿主細(xì)胞膜中的低密度脂蛋白受體結(jié)合。而對病毒結(jié)構(gòu)蛋白E1、E2和Erns研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)只存在E1和E2蛋白時，病毒就可以感染細(xì)胞，Erns為病毒感染的非必需蛋白。在結(jié)構(gòu)蛋白中E2蛋白比較容易發(fā)生變異，而E2功能又與病毒感染以及抗體生成有關(guān)，因此E2的變異性，能夠使CSFV對環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，同時又能使免疫疫苗失效[11～13]。

3 展望

豬瘟病毒對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大威脅，但其具體的致病機(jī)制仍不明確。目前，疫苗免疫仍是防控豬瘟最有效的方式之一。而隨著對病毒基因組RNA及相關(guān)蛋白研究的不斷深入，使探明病毒致病機(jī)制、有效防控豬瘟成為可能。在CSFV結(jié)構(gòu)蛋白中，E2蛋白由于與免疫應(yīng)答有關(guān)，對其結(jié)構(gòu)及功能的研究比較深入。同時，隨著對病毒其他結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能的不斷研究，防控豬瘟的思路和方法也將逐漸拓寬。

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