丁苯酞改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及其對海馬區(qū)GAP-43和突觸素表達(dá)的影響

陳慶友　師　巖　王中華

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江　齊齊哈爾　161000)

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丁苯酞改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及其對海馬區(qū)GAP-43和突觸素表達(dá)的影響

陳慶友師巖1王中華2

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾161000)

〔摘要〕目的探討丁苯酞對血管性癡呆(VD)大鼠認(rèn)知功能及對海馬區(qū)GAP-43和突觸素P38表達(dá)的影響。方法選取雄性Wistar大鼠90只，隨機(jī)分為觀察組、對照組、空白組各30只?？瞻捉M不采取任何操作；對照組大鼠制成VD模型，并予以生理鹽水；觀察組大鼠制成VD模型后，予以丁苯肽注射液。治療1個月后，采取MG-Y-型迷宮檢測其認(rèn)知功能以及采用Western印跡和RT-PCR分別檢測大鼠海馬區(qū)內(nèi)GAP-43和突觸素P38的表達(dá)。結(jié)果觀察組和空白組大鼠的錯誤反應(yīng)次數(shù)均明顯低于對照組(P均<0.05)，且空白組大鼠降低更明顯(P<0.05)。對照組和觀察組的GAP-43在大鼠海馬區(qū)內(nèi)的mRNA中表達(dá)較空白組高(P均<0.05)，且觀察組表達(dá)程度較對照組更高(P<0.05)；觀察組的突觸素P38在大鼠海馬區(qū)內(nèi)的mRNA中表達(dá)較空白組和對照組均提高(P均<0.05)，而對照組和空白組之間表達(dá)無差異(P>0.05)；觀察組GAP-43在大鼠海馬區(qū)內(nèi)的蛋白中表達(dá)較對照組和空白組均提高(P均<0.05)，對照組和空白組之間表達(dá)無差異(P>0.05)；對照組和觀察組的突觸素P38在大鼠海馬區(qū)內(nèi)的蛋白中表達(dá)較空白組均提高(P均<0.05)，且觀察組表達(dá)程度較對照組更高(P<0.05)。結(jié)論對于VD大鼠，可予以丁苯酞注射液治療，其可促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)及再生，改善VD大鼠海馬區(qū)GAP-43及突觸素P38的表達(dá)，從而提供其認(rèn)知功能，改善其預(yù)后。

〔關(guān)鍵詞〕丁苯酞；血管性癡呆；認(rèn)知功能；GAP-43；突觸素P38

血管性癡呆(VD)的發(fā)病率近年來持續(xù)上升，現(xiàn)已成為中老年人常見病之一，在我國其患病率已達(dá)2.1%～3.5%〔1，2〕。而目前針對VD的治療方法主要是通過促進(jìn)腦部微循環(huán)，改善血液灌注等對癥治療。丁苯酞注射液可以改善腦卒中患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及腦能量代謝和腦缺血區(qū)的微循環(huán)。但關(guān)于丁苯酞注射液是否可以改善VD患者癥狀的報道仍不多。本研究旨在探討丁苯酞對VD大鼠認(rèn)知功能及對海馬區(qū)GAP-43和突觸素P38表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1動物及分組普通級健康成年雄性SD大鼠90只(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，平均體重為(300.2±50.2)g，平均鼠齡(14.32±2.57)w。大鼠分籠飼養(yǎng)，正常光照，自由飲水和攝食，溫度22℃，相對濕度50%～70%。將其隨機(jī)分為觀察組、對照組、空白組各30只?？瞻捉M不采取任何操作；對照組大鼠制成VD模型，并予以生理鹽水；觀察組大鼠制成VD模型后，予以丁苯酞注射液。

1.2試劑和儀器丁苯酞注射液(國藥準(zhǔn)字 p0100041，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司)，2次/d，150 ml/次，每次靜注不少于1 h，兩次用藥時間間隔≥6 h，且只能使用PE輸液器；GAP-43多克隆抗體(規(guī)格：0.2 ml，濃度1 mg/ml，上海安研生物有限公司)；突觸素P38多克隆抗體(規(guī)格：0.2 ml，濃度1 mg/ml，上海華研生物有限公司)，SDS-PAGE試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)，Trizol 試劑盒(西安融智生物技術(shù)有限公司)、引物(上海喬羽生物科技有限公司)，MG-Y-型迷宮試驗裝置(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.3制備VD模型本研究通過結(jié)扎頸總動脈的方法來制作VD大鼠模型。具體操作方法為：觀察組大鼠于術(shù)前6～8 h禁食水，首先麻醉SD大鼠，向大鼠腹腔內(nèi)按照400 mg/kg的劑量注射10%水合氯醛。待麻醉成功后，用大頭針固定大鼠的四肢，使其成仰臥位。去除大鼠頸部的毛發(fā)，向上至下頜部，向下至鎖骨，兩側(cè)至胸鎖乳突肌外援2 cm處。先用碘伏消毒，其消毒范圍大于去毛范圍，而后用酒精擦拭干凈。沿氣管中線切約5 cm的切口，依次分離皮膚、軟組織、肌肉直至顯露兩側(cè)頸總動脈。分離過程中應(yīng)小心操作，小心誤傷迷走神經(jīng)，用4-0 Dexon線分別結(jié)扎兩側(cè)頸總動脈的近心端及遠(yuǎn)心端，于其二者中間剪斷頸總動脈。逐層縫合，于皮膚傷口縫合處予以紅霉素預(yù)防感染。待大鼠狀態(tài)穩(wěn)定，清醒后活動無異常，將其送回至籠中。術(shù)后30 d即制成VD模型。對照組大鼠手術(shù)方法與觀察組一致，區(qū)別為其只分離兩側(cè)頸總動脈。在制模的1個月內(nèi)，三組大鼠所飼養(yǎng)的環(huán)境以及喂養(yǎng)食物均一致。經(jīng)過1個月制備成模后，對照組大鼠予以注射生理鹽水，觀察組大鼠予以注射丁苯酚注射液，空白組大鼠不進(jìn)行任何操作，按此方法治療1個月。

1.4采用MG-Y-型迷宮檢測認(rèn)知功能在經(jīng)過1個月的藥物治療后，采用MG-Y-型迷宮來檢測各組大鼠之間認(rèn)知功能的差別。MG-Y-型迷宮是由3條等長的臂組成的三等分輻射式迷路箱及控制儀組成，當(dāng)按下控制儀的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ按鈕時，相應(yīng)的Ⅰ臂、Ⅱ臂、Ⅲ臂信號燈亮，對應(yīng)的亮燈的臂即為安全區(qū)，沒有亮的臂以及交界處均為危險區(qū)〔3〕，在試驗中大鼠若在受到刺激后，一次性的跳躍至安全區(qū)的范圍，即記為一次正確反應(yīng)，若大鼠未跳躍或者跳躍至危險區(qū)，則為錯誤反應(yīng)。大鼠達(dá)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)10次刺激中，大鼠有至少9次以上表現(xiàn)為正確反應(yīng)。EN值即為大鼠達(dá)到達(dá)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)之前的刺激次數(shù)。對于達(dá)標(biāo)的大鼠，送其回籠休息18 h，而后記錄大鼠刺激10次中的正確反應(yīng)次數(shù)，此值記為CN值。EN值一般代表大鼠的學(xué)習(xí)能力，而CN值代表大鼠的記憶能力，二者結(jié)合則體現(xiàn)大鼠的認(rèn)知功能。所有入組的大鼠均由同一醫(yī)師在相同條件下進(jìn)行檢測。

1.5采集標(biāo)本及觀察指標(biāo)的測量

1.5.1 采集標(biāo)本在3組大鼠進(jìn)行MG-Y-型迷宮后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，取出腦部組織，置于冰上，將海馬組織分離出來，保存于-196℃的液氮中。分別檢測三組大鼠海馬組織內(nèi)mRNA和蛋白中的GAP-43、突觸素P38的含量，并加以比較。

1.5.2海馬組織內(nèi)mRNA中的GAP-43，突觸素P38的檢測采用Trizol試劑盒提取3組大鼠海馬組織的總RNA，用RT-PCR的方法來測量其內(nèi)的GAP-43、突觸素P38的含量。設(shè)計的引物為：GAP-43：正義：5′AGGGAGATGGCTCTGCTAC 3′，反義：5′GAGACAGGGTTCAGGTGGG 3′，產(chǎn)物463 bp；突觸素P38：正義：5′CAGCCGTGTTCGCTTTCA 3′，反義：5′TGCCCAGCCTGTCTCCTT 3′，產(chǎn)物為250 bp。RT-PCR的反應(yīng)條件：98℃ 3 min，其之后的40個循環(huán)在98℃ 1 min，60℃ 1 min，75℃ 1.5 min的反應(yīng)條件下進(jìn)行，最后在75℃的條件下延伸10 min。記錄各產(chǎn)物的溶解時間，最后在PCR儀上繪制其溶解曲線。電泳后，測量GAP-43，突觸素P38與β-actin的相對灰度比值。

1.5.3海馬組織內(nèi)蛋白中的GAP-43，突觸素P38的檢測液氮中將保存的海馬組織在4℃10 000 r/min離心10 min，取其上層清液，按照SDS-PAGE試劑盒的說明書進(jìn)行分離操作，按照說明書標(biāo)配的濃度進(jìn)行凝膠的配置，用SDS-PAGE上樣緩沖液沸水浴加熱4 min后冷卻至室溫，而后進(jìn)行電泳電壓設(shè)置為100 V，時間設(shè)定為100 min。將轉(zhuǎn)膜槽放置在冰水浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后放置到預(yù)先備好的Western洗滌液中封閉，經(jīng)過抗體孵育后，測定Western印跡蛋白條帶積分光密度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS15.0軟件行單因素方差分析和SNK法。

2結(jié)果

2.1三組大鼠認(rèn)知功能的對比三組大鼠經(jīng)過MGY-型迷宮測試后，觀察組和空白組大鼠的錯誤反應(yīng)次數(shù)〔(62.70±4.81)次，(49.50±5.19)次〕均明顯低于對照組〔(81.86±5.15)次〕(P均<0.05)，且空白組大鼠降低更明顯(P<0.05)；觀察組和空白組大鼠的正確反應(yīng)次數(shù)〔(7.30±1.87)次，(8.30±1.41)次〕均明顯高于對照組〔(5.19±1.32)次〕(均P<0.05)。

2.2三組大鼠海馬組織GAP-43、突觸素P38 mRNA表達(dá)對照組和觀察組的GAP-43在大鼠海馬區(qū)內(nèi)的mRNA中表達(dá)(1.11±0.04，1.57±0.03)較空白組(0.61±0.07)高(均P<0.05)，且觀察組表達(dá)程度較對照組更高(P<0.05)；觀察組的突觸素P38在大鼠海馬區(qū)內(nèi)的mRNA中表達(dá)(1.91±0.02)較空白組(0.64±0.04)和對照組(0.87±0.06)均提高(均P<0.05)，而對照組和空白組之間表達(dá)無差異(P>0.05)。

2.3三組大鼠海馬組織GAP-43，突觸素P38蛋白表達(dá)觀察組GAP-43在大鼠海馬區(qū)內(nèi)的蛋白中表達(dá)(2.61±1.24)較對照組(2.19±1.05)和空白組(2.18±1.15)均提高(P均<0.05)，對照組和空白組之間表達(dá)無差異(P>0.05)。對照組和觀察組的突觸素P38在大鼠海馬區(qū)內(nèi)的蛋白中表達(dá)(2.32±1.13，2.57±1.31)較空白組(2.70±1.14)均提高(P均<0.05)，且觀察組表達(dá)程度較對照組更高(P<0.05)。

3討論

VD多產(chǎn)生于腦卒中患者，這是由于其長期缺氧導(dǎo)致腦部血流灌溉不足，生成氧自由基及乳酸等物質(zhì)，導(dǎo)致患者腦部神經(jīng)元細(xì)胞被破壞，逐漸出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降，最終出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，給家庭及社會帶來嚴(yán)重困擾〔4〕。本研究結(jié)果說明經(jīng)過丁苯酚注射液治療的VD大鼠，其學(xué)習(xí)能力以及記憶能力得到提高，即其認(rèn)知功能得到修復(fù)。

GAP-43是一種促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)與合成的軸突膜蛋白，曾作為首選的分子探針廣泛用于神經(jīng)元細(xì)胞修復(fù)等方面的研究。曾有研究報道，在損傷的神經(jīng)元進(jìn)行修復(fù)的過程中，GAP-43的表達(dá)增強(qiáng)，合成速度加快，并且隨著GAP-43含量的增高，可促進(jìn)神經(jīng)元軸突的延伸〔5〕。GAP-43還可以作為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)介質(zhì)，增強(qiáng)其與G蛋白耦聯(lián)的受體轉(zhuǎn)運(yùn)作用〔6〕。這就說明神經(jīng)系統(tǒng)損傷之后的修復(fù)再生過程中，GAP-43扮演了重要角色〔7〕。本研究結(jié)果說明VD大鼠在經(jīng)過丁苯酚注射液的治療后，其GAP-43在大鼠海馬組織內(nèi)mRNA及蛋白表達(dá)均有所提高，從而促進(jìn)VD大鼠損傷的神經(jīng)元細(xì)胞再生修復(fù)，緩解其腦部缺氧狀態(tài)，改善不良癥狀。突觸素P38與GAP-43類似，對于神經(jīng)元的損傷修復(fù)、生長發(fā)育也有一定的作用。它是一種鈣結(jié)合糖蛋白，其不僅可以促進(jìn)神經(jīng)元的損傷修復(fù)，還可以加快突觸之間的傳遞速度，從而進(jìn)一步加快神經(jīng)元的生長發(fā)育〔8〕。本研究結(jié)果表明，丁苯酚注射液可提高突觸素P38在大鼠海馬組織內(nèi)mRNA和蛋白中的含量，從而促進(jìn)神經(jīng)元損傷修復(fù)，加快神經(jīng)傳遞的速度，改善大鼠認(rèn)知功能。

綜上所述，對于VD大鼠，可予以丁苯酞注射液治療，其可促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)及再生，改善VD大鼠海馬區(qū)GAP-43及突觸素P38的表達(dá)，從而提供其認(rèn)知功能，改善其預(yù)后。

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〔2015-08-13修回〕

(編輯李相軍)

〔中圖分類號〕R741

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1830-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.017

基金項目：黑龍江衛(wèi)生廳科研基金資助項目(項目編號：HD2014015)

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科

第一作者：陳慶友(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病的診斷及治療研究。