髓核細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)的研究進(jìn)展

薛鵬舉敖 俊* 趙利濤郭明柯呂海文姬文慧黃歡歡秦耀宗張偉鋒周衛(wèi)敏

（1 河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471000；2 遵義醫(yī)學(xué)院脊柱外科，貴州 遵義 563003）

髓核細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)的研究進(jìn)展

薛鵬舉1敖 俊2* 趙利濤1郭明柯1呂海文1姬文慧1黃歡歡1秦耀宗1張偉鋒1周衛(wèi)敏1

（1 河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471000；2 遵義醫(yī)學(xué)院脊柱外科，貴州 遵義 563003）

討論開(kāi)展髓核細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)相關(guān)研究現(xiàn)狀進(jìn)展。通過(guò)對(duì)種子細(xì)胞、共培養(yǎng)方式、生長(zhǎng)因子等方面國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行討論。通過(guò)椎間盤(pán)組織細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)增加細(xì)胞數(shù)量或誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為髓核細(xì)胞可能是一種增加椎間盤(pán)細(xì)胞較為適當(dāng)?shù)姆椒āＭㄟ^(guò)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)可能分泌延緩?fù)诵行宰冊(cè)诮M織細(xì)胞中發(fā)生發(fā)展提供新的途徑，也是目前研究的熱點(diǎn)?；A(chǔ)研究及臨床應(yīng)用有著廣闊科研前景。

干細(xì)胞；共培養(yǎng)；椎間盤(pán)組織工程學(xué)；髓核細(xì)胞

椎間盤(pán)退行性變常是的下腰痛病因，患者生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響，甚至有一定的致殘率。近年來(lái)椎間盤(pán)退行性變的發(fā)病率呈逐漸上升。從病理學(xué)上觀察，由于髓核細(xì)胞合成分泌Ⅱ型膠原蛋白的能力出現(xiàn)下降，使細(xì)胞外膠原蛋白種類(lèi)成分改變，將導(dǎo)致椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)的變化和功能的減退[1]。若從改善髓核細(xì)胞功能入手，使髓核的再生或減慢老化。就現(xiàn)有治療而言，臥床休息與牽引治療只能夠暫時(shí)性的緩解患者的疼痛等臨床癥狀，無(wú)法延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)退變的發(fā)展。而各種手術(shù)雖去除了發(fā)生退變的椎間盤(pán)，但易產(chǎn)生術(shù)后腰椎不穩(wěn)，椎弓根釘棒系統(tǒng)內(nèi)固定使局部脊柱活動(dòng)度下降，臨近椎間盤(pán)負(fù)荷過(guò)多，導(dǎo)致臨近椎體出現(xiàn)退變過(guò)早發(fā)生。椎體間植骨融合不僅治療費(fèi)用昂貴，且存在植骨不愈合可能。安裝非融合內(nèi)固定，以盡量恢復(fù)原有關(guān)節(jié)活動(dòng)度，亦存在內(nèi)固定物松動(dòng)、脫落等風(fēng)險(xiǎn)。因此，治療椎間盤(pán)退行性變的關(guān)鍵應(yīng)該在椎間盤(pán)的退變的病理組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的改變，恢復(fù)椎間盤(pán)原有結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與主要功能?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外主要的研究集中在采用組織工程學(xué)技術(shù)和方法直接修復(fù)退變的椎間盤(pán)髓核組織，從而使椎間盤(pán)組織結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。具體就是促進(jìn)椎間盤(pán)細(xì)胞分泌正常的椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)，改善椎間盤(pán)細(xì)胞生存的微環(huán)境，并且通過(guò)抑制用于分解代謝過(guò)程的相關(guān)酶及炎性介質(zhì)，促進(jìn)其恢復(fù)正常功能與結(jié)構(gòu)。由于髓核組織體積較小，易造成組織分離提取困難，即便培養(yǎng)出的髓核細(xì)胞，其數(shù)量及擴(kuò)增亦較為困難，且其形態(tài)易出現(xiàn)老化[2-3]。通過(guò)椎間盤(pán)組織細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)增加細(xì)胞數(shù)量或誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為髓核細(xì)胞可能是一種增加椎間盤(pán)細(xì)胞較為適當(dāng)?shù)姆椒?。通過(guò)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)可能分泌延緩?fù)诵行宰冊(cè)诮M織細(xì)胞中發(fā)生發(fā)展提供新的途徑，也是目前研究的熱點(diǎn)。本文就人髓核細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)方面進(jìn)行研究現(xiàn)狀的討論。

1 種子細(xì)胞

1.1 椎間盤(pán)細(xì)胞：正常人類(lèi)的髓核組織，在兒童時(shí)期存在脊索細(xì)胞和髓核細(xì)胞兩種細(xì)胞，但隨著年齡的增長(zhǎng)脊索細(xì)胞持續(xù)減少，大約超過(guò)10歲后絕大部分被髓核細(xì)胞所取代[4-7]。大部分關(guān)于脊索細(xì)胞的研究多見(jiàn)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，而對(duì)人類(lèi)椎間盤(pán)髓核組織的研究而言，髓核細(xì)胞的研究明顯較脊索細(xì)胞更具有實(shí)際意義。許多需要行手術(shù)切除髓核組織的患者，以成年人多見(jiàn)。但人類(lèi)髓核細(xì)胞體外增殖的能力弱，同時(shí)體外培養(yǎng)條件較為嚴(yán)格。而成人椎間盤(pán)組織內(nèi)含有的髓核細(xì)胞數(shù)量少，且容易老化。人髓核細(xì)胞來(lái)源亦成為，現(xiàn)有學(xué)者以先天性脊柱側(cè)彎患者所行的矯形手術(shù)中獲得切除的椎間盤(pán)髓核組織為研究來(lái)源，但先天性脊柱側(cè)彎疾病發(fā)病率相對(duì)其他病種低，病源有限。亦有學(xué)者通過(guò)對(duì)椎間盤(pán)突出患者所行的椎間盤(pán)髓核摘除術(shù)中獲得髓核組織，但此類(lèi)患者的椎間盤(pán)已發(fā)生退行性變，患者年齡往往偏大，所獲得的髓核細(xì)胞增殖能力及合成蛋白的功能不能肯定，將此作為種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程學(xué)研究或臨床治療可能并不恰當(dāng)。筆者臨床工作中發(fā)現(xiàn)許多人頸椎骨折患者需要行前路手術(shù)摘除髓核組織，而摘除后的髓核組織，最終被手術(shù)人員丟棄，通過(guò)對(duì)人頸椎骨折患者術(shù)中摘除的髓核組織研究發(fā)現(xiàn)其可以培養(yǎng)出髓核細(xì)胞，而此類(lèi)患者具有年齡較小，患病人數(shù)高且穩(wěn)定，取材簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。因此現(xiàn)階段開(kāi)展髓核細(xì)胞相關(guān)研究，應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)靥攸c(diǎn)，選擇適宜髓核細(xì)胞的來(lái)源。髓核細(xì)胞一直缺乏統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)階段對(duì)髓核細(xì)胞的研究多采用Ⅱ型膠原蛋白免疫組化方法結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行鑒定。鑒于流式細(xì)胞技術(shù)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究的廣泛，有學(xué)者探索使用熒光抗體結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)志物來(lái)鑒定細(xì)胞。但目前研究發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞缺乏高度表達(dá)且特異性高細(xì)胞表面標(biāo)志物，使得流式細(xì)胞技術(shù)鑒定髓核細(xì)胞仍處于實(shí)驗(yàn)階段，而髓核細(xì)胞新的鑒定技術(shù)本身就是正在處于研究的課題。

1.2 干細(xì)胞：干細(xì)胞具有分化為臨近組織內(nèi)其他細(xì)胞的能力，這可能是受損組織能進(jìn)行自我修復(fù)的原因。這就為老化受損的椎間盤(pán)提供了一種新的修復(fù)可能，也為稀缺的髓核細(xì)胞提供了新的擴(kuò)增方法。但最為原始干細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞，盡管理論上分化潛能最強(qiáng)，但受倫理學(xué)及相關(guān)法律文件限制，只能在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)進(jìn)行，所取得的成果一般無(wú)法同樣在人細(xì)胞相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用。選擇倫理學(xué)爭(zhēng)議較少的干細(xì)胞進(jìn)行研究，用于椎間盤(pán)髓核細(xì)胞組織工程學(xué)相關(guān)研究是需要開(kāi)展的研究領(lǐng)域?，F(xiàn)階段間充質(zhì)干細(xì)胞常見(jiàn)于文獻(xiàn)報(bào)道，但間充質(zhì)干細(xì)胞種類(lèi)繁多，需要大量實(shí)驗(yàn)開(kāi)展以選則合適的干細(xì)胞用于髓核細(xì)胞相關(guān)研究?，F(xiàn)階段對(duì)骨髓、脂肪以及臍帶等易獲組織來(lái)源進(jìn)行提取，不僅是間充質(zhì)干細(xì)胞易于培養(yǎng)，其分化誘導(dǎo)能力已經(jīng)逐漸被研究人員所證實(shí)。而最近人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞因其較其他細(xì)胞分類(lèi)上更為原始，而因其科研工作者的重視。而現(xiàn)在此細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)已較為成熟。從現(xiàn)有文獻(xiàn)來(lái)看，臍帶血源性間充質(zhì)干細(xì)胞可以被分化為內(nèi)、外及中胚層的部分細(xì)胞[8]。而人髓核細(xì)胞系從內(nèi)胚層分化而來(lái)。諸如脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及干細(xì)胞可以由此種干細(xì)胞誘導(dǎo)出來(lái)。而肝臟細(xì)胞屬于內(nèi)胚層分化細(xì)胞，若能存在被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞，將更有可能被誘導(dǎo)分化為椎間盤(pán)細(xì)胞。與華通膠類(lèi)的組織相比，臍帶血作為血液可能更容易提取細(xì)胞。一般組織類(lèi)物質(zhì)需要酶消化法或組織塊法進(jìn)行提取，此方法一般耗時(shí)較多。而血液源性細(xì)

胞的提取，則依靠密度差異進(jìn)行離心獲得，可以省去大量操作時(shí)間。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，大部分間充質(zhì)干細(xì)胞用于髓核研究的多是利用骨髓或脂肪為來(lái)源。而更為原始，分化能力可能更強(qiáng)，具有向內(nèi)胚層細(xì)胞分化能力的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞則未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道與誘導(dǎo)髓核細(xì)胞的相關(guān)研究。在品種繁多的各種間充質(zhì)干細(xì)胞中，篩選出最為適宜作為髓核細(xì)胞共培養(yǎng)是目前有待探索的項(xiàng)目。如果以治療椎間盤(pán)退行性變?yōu)槟康?，則不僅需要此類(lèi)干細(xì)胞具有增加髓核細(xì)胞數(shù)量作用，還應(yīng)該具備維持細(xì)胞蛋白合成和表達(dá)的能力。現(xiàn)階段通過(guò)基因擴(kuò)增技術(shù)，蛋白印記技術(shù)均可以更為準(zhǔn)確檢測(cè)出蛋白合成的變化。而細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)又能為細(xì)胞分化、增殖和改善蛋白合成及分泌提供途徑。已有研究發(fā)現(xiàn)骨髓造血干細(xì)胞分泌信號(hào)因子，可以作用于共培養(yǎng)體系中的髓核細(xì)胞，從而產(chǎn)生使髓核細(xì)胞增殖并提高蛋白表達(dá)的作用。由此可見(jiàn)，細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是可以用于椎間盤(pán)組織工程學(xué)研究的，它可以為細(xì)胞信號(hào)因子及細(xì)胞間接觸性傳代的物質(zhì)提供適宜場(chǎng)所，延緩髓核細(xì)胞的老化?？梢?jiàn)，如果能獲得大量關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)論性信息，應(yīng)該可以為椎間盤(pán)退行性變的臨床治療提供更多特殊手段，比如是否可以通過(guò)細(xì)胞移植的方法延緩組織老化過(guò)程等，這些由都需要大量實(shí)驗(yàn)來(lái)完成對(duì)它的了解。趙晨成[9]研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有著向椎間盤(pán)細(xì)胞分化的能力，而且其與髓核細(xì)胞的作用可能是相互促進(jìn)的。一些間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子可能作用于髓核細(xì)胞內(nèi)，使得膠原蛋白表達(dá)得以增強(qiáng)。這就提示我們，即便是一些干細(xì)胞不能被誘導(dǎo)分化為椎間盤(pán)細(xì)胞，也存在著臨床應(yīng)用治療退變的潛在價(jià)值。而不單局限于僅靠培養(yǎng)出的髓核或類(lèi)髓核細(xì)胞的移植來(lái)修復(fù)老化的椎間盤(pán)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)可見(jiàn)被誘導(dǎo)為髓核細(xì)胞的干細(xì)胞[10-12]。但研究并為擴(kuò)大至全部可以培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，于海微[13]對(duì)比多種間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)分化能力上可能人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞較強(qiáng)，故而筆者推薦有其他間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的科研團(tuán)隊(duì)，嘗試使用臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入髓核細(xì)胞領(lǐng)域的研究。只用通過(guò)更多種類(lèi)的干細(xì)胞共培養(yǎng)才能明確適宜椎間盤(pán)修復(fù)的相關(guān)研究。另外，除分化至內(nèi)胚層源性細(xì)胞外，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞還有很多生物學(xué)特性與髓核細(xì)胞相類(lèi)似。比如其原代貼壁時(shí)長(zhǎng)等較慢等。凡間充質(zhì)干細(xì)胞均可采用同樣的流式細(xì)胞儀技術(shù)，對(duì)其細(xì)胞膜表面的特異分子進(jìn)行鑒定。故而有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室可以更為容易地進(jìn)行此類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。而髓核細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)，應(yīng)當(dāng)擴(kuò)大干細(xì)胞種類(lèi)的范圍，以尋找適合椎間盤(pán)組織工程學(xué)種子細(xì)胞。

2 共培養(yǎng)的方式

細(xì)胞共培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要方法，通過(guò)將兩種不同種類(lèi)的細(xì)胞放置在同一個(gè)容器中進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)直接或間接接觸，從而促使細(xì)胞產(chǎn)生特定的作用。但兩種細(xì)胞以不同的比例共培養(yǎng)后，結(jié)果可能有所不同。若干細(xì)胞數(shù)量較少，可能難以分泌促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖或合成蛋白的細(xì)胞因子等物質(zhì)。如果髓核細(xì)胞數(shù)量較少，則可能不能誘導(dǎo)干細(xì)胞定向地往類(lèi)髓核細(xì)胞方向分化。所以共培養(yǎng)時(shí)不同細(xì)胞所需添加的不同比例，也是在細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)需要研究的問(wèn)題。謝小波通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)髓核細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞比例為1∶3～2∶l時(shí)，髓核樣細(xì)胞增殖能力會(huì)隨髓核細(xì)胞相對(duì)數(shù)量增加而降低，而這一比例繼續(xù)增加時(shí)，髓核樣細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯提高或降低。盡管大多文獻(xiàn)支持間充質(zhì)干細(xì)胞略多于髓核細(xì)胞時(shí)，能促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖。但對(duì)于初次進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)的學(xué)者來(lái)說(shuō)，常規(guī)可以選擇1∶1比例培養(yǎng)進(jìn)行嘗試。

可采用不同細(xì)胞直接混合的接觸式共培養(yǎng)，也可采用細(xì)胞表面相互分隔的非接觸式共培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞相互誘導(dǎo)作用的研究。接觸式共培養(yǎng)是按不同比例混合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，不同種類(lèi)細(xì)胞可以直接接觸，通過(guò)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或直接接觸相互作用。通過(guò)接觸式共培養(yǎng)，不同種類(lèi)的細(xì)胞可以獲得更大的接觸面積，誘導(dǎo)作用可能更為顯著。由于接觸式共培養(yǎng)，細(xì)胞間物質(zhì)傳遞距離較短，誘導(dǎo)作用的發(fā)生也可能較早。而非接觸共培養(yǎng)則將細(xì)胞種植于通過(guò)具有微小空隙的共培養(yǎng)容器或材料中，使不同種類(lèi)的細(xì)胞隔開(kāi)。不同細(xì)胞旁分泌出的細(xì)胞信號(hào)因子釋放入共培養(yǎng)中共用的培養(yǎng)液，但不同種類(lèi)的細(xì)胞彼此不直接接觸。細(xì)胞因子再通過(guò)穿梭于容器或材料中的微小的空隙，作用于共培養(yǎng)容器或材料中的不同種類(lèi)的細(xì)胞?，F(xiàn)階段研究表明，接觸式共培養(yǎng)更利于髓核細(xì)胞對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮誘導(dǎo)分化的作用[14]，由于接觸式共培養(yǎng)體系下，髓核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞可以充分接觸，誘導(dǎo)機(jī)制可以通過(guò)旁分泌細(xì)胞信號(hào)因子和直接細(xì)胞膜接觸等多種方式進(jìn)行。但非接觸共培養(yǎng)由于有微孔材料的分隔開(kāi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的后期處理較接觸式共培養(yǎng)容易。非接觸共培養(yǎng)用的Transwell培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)由聚碳酸酯膜分隔成兩層，孔徑大小一般可在微米水平范圍內(nèi)選擇。因此可以將不同種類(lèi)的細(xì)胞分別種植于Transwell培養(yǎng)板的不同隔層進(jìn)行共培養(yǎng)。由于細(xì)胞沒(méi)有直接混合在一起，需要單獨(dú)分析間充質(zhì)干細(xì)胞或者髓核細(xì)胞時(shí)，Transwell培養(yǎng)板可以通過(guò)酶消化獲得。亦有學(xué)者使用藻酸鈉微球來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞共培養(yǎng)。藻酸鈉微球通過(guò)藻酸鹽溶液與氯化鈣混合形成，共培養(yǎng)結(jié)束后，可以通過(guò)檸檬酸鈉溶液溶解微球獲得微球內(nèi)的細(xì)胞[15]。而若共培養(yǎng)方式采用直接接觸式，則需要預(yù)先對(duì)某一種細(xì)胞進(jìn)行特異性的熒光標(biāo)記，以便在共培養(yǎng)結(jié)束后通過(guò)流式細(xì)胞儀的篩選，恢復(fù)原先細(xì)胞所在的種類(lèi)。由于細(xì)胞對(duì)不同材料親和力，選擇何種材料利于種子細(xì)胞生長(zhǎng)亦成為組織工程學(xué)研究的方向之一，李長(zhǎng)青通過(guò)對(duì)髓核細(xì)胞在不同支架上培養(yǎng)研究，證實(shí)由殼聚糖聯(lián)合藻酸鹽凝膠所制作的支架利于髓核細(xì)胞的培養(yǎng)[16]。

3 生長(zhǎng)因子

最近研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、分化方向等都可能發(fā)生改變。在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞細(xì)胞用Transwell培養(yǎng)板共培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/胰島素樣生長(zhǎng)因子1 具有促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為髓核細(xì)胞的趨勢(shì)[17]。滿(mǎn)孝旭認(rèn)為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)髓核細(xì)胞是否也有促進(jìn)增殖作用，且能在聯(lián)合應(yīng)用胰島素樣生長(zhǎng)因子1下促進(jìn)增殖作用增強(qiáng)[18]。在已知能促進(jìn)細(xì)胞增殖以及具有增加細(xì)胞蛋白表達(dá)的各種細(xì)胞信號(hào)因子中，篩選出能有效作用于髓核細(xì)胞促進(jìn)其增殖，或者增加其誘導(dǎo)干細(xì)胞向類(lèi)髓核細(xì)胞分化上的作用是必要的。

4 小 結(jié)

髓核細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)是椎間盤(pán)組織工程學(xué)研究的重要途徑，科研范圍較為廣闊。隨著國(guó)內(nèi)外研究的進(jìn)展，髓核細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)將為椎間盤(pán)組織工程學(xué)提供更多的思路和方法，遠(yuǎn)期也將推動(dòng)椎間盤(pán)退行性變的新的治療技術(shù)的進(jìn)步。

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R318.0；R68

A

1671-8194（2016）32-0022-03

胸腰椎爆裂骨折單側(cè)椎管減壓椎體內(nèi)植骨、椎弓根螺釘固定術(shù)的生物力學(xué)研究，貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金課題No：黔科合J字20102179號(hào)

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