建立液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法測定大鼠微透析樣品中美羅培南的濃度

彭　瓏，王　丹，吳　誠，周靜超，郭明星，童衛(wèi)杭

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建立液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法測定大鼠微透析樣品中美羅培南的濃度

彭瓏，王丹，吳誠，周靜超，郭明星，童衛(wèi)杭

[摘要]目的建立高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法(HPLC-MS/MS)用于監(jiān)測微美羅培南在透析液中實時變化的濃度，為應用微透析技術(shù)對感染靶部位美羅培南的藥動/藥效學研究奠定基礎。方法采用COSMOSIL 5C18-PAQ(150 mm×4.6 mm， 5 μm)色譜柱進行分離，流動相為乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脫，流速1.0 ml/min，分析時間為8 min；美羅培南和內(nèi)標(安替比林)均在ESI正離子模式掃描，以多反應監(jiān)測(MRM)模式進行掃描，檢測離子對美羅培南m/z 384.2→141.2，內(nèi)標m/z 189.2→104.0。結(jié)果美羅培南在0.01~40 μg/ml線性范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.9979)；日內(nèi)及日間精密度在9.76%以內(nèi)，準確度-7.87~0.28%。結(jié)論本法靈敏度高、專屬性強、精密度好、準確度高，適用于微透析樣品的快速有效分析。

[關鍵詞]高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)；美羅培南；微透析；大鼠

膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，是嚴重創(chuàng)傷、休克、感染、外科大手術(shù)常見并發(fā)癥，進一步發(fā)展可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。膿毒癥來勢兇猛、病情進展迅速、預后險惡，據(jù)國外流行病學調(diào)查顯示膿毒癥病死率高達30%~70%[1-2]，已超過心肌梗死，是重癥監(jiān)護病房內(nèi)非心臟病患者死亡的主要原因?！霸缙?、強效、廣譜”給予抗生素是有效控制膿毒癥的關鍵。碳青霉烯類抗菌藥物是抗菌譜廣、抗菌活性強的抗生素，其對大多β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定、毒性低，對廣譜青霉素和第2、3、4代頭孢菌素耐藥性細菌有活性，且細菌對該類藥物不存在交叉耐藥等特點，成為治療膿毒癥感染的主要抗菌藥物，美羅培南是臨床常用藥物之一。多中心研究表明美羅培南對于并發(fā)感染的住院患者具有良好的臨床療效且耐受性好[3-5]。

然而，膿毒癥疾病發(fā)生發(fā)展中的一系列病理生理變化對抗生素給藥方案產(chǎn)生了復雜影響[6]，目前無法準確監(jiān)測感染靶部位藥物濃度是導致抗生素治療膿毒癥失敗的主要原因，微透析技術(shù)是一項新型的生物活體取樣技術(shù)，可以直接對感染靶部位進行取樣。本研究旨在建立一種定量方法用于測定微透析液中美羅培南的濃度，為應用微透析技術(shù)對感染靶部位美羅培南的藥動/藥效學研究奠定基礎。前期已有部分文獻報道過美羅培南在血漿中的定量方法主要包括高效液相色譜-紫外檢測器聯(lián)用(HPLC-UV)[6-11]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)[12-14]，對于美羅培南在其他體液中如腦脊液中的藥物濃度也有報道，一般也是應用HPLC-UV法[15]。由于HPLC-UV法靈敏度較低，不適于微透析樣本的測定，而HPLC-MS/MS法不僅靈敏度高且專屬性強，適用于樣本量少，含量較低的微透析樣品[16]。因此，本實驗擬建立大鼠微透析樣本中美羅培南的HPLC-MS/MS測定方法，并進行全面的方法學驗證與評估。

1材料與方法

1.1實驗動物選用SPF級雄性SD大鼠6只，購自北京維通利華公司，體重為300~350 g，月齡4~5個月。飼養(yǎng)于本機構(gòu)動物室：溫度(23±2)℃，濕度(60±5)%，12 h晝夜循環(huán)光照，飼養(yǎng)期間自由飲水和攝食。大鼠適應環(huán)境1周后開始實驗。動物合格證編號：SCXK(京)2012-0001。

1.2儀器與試劑安捷倫1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司產(chǎn)品)，配有四元輸液泵、自動進樣器及切換閥；AB 3200 QTrap型質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品)，配有電噴霧離子源(ESI)以及Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理軟件；CMA 150型動物保溫墊、CMA 402型微量注射泵、MAB 85型低溫樣品收集器(均購自美國CMA公司)。美羅培南對照品(批號130506-200702，含量87.0%)、安替比林對照品(批號100506-200301)，均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇均為色譜純(購自美國Fisher公司)；甲酸為分析純(購自美國Fisher公司)；超純水通過本實驗室Millipore Synergy UV型超純水機獲得；水合氯醛購自中國人民解放軍第306醫(yī)院(批號140107)；注射用美羅培南及復方氯化鈉注射液，購自華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號A201409041。

1.3試驗條件

1.3.1色譜條件：色譜柱：COSMOSIL 5C18-PAQ柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序見表1；流速為1.0 ml/min，分流比1∶1；柱溫20℃，進樣室溫度4℃；進樣量：5 μl；分流比1∶1。

表1　流動相梯度洗脫程序

1.3.2質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源(ESI)，正離子模式掃描；離子噴射電壓：5500 V；離子源溫度：500℃；源內(nèi)氣體1(GS1,N2)壓力：20 kPa；氣體2(GS2,N2)壓力：30 kPa；氣簾氣體(N2)壓力：10 kPa；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；碰撞氣(N2)壓力：Medium；用于定量分析的離子對分別為美羅培南m/z 384.2→141.2，解簇電壓(DP) 24 V，碰撞能量(CE) 20 eV；內(nèi)標安替比鄰m/z 189.2→104.0，DP為57 V，CE為22 eV。美羅培南、內(nèi)標的二級質(zhì)譜圖見圖1。

1.4儲備液、標準溶液及質(zhì)控樣品的制備精密稱取美羅培南對照品10 mg置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1.0 mg/ml的美羅培南儲備液，存于4℃，備用。將儲備液用復方氯化鈉注射液依次稀釋至系列濃度的標準曲線溶液，濃度依次為40、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 μg/ml。同法制備質(zhì)控(QC)樣品，高中低濃度分別為30.0、0.50、0.025 μg/ml。同樣精密稱取內(nèi)標安替比鄰對照品適量置于容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得到其儲備液。再用復方氯化鈉注射液將儲備液稀釋至0.8 μg/ml，即得內(nèi)標溶液，存于4℃，備用。

1.5微透析樣品收集與前處理肺組織微透析樣品收集：水合氯醛將SD大鼠麻醉(0.35 ml/100 g)，固定在37℃保溫墊上，腹部朝上。眼科剪將大鼠腹部剪開，使肺部暴露，將線性探針平行植入肺部組織，再將探針與微透析裝置相連。以10 μl/ml的流速泵入復方氯化鈉注射液，排除氣泡并沖洗管路，再以1 μl/ml的流速繼續(xù)泵入復方氯化鈉注射液30 min以達到平衡，并收集空白透析液；將用生理鹽水溶解的注射用美羅培南給予大鼠尾靜脈注射后，以冷凍樣品收集器連續(xù)收集透析液，溫度為4℃，采樣間隔為20 min，連續(xù)采集6 h。微透析樣品前處理：精密取肺組織微透析樣品20 μl，加入內(nèi)標20 μl，渦旋混勻，以14 000 r/min，離心5 min，取上清液5 μl用于LC-MS/MS分析。

圖1　美羅培南及內(nèi)標的二級質(zhì)譜圖(A:美羅培南；B：安替比鄰)

1.6方法學驗證

1.6.1方法的專屬性：分別取6只大鼠的肺組織空白透析液，將空白透析液的色譜圖與空白透析液中加入美羅培南對照品和內(nèi)標處理后得到的色譜圖，以及給藥后大鼠透析液的色譜圖進行比較，看大鼠空白透析液中其他內(nèi)源性成分對待測成分是否有干擾，以及給藥后是否會產(chǎn)生代謝產(chǎn)物對美羅培南的測定有干擾。

1.6.2標準曲線及最低定量限(LLOQ)：取系列濃度的標準曲線溶液各20 μl，分別加入內(nèi)標液20 μl，渦旋混勻，以14000 r/min，離心5 min，取上清液5 μl用于LC-MS/MS分析，建立美羅培南的標準曲線。以美羅培南的濃度x為橫坐標，以其與內(nèi)標的峰面積比y為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法(W=1/X2)計算回歸方程及相關系數(shù)(r)，要求r值大于0.99。LLOQ即為標準曲線的最低濃度點，平行處理6份，精密度需小于20%，準確度在±20%范圍內(nèi)。

1.6.3精密度和準確度：取高、中、低3個濃度的QC樣品，每個濃度平行制備6份，進樣分析，計算日內(nèi)精密度和準確度，重復操作，連續(xù)測定3 d并隨行當日標準曲線，計算日間精密度和準確度。以相對誤差(RE)表示準確度，相對標準偏差(RSD)表示精密度。要求高、中濃度QC樣品RSD≤15%，RE在±15%范圍內(nèi)，低濃度QC樣品RSD≤20%，RE在±20%范圍內(nèi)。

1.6.4穩(wěn)定性：取高、中、低濃度QC樣品于制備好后在20℃下放置4、8、12 h后進樣分析，考察樣品處理后在室溫下放置12 h的穩(wěn)定性；將處理后的樣品在4℃下放置4、8、12及24 h后進樣分析，考察樣品處理后在進樣條件下放置24 h的穩(wěn)定性；將樣品在-40℃下冷凍，經(jīng)24 h后取出至室溫自然融解，再置于-40℃下冷凍，考察經(jīng)3個凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性；將質(zhì)控樣品在37℃下放置3、6、9、12 h后處理進樣分析，考察樣品在37℃的透析過程中的穩(wěn)定性。

2結(jié)果

2.1分析方法確證專屬性對比圖2A、2B，可以看出，在美羅培南和內(nèi)標的出峰處沒有干擾，說明大鼠空白透析液中沒有內(nèi)源性成分的干擾；對比圖2B和圖2C可以看出，在給藥后的大鼠微透析液中也沒有代謝物的干擾，說明本方法專屬性良好。

2.2分析方法確證標準曲線及最低定量限(LLOQ)通過標準曲線樣品的濃度和峰面積求得線性回歸方程：Y=0.000491X+0.00163，相關系數(shù)r=0.9979，說明美羅培南在0.01~40 μg/ml線性范圍內(nèi)線性關系良好，最低定量限為標曲的最低點，即0.01 μg/ml，將此濃度點的樣品平行處理6份，進樣分析，精密度為7.25%，準確度為-4.81%，在合格范圍內(nèi)。

2.3分析方法確證精密度和準確度分析方法的日內(nèi)及日間精密度和準確度實驗結(jié)果見表2。美羅培南日內(nèi)和日間精密度分別在5.86%~9.76%和2.41%~5.23%范圍內(nèi)，準確度-7.87%~0.28%，結(jié)果表明分析方法的準確度和精密度均較好。

圖2　LC-MS/MS法測定大鼠微透析液中美羅培南(a)及內(nèi)標(b)的色譜圖A為空白透析液色譜圖；B為空白透析液中加入美羅培南0.01 μg/ml(LLOQ)以及內(nèi)標0.8 μg/ml處理后的色譜圖；C為大鼠尾靜脈注射美羅培南注射液1 h時肺組織透析液的色譜圖

表2　美羅培南測定方法的精密度和準確度±s)

2.4分析方法確證穩(wěn)定性樣品穩(wěn)定性結(jié)果見表3。從結(jié)果可見，透析樣品處理后在20℃下放置12 h、在4℃下放置24 h以及在37 ℃下的透析環(huán)境中放置12 h后，樣品均保持穩(wěn)定，未發(fā)生明顯的降解反應；將樣品在-40℃下經(jīng)過3個凍融循環(huán)后的仍保持穩(wěn)定。

表3　美羅培南微透析樣品的穩(wěn)定性(RE%)

3討論

質(zhì)譜條件的選擇，建立LC-MS/MS檢測方法的第一步即是選擇美羅培南和內(nèi)標的母子離子對，用于MRM模式監(jiān)測。用甲醇分別將美羅培南和內(nèi)標儲備液稀釋至1 μg/ml，以5 μl/min的流速直接進質(zhì)譜分析。采用ESI正離子模式，美羅培南及內(nèi)標的母離子均為[M+H]+峰，質(zhì)荷比分別為m/z 384.2和189.2。根據(jù)子離子選擇原則，每個化合物的母離子應選擇2個子離子來確證目標化合物，但選擇響應更強的作為定量離子對，因此最終選擇美羅培南和內(nèi)標用于定量的離子對分別為m/z 384.2→141.2和m/z 189.2→104.0。

色譜條件的選擇，為了獲得良好的峰型、較高的靈敏度、較短的分析時間，我們對流動相的選擇、比例、柱溫等均進行了優(yōu)化。有報道稱在流動相里加入少量的電解質(zhì)即能顯著改善電離效率，從而提高化合物的響應靈敏度[17]。因此，我們比較了在水相中加入醋酸銨和甲酸作為流動相的色譜圖，發(fā)現(xiàn)以甲酸水作為水相，美羅培南和內(nèi)標的峰形均較好，且離子強度比以醋酸銨水作為水相時更強，另外還優(yōu)化了加入甲酸的量，認為0.1%的甲酸水已能使兩化合物具有良好的峰形和響應；分別以甲醇和乙腈作為有機相也進行了比較，結(jié)果表明，以乙腈作為有機相的靈敏度比甲醇稍高，且峰型更好，保留時間提前；因此，最終選定乙腈-0.1%甲酸水作為本次實驗的流動相。另外，為了獲得更窄的色譜峰型和更快的分析時間，采用了梯度洗脫。比較了20、30、40℃柱溫條件下的色譜峰，發(fā)現(xiàn)并沒有太大差異，且柱溫從20℃升至40℃，保留時間僅提前了0.1 min，因此，最終選擇20℃柱溫進行實驗。

實驗中的樣品均為微透析樣品，復方氯化鈉注射液中含各種無機鹽離子，而由于無機鹽不具有揮發(fā)性而不能進質(zhì)譜，因此，在液相方法設定中，從0~2.5 min即一個柱體積切換至廢液，從2.51 min才開始進質(zhì)譜，由于鹽離子在色譜柱上不會有保留，因此一個柱體積已能將鹽離子全部除去，從而保護質(zhì)譜離子源和錐孔不受污染，并可提高靈敏度，目前很多微透析-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)都是采用這種方法來減少或避免非揮發(fā)性鹽離子或小分子物質(zhì)對質(zhì)譜的影響[18~19]。

在本實驗中，建立并驗證了LC-MS/MS法以測定大鼠尾靜脈注射美羅培南注射液后肺部組織透析液中美羅培南的濃度。此法靈敏度高、專屬性強、精密度好、準確度高、分析時間短，便于透析樣品的快速有效分析，并可進一步應用于血管、肌肉、皮膚其他組織的的微透析實驗中。

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(收稿時間：2015-09-22修回時間：2015-10-25)

·論著·

LC-MS/MS Method in Determination of Meropenem Concentration of Microdialysis Samples of Rats

PENG Long, WANG Dan, WU Cheng, ZHOU Jing-chao, GUO Ming-xing, TONG Wei-hang ( Department of Pharmacy, General Hospital of the Second Artillery of Chinese PLA, Beijing 100088, China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method to monitor real-time concentration changes of Meropenem during microdialysis samples of rats so as to provide the foundation for further pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) study of Meropenem on infected tissues with microdialysis technique. MethodsChromatographic separation was performed on a COSMOSIL 5C18-PAQ (150 mm×4.6 mm, 5 μm) column by a gradient elution, the mobile phase was composed of acetonitrile and -0.1% formic acid aqueous solution at a 1.0 mL/min flow rate in a run time of 8 min. The quantification of Meropenem and internal standard (Antipyrine) were determined by multiple reaction monitoring (MRM) mode with a positive electrospray ionization (ESI), and the ion transitions were m/z 384.2→141.2 and m/z 189.2→104.0 for Meropenem and internal standard respectively. ResultsThe Meropenem showed good linear correlation in a range of 0.01-40 μg/mL (r=0.9979). The intra- and inter-day precisions [relative standard deviation (RSD) %] were all within 9.76%, and accuracy (RE%) ranged from -7.87% to 0.28%. ConclusionThe established LC-MS/MS method of Meropenem is accurate with good sensitivity, specificity and precision, which can be applied in quick and effective analysis of Meropenem concentration in microdialysis samples.

[Key words]High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Meropenem; Microdialysis; Rats

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.024

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R446.1 R943A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0103-06

[通訊作者]童衛(wèi)杭，E-mail:sonatawh@163.com

[基金項目][作者單位]100088 北京，解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥學部