HPLC-DAD同時測定金蟬花中8種核苷類成分的含量

呂慧慧，楊安倫，張　浩

HPLC-DAD同時測定金蟬花中8種核苷類成分的含量

呂慧慧1*，楊安倫1，張浩2

[摘要]目的建立同時測定金蟬花中腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷和2-脫氧腺苷8種核苷類成分的HPLC測定方法。方法采用Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱，流動相：甲醇-水梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。結果腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷和2-脫氧腺苷8種核苷類成分分別在0.081~1.62、0.074~1.48、0.098~1.85、0.068~1.36、0.071~1.42、0.051~1.01、0.058~1.16、0.068~1.34 μg內(nèi)呈良好的線性關系(R2≥0.999 0)，平均加樣回收率分別為97.8%、98.3%、101.5%、98.9%、99.1%、97.3%、100.6%、98.9%，RSD<3.00%。結論該方法簡單、重現(xiàn)性良好，準確可靠，可用于金蟬花藥材的快速質(zhì)量評價。

[關鍵詞]金蟬花；核苷類成分；HPLC

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for simultaneous determination of 8 nucleosides (Adenine,Cytosine,Inosine,Uracil,Uridine,β-thymidine,Adenosine and 2’-deoxyadenosine) from cordyceps cicadae.MethodsThe analysis was achieved with an Inertsil ODS-SP Extend C18column (250 mm×4.6 mm,5.0 μm) by gradient elution of methanol and water at 25 ℃.The flow rate was 1 mL/min,injection volume was 10 μL,and detection wavelength was set at 260 nm.ResultsAll the active constituents′ calibration curves showed a good linearity (R2≥0.999 0) in a relatively wide concentration range.The liner range of the active constituents was 0.081~1.62,0.074~1.48,0.098~1.85,0.068~1.36,0.071~1.42,0.051~1.01,0.058~1.16,0.068~1.34 μg,respectively.The average recovery rate was 97.8%,98.3%,101.5%,98.9%,99.1%,97.3%,100.6%,98.9%,RSD<3.00%.ConclusionThis method is simple with good reproducibility,accuracy and reliability,it can be used for the rapid quality evaluation of cordyceps cicadae.

收稿日期：2015-06-17

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512019

HPLC-DAD method for simultaneous determination of 8 nucleosides in cordyceps cicadaeLü Hui-hui1*,YANG An-lun1,ZHANG Hao2(1.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou 310018,China;2.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

Key words：Cordyceps cicadae;Nucleosides;HPLC

0引言

金蟬花[1](Cordyceps cicadae)為麥角菌科真菌大蟬草(Cordyceps cicadae Shing)寄生于蟬科昆蟲的若蟲上形成的蟲菌復合體，又名蟬花、蟬茸、蟲花、蟬蟲草、蟬茸菌，其性味甘寒，具散風熱、定驚鎮(zhèn)痙、明目之功效，屬于蟲草類藥材，主產(chǎn)于浙江、四川等地。金蟬花含有豐富的生物活性成分，如多種生物堿、多糖[2]、核苷類成分[3-4]、蟲草酸、多種必需氨基酸[5]等有效成分。現(xiàn)代藥理研究表明，金蟬花具有改善腎功能[6]、治療糖尿病[7]、抗失血性貧血、調(diào)解機體免疫功能等臨床療效。 核苷類成分是金蟬花中重要的生物活性物質(zhì)，既參與胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的合成，又與蛋白質(zhì)表達及細胞的分裂增殖有關[8]。腺嘌呤參與遺傳物質(zhì)的合成，能促進白細胞增生，用于防治各種原因引起的白細胞減少癥，特別是用于腫瘤化學治療時引起的白細胞減少癥，也用于急性粒細胞減少癥[9]。胞嘧啶是一種重要的醫(yī)藥中間體，常用于抗艾滋病、慢性乙型肝炎和腫瘤藥物的合成[10]。肌苷為輔酶類藥物，能參與體內(nèi)能量代謝及蛋白質(zhì)合成，具有提高各種酶特別是輔酶Ade 活性、改善抗體代謝作用。尿嘧啶干擾病毒DNA、RNA的復制，抑制病毒增殖，保護細胞免受病毒損害[11]。尿苷有助于提高細胞的耐缺氧能力，并能促進蛋白質(zhì)、核酸的生物合成，阻斷癌細胞和病毒基因合成[12]。β-胸苷是核苷類物質(zhì)的重要組成部分，也是抗艾滋病藥物齊多夫定的合成原料。腺苷是機體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，廣泛存在于細胞內(nèi)液和細胞外液中，在機體的中樞神經(jīng)、心血管系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)等發(fā)揮重要作用[13]。2-脫氧腺苷(dAR)是天然的脫氧核苷，具有一定的藥用價值，可抑制胰島素分泌。近年來dAR作為一種合成抗腫瘤、抗病毒核苷類化合物的中間體受到越來越高的關注。

基于金蟬花中核苷類成分種類豐富，療效顯著，本實驗對金蟬花中8種核苷類成分含量進行測定，為金蟬花的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持。

1儀器與試藥

1.1儀器UltiMate 3000戴安液相色譜儀，包括真空脫氣泵、四元泵、柱溫箱、自動進樣器、DAD二極管陣列檢測器；KS-80中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；BP210S十萬分之一電子天平(Sartorius公司)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱。

1.2試藥金蟬花(批號：20140501，產(chǎn)地：杭州，購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司)；腺嘌呤(批號：1108886-201102，100%，中國藥品生物制品檢定所)、胞嘧啶(C19895，99%，西亞試劑)、肌苷(140669-201305，100%，中國藥品生物制品檢定所)、尿嘧啶(100469-201312，99.6%，中國藥品生物制品檢定所)、尿苷(887-200202，100%，中國藥品生物制品檢定所)、β-胸苷(13650，99%，西亞試劑)、腺苷(110879-200202，中國藥品生物制品檢定所)、2-脫氧腺苷(U3874，98%，西亞試劑)；無水乙醇為分析純，流動相甲醇為色譜純，水為純凈水。

2方法與結果

2.1波長的選擇用UltiMate 3000 DAD檢測器對腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷和2-脫氧腺苷在180~420 nm波段進行掃描，結果表明，選用260 nm為檢測波長較為理想。

圖1核苷類成分對照品和金蟬花樣品色譜圖

注：A.核苷類成分對照品，B.金蟬花藥材；1.腺嘌呤，2.胞嘧啶，3.肌苷，4.尿嘧啶，5.尿苷，6.β-胸苷，7.腺苷，8.2-脫氧腺苷

2.2色譜條件以Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)為色譜柱。甲醇為流動相A，水為流動相B。梯度洗脫：0~10 min，1%~5%A；10~15 min，5%~15% A；15~20 min，15%~20% A；20~30 min，20% A；30~35 min，20%~35% A；35~40 min，35%~1% A。柱溫25 ℃，流速1 mL/min，檢測波長260 nm。見圖1。

2.3對照品溶液的制備精密稱取對照品腺嘌呤3.24 mg、胞嘧啶2.96 mg、肌苷3.90 mg、尿嘧啶2.72 mg、尿苷2.84 mg、β-胸苷2.02 mg、腺苷2.32 mg、2-脫氧腺苷2.68 mg分別置于20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，溶解搖勻，作為對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液依次稀釋成相應對照品溶液，濃度：腺嘌呤8.1、16.2、32.4、81.0、162.0 μg/mL，胞嘧啶7.4、14.8、29.6、74.0、148.0 μg/mL，肌苷9.75、19.5、39.0、97.5、195.0 μg/mL，尿嘧啶6.8、13.6、27.2、68.0、136.0 μg/mL，尿苷7.1、14.2、28.4、56.8、71.0、142.0 μg/mL，β-胸苷5.05、10.1、20.2、50.5、101.0 μg/mL，腺苷5.8、11.6、23.2、58.0、116.0 μg/mL，2-脫氧腺苷6.8、13.4、26.8、68.0、134 μg/mL，進行測定。

2.4供試品溶液的制備稱取金蟬花粉末(過三號篩)約0.2 g置具塞錐形瓶中，精密加入20%乙醇溶液25 mL，超聲提取30 min，取續(xù)濾液，過膜純化，取供試品液10 μL，注入色譜儀，測定，即得。

2.5線性關系考察將對照品儲備液加甲醇稀釋2、5、10、20倍制成對照品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測得峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標、8種核苷類對照品進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，見表1。

表1　8種核苷類成分線性關系考察結果

結果表明，腺嘌呤在線性范圍0.081~1.62 μg、胞嘧啶在線性范圍0.074~1.48 μg、肌苷在線性范圍0.098~1.95 μg、尿嘧啶在線性范圍0.068~1.36 μg、尿苷在線性范圍0.071~1.42 μg、β-胸苷在線性范圍0.051~1.01 μg、腺苷在線性范圍0.058~1.16 μg、2-脫氧腺苷在線性范圍0.068~1.34 μg內(nèi)呈良好的線性關系，符合試驗要求。

2.6精密度考察取對照品溶液腺嘌呤32.4 μg/mL、胞嘧啶29.6 μg/mL、肌苷39.0 μg/mL、尿嘧啶27.2 μg/mL、尿苷28.4 μg/mL、β-胸苷20.2 μg/mL、腺苷23.2 μg/mL、2-脫氧腺苷26.8 μg/mL，按上述色譜條件進行進樣分析，進樣6次，每次10 μL，測定峰面積，并計算RSD分別為腺嘌呤1.58%、胞嘧啶1.17%、肌苷0.86%、尿嘧啶1.94%、尿苷1.28%、β-胸苷1.73%、腺苷0.97%、2-脫氧腺苷1.55%，表明儀器精密度符合試驗要求。

2.7加樣回收試驗取已知含量金蟬花粉末(過三號篩) 0.2 g共6份，分別加入濃度為腺嘌呤32.4 μg/mL、胞嘧啶74.0 μg/mL、肌苷195.0 μg/mL、尿嘧啶68.0 μg/mL、尿苷28.4 μg/mL、β-胸苷20.2 μg/mL、腺苷58.0 μg/mL、2-脫氧腺苷13.4 μg/mL的對照品溶液1 mL，依照上述供試品制備方法及色譜條件制樣、測定，并計算回收率、RSD值分別為：腺嘌呤97.8%、2.46%，胞嘧啶98.3%、1.72%，肌苷101.5%、1.04%，尿嘧啶98.9%、2.04%，尿苷99.1%、1.85%，β-胸苷97.3%、2.12%，腺苷100.6%、1.82%，2-脫氧腺苷98.9%、2.83%，結果表明，準確度符合試驗要求。

2.8重復性考察取金蟬花粉末(過三號篩)按照上述供試品溶液制備方式平行制備6份供試品溶液，精密吸取10 μL，注入色譜儀，測定并計算。結果樣品中腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷、2-脫氧腺苷的平均含量分別為59.08、352.66、1 407.92、319.47、71.23、86.73、467.09、30.39 μg/g、RSD分別為2.37%、1.78%、1.24%、2.12%、2.51%，1.96%、2.09%、2.76%，重復性符合試驗要求。

2.9穩(wěn)定性考察取金蟬花供試品溶液分別于0、5、10、15、20、25、30 h進樣，測定腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷、2-脫氧腺苷峰面積值，計算RSD值分別為1.27%、1.84%、0.96%、1.44%、1.73%、1.14%、0.89%、1.92%，表明供試品溶液中核苷類成分在30 h內(nèi)穩(wěn)定。

3樣品測定

3.1試驗樣品金蟬花藥材分別收購自浙江杭州、臺州、安徽亳州、四川成都、江蘇常州、江西九江，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學來平凡教授鑒定，為麥角菌科真菌蟬擬青霉寄生于蟬蛹上的干燥復合體。

3.2含量測定取金蟬花粉末(過三號篩)，按上述供試品制備方法制備金蟬花供試液，精密取供試品溶液10 μL，分別進樣，記錄峰面積，外標定量測得各批次中核苷類成分的含量，結果見表2。

表2　各批次金蟬花核苷類成分含量測定結果(μg/g)

4討論

4.1檢測方法的確定本試驗分別對標準品和供試品的線性范圍、精密度、準確度、穩(wěn)定性和重復性進行考察。結果表明，腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷和2-脫氧腺苷8種核苷類成分在相應范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系(R2≥0.999 0)。加樣回收試驗顯示準確度較高。說明該條件適合對金蟬花核苷類成分進行檢測評價。

4.2不同產(chǎn)地金蟬花的比較通過對不同產(chǎn)地金蟬花核苷類成分比較分析，可知不同產(chǎn)地金蟬花核苷類物質(zhì)組成以及相同物質(zhì)之間的含量有明顯差異，該研究為評價金蟬花質(zhì)量差異提供依據(jù)。

4.3金蟬花的藥用前景中醫(yī)認為，金蟬花是一種功效與冬蟲夏草近似的珍貴藥材，具有多方面的藥用價值。但相較于冬蟲夏草對生長環(huán)境的要求高、產(chǎn)量少、價格昂貴，金蟬花價格相對低廉，生態(tài)要求相對較低，因此可大力開發(fā)金蟬花作為冬蟲夏草的代用品。

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作者單位：解放軍總醫(yī)院醫(yī)務部藥材處，北京 100853