人參降解物對(duì)高血脂大鼠肝臟的形態(tài)學(xué)影響

武　聰，丁永玲，黃彩虹，王　磊

人參降解物對(duì)高血脂大鼠肝臟的形態(tài)學(xué)影響

武聰，丁永玲，黃彩虹，王磊

[摘要]目的觀察人參降解物對(duì)高血脂大鼠肝臟的形態(tài)學(xué)影響。方法將100只Wistar大鼠分為對(duì)照組與模型組。模型組通過高脂飲食制備高血脂大鼠模型，分為非治療組及3個(gè)治療組，非治療組大鼠進(jìn)行羧甲基纖維素鈉灌胃，治療1組給予產(chǎn)物一，治療2組給予產(chǎn)物一和麥冬，治療3組給予產(chǎn)物二，各組均連續(xù)灌胃給藥45 d。測(cè)定各組大鼠的TC、TG、HDL-C、LDL-C血脂指標(biāo)；取大鼠肝臟進(jìn)行HE、VG染色，應(yīng)用透射電鏡觀察各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)的改變。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C明顯升高(P<0.01)，提示造模成功。與非治療組比較，治療組的TG、LDL-C均降低(P<0.05)。HE、VG染色和透射電鏡觀察結(jié)果提示，治療1組、治療2組與非治療組比較，肝臟病變明顯改善。結(jié)論本研究所用的藥物在降血脂和改善肝臟病變方面有均有不同程度的作用。

[關(guān)鍵詞]人參降解產(chǎn)物；高血脂；超微結(jié)構(gòu)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effect of degradation products of ginsenosides on the morphology of liver in rats with hyperlipidemia.MethodsA hundred of wistar rats were divided into control group and model group.The rat model of hyperlipidemia was established by high-fat diet.Rats in model group were divided into non-treatment group,treatment group 1 (ginsenoside group),treatment group 2 (ginsenoside+ophiopogon group) and treatment group 3 (new panaxadiol group).All the rats were continuously administrated with gavage for 45 d.After treatment,the blood pressure,total serum cholesterol (TC),triglycerides (TG),low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) were detected.The general morphological changes of liver were observed by HE staining and VG staining.The ultrastructural changes of liver were observed by transmission electron microscopy.ResultsCompared with control group,the levels of TG,TC and LDL-C of model group increased significantly.The high cholesterol model was successfully established.Compared with non-treatment group,the TG and LDL-C in treatment groups decreased significantly (P<0.05).HE staining,VG staining and ultrastructral changes showed that,compared with non-treatment group,the hepatic lesion was improved in treatment group 1 and treatment group 2.ConclusionThe three drugs can decrease the levels of lipids and improve the degree of liver morphological lesion to a certain degree.

收稿日期：2015-07-18

基金項(xiàng)目：中國(guó)肝炎防治基金會(huì)王寶恩肝纖維化研究基金

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512007

Effect of degradation products of ginsenosides on the morphology of liver in rats with hyperlipidemiaWU Cong,DING Yong-ling,HUANG Cai-hong,WANG Lei (Department of Pathology,Yangzhou NO.1 People′s Hospital,Yangzhou 255000,China)

Key words：Ginsenosides degradation products;High blood cholesterol;Ultrastructural changes

0引言

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病、高血壓和腦卒中等心腦血管疾病產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)，高脂血癥(尤其是高膽固醇血癥)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的危險(xiǎn)因子和獨(dú)立因素[1]。中醫(yī)認(rèn)為，高脂血癥為本虛標(biāo)實(shí)，屬血瘀、痰濁范疇，臨床辨證多歸于肝腎虧虛“脾虛痰濁”氣滯血瘀[2]。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)看，中藥的降脂作用主要從抑制膽固醇的吸收“調(diào)節(jié)血脂代謝”，促進(jìn)膽固醇排泄來體現(xiàn)[3]。

人參作為傳統(tǒng)的中藥材，具有悠久的藥用歷史。人參皂苷(Ginsenoside，GS)是人參中最主要的有效物質(zhì)，其相關(guān)研究較為深入。GS具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高機(jī)體免疫力、強(qiáng)心和抗心肌缺血、改善器官血液循環(huán)、抗腫瘤和抗衰老等作用[4]。人參與麥冬合劑作為經(jīng)典藥對(duì)，在臨床上已廣泛應(yīng)用于冠心病、心力衰竭和心絞痛的治療。新人參二醇是從人參總皂苷酸降解物中分離獲得的新單體化合物，目前對(duì)其生物活性和藥理作用的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)使用的藥物為人參皂苷酸降解產(chǎn)物及合劑，選用較為理想的高脂飼料喂養(yǎng)的高血脂大鼠模型，旨在探討人參皂苷酸降解產(chǎn)物對(duì)高血脂大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變的作用。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)Wistar大鼠(SCXK-吉2007-0003) 100只，體重(250±10) g，雌雄各半。分籠飼養(yǎng)，每籠10只，雌雄分開。室溫22~24 ℃，自由進(jìn)食飲水。喂食高脂飼料(87.6%基礎(chǔ)飼料，10%豬油，0.2%丙基硫氧嘧啶，2%膽固醇，0.2%膽酸鹽)。試劑：三酰甘油試劑盒、總膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒，均購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑有限公司。儀器：7202B可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡，日本電子公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法模型建立：將大鼠分為對(duì)照組(20只)、模型組(80只)，其中模型組采用喂食高脂飼料造模(87.6%基礎(chǔ)飼料，10%豬油，0.2%丙基硫氧嘧啶，2%膽固醇，0.2%膽酸鹽)。對(duì)照組在相應(yīng)的造模階段給予普通飼料，常規(guī)飼養(yǎng)。于喂食后30 d，經(jīng)尾靜脈采血，取血清用分光光度計(jì)測(cè)定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，確定高血脂造模是否成功。將模型組造模成功的大鼠隨機(jī)分為非治療組和3個(gè)治療組備用。

用藥情況：治療1組應(yīng)用人參皂苷酸降解后得到的產(chǎn)物一；治療2組應(yīng)用產(chǎn)物一+麥冬所組成的復(fù)合藥物；治療3組應(yīng)用人參皂苷酸降解的產(chǎn)物二。所有藥物均使用0.5%羧甲基纖維素鈉作為溶劑進(jìn)行配制。實(shí)驗(yàn)藥物所用劑量均根據(jù)提純前的有效劑量所計(jì)算出。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：選取造模成功大鼠隨機(jī)分組，每組15只。非治療組給予0.5%羧甲基纖維素鈉0.5 mL/(100 g·d)；治療1組給予產(chǎn)物一0.027 g/(kg·d)；治療2組給予產(chǎn)物一0.027 g/(kg·d)+麥冬0.1 g/(kg·d)；治療3組給予產(chǎn)物二0.1 g/(kg·d)；對(duì)照組15只大鼠，給予0.5%羧甲基纖維素鈉0.5 mL/(100 g·d)；各組均連續(xù)灌胃給藥45 d。治療過程中，模型組持續(xù)進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng)，并記錄各大鼠的體重來計(jì)算大鼠的飲食需要量，對(duì)照組繼續(xù)進(jìn)行普通飼料喂養(yǎng)。

1.3檢測(cè)指標(biāo)各組大鼠給藥結(jié)束后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血10 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清用分光光度計(jì)進(jìn)行TG、TC、LDL-C及HDL-C的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行比較。

1.4光鏡樣品制備將大鼠處死后，在冰上迅速將大鼠的肝臟取出置于中性福爾馬林中固定，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，切片。進(jìn)行HE染色及VG染色，用光鏡進(jìn)行觀察。

1.5電鏡樣品制備各治療組取3只大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，開胸暴露心臟；將細(xì)針頭經(jīng)心尖處插入左心室內(nèi)，回血后剪開右心耳；給予37 ℃ 0.9%氯化鈉溶液40 mL緩慢灌注，至流出液呈無色狀為止；然后再給予4 ℃的2%多聚甲醛、2.5%戊二醛混合固定液40 mL灌流固定，至大鼠身體僵硬為止。取肝臟固定于4 ℃、4%戊二醛固定液中固定備用。

2結(jié)果

2.1生化指標(biāo)結(jié)果與對(duì)照組比較，治療組大鼠血清中TC、TG、LDL-C明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示造模成功。與非治療組比較，3個(gè)治療組的TG、LDL-C均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示各組藥物均有不同程度的降血脂作用。見圖1。

圖1　各組大鼠血清血脂生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2HE染色結(jié)果對(duì)照組大鼠肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞排列成條索狀，細(xì)胞大。非治療組肝小葉內(nèi)可見肝細(xì)胞局部出現(xiàn)片狀壞死，部分肝細(xì)胞呈脂肪變性，胞質(zhì)出現(xiàn)大量脂滴。各治療組肝小葉內(nèi)未見肝細(xì)胞壞死，但部分肝細(xì)胞內(nèi)仍可見少量脂滴，其中治療1組和治療2組改善較明顯。見圖2。

圖2　HE染色結(jié)果

2.3VG染色結(jié)果肝臟VG染色陽性結(jié)果，膠原纖維呈粉紅色波紋狀。對(duì)照組肝小葉內(nèi)偶見少量細(xì)小、粉紅色的膠原纖維。非治療組肝小葉內(nèi)可見大量較粗、粉染的膠原纖維。治療1組和治療2組肝小葉內(nèi)膠原纖維較少且細(xì)小。治療3組肝小葉內(nèi)膠原纖維較多，但較非治療組略有減少。見圖3。

圖3　VG染色結(jié)果

2.4肝臟電鏡觀察結(jié)果對(duì)照組肝細(xì)胞較大，胞質(zhì)內(nèi)可見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和豐富的線粒體，少量溶酶體和糖原顆粒；膽小管腔內(nèi)和肝血竇面均可見微絨毛。非治療組的肝細(xì)胞較小且致密；核呈輕度固縮狀，核基質(zhì)致密，其內(nèi)細(xì)胞器不易分辨，可見大量脂滴；膽小管結(jié)構(gòu)不清，肝血竇面微絨毛增多，并可見較多膠原原纖維。各治療組肝細(xì)胞體積較大，部分細(xì)胞核基質(zhì)略空化；胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體豐富但仍可見數(shù)個(gè)脂滴；膽小管兩端緊密連接清楚，腔面可見微絨毛；竇周隙內(nèi)的膠原原纖維較非治療組減少。其中治療3組肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多糖原顆粒、溶酶體和脂褐素顆粒。見圖4。

3討論

肝臟是脂蛋白和內(nèi)源性血脂合成代謝的重要器官。長(zhǎng)期高血脂會(huì)導(dǎo)致脂肪性肝炎和肝纖維化，嚴(yán)重者可演變?yōu)楦斡不?。血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C等生化指標(biāo)是反映機(jī)體內(nèi)脂肪代謝水平的重要參數(shù)。

圖4　肝臟超微結(jié)構(gòu)

人參皂苷能抑制血清、肝組織和腦組織內(nèi)的脂質(zhì)沉積，顯著增加HDL-C的含量，降低血清總膽固醇(TC)、游離膽固醇及LDL-C的含量[5]。敬華等[6]研究表明，人參二醇可以降低四氧化二氮(N2O4)染毒小鼠血清蛋白醇抑制物(α1-AT)的水平，在某種程度上，人參二醇能夠?qū)够蚓徑釴2O4所致急性肺損傷的組織損害，也能夠減輕中毒鼠肝、腎和心臟的損傷，具有一定的保護(hù)作用。

高血脂病大鼠肝臟會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變，肝細(xì)胞內(nèi)可見大量的脂滴，肝細(xì)胞腫脹、排列紊亂，局部出現(xiàn)片狀壞死，肝竇周隙內(nèi)纖維組織增生[7]。本研究中非治療組肝細(xì)胞出現(xiàn)片狀壞死和肝脂肪變性；電鏡下肝細(xì)胞小且致密，結(jié)構(gòu)不清；細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)邊集；胞質(zhì)內(nèi)有大量脂滴，膽小管管腔內(nèi)微絨毛減少，管腔擴(kuò)張；肝血竇面微絨毛增多。治療1組、治療2組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量明顯減少，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體豐富，而治療3組肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴較多，較非治療組略有減少，這種形態(tài)學(xué)的改變與血清中的TG、TC、LDL-C降低和HDL-C含量較低不吻合，提示人參酸降解產(chǎn)物二在降低血脂方面的作用可能不如另外兩種藥物明顯，其原因有待其他實(shí)驗(yàn)證實(shí)。膠原纖維染色顯示，在非治療組肝小葉內(nèi)可見較多粉染的膠原纖維；透射電鏡觀察也證實(shí)竇周隙中可見較多膠原原纖維存在。治療1組和治療2組肝小葉的膠原纖維較非治療組減少；但治療3組的膠原纖維數(shù)量與非治療組類似。結(jié)果表明，人參皂苷和人參+麥冬具有一定的抗肝臟纖維化的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)血清中的血脂水平及光鏡和電鏡的形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)人參皂苷、人參+麥冬和新人參二醇3種藥物對(duì)高血脂大鼠模型的治療情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，3種藥物對(duì)高血脂大鼠均有一定的治療作用，對(duì)其肝臟的形態(tài)學(xué)損傷也有一定的改善作用，但作用的效果和程度有所不同，其治療機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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作者單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092

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