過(guò)表達(dá)IL-17RLM的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用*

郭　婧，　晁　康，　唐　健，　王培培，　高　翔△

(中山大學(xué)1附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)科，2附屬第三醫(yī)院感染科，廣東 廣州 510000)

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·論著·

過(guò)表達(dá)IL-17RLM的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用*

郭婧1，晁康1，唐健1，王培培2，高翔1△

(中山大學(xué)1附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)科，2附屬第三醫(yī)院感染科，廣東 廣州 510000)

[摘要]目的： 研究過(guò)表達(dá)白細(xì)胞介素17受體樣分子的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(IL-17RLM-hUCMSCs)對(duì)三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，為炎癥性腸病的干細(xì)胞治療提供優(yōu)化的種子細(xì)胞。方法: 體外分離培養(yǎng)hUCMSCs，利用慢病毒載體向干細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入IL-17RLM基因，構(gòu)建IL-17RLM-hUCMSCs。采用TNBS誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，無(wú)菌取炎癥小鼠脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，在刀豆蛋白A (ConA)刺激下將淋巴細(xì)胞分別與不同濃度的IL-17RLM-hUCMSCs及hUCMSCs共培養(yǎng)，72 h后以淋巴細(xì)胞+ConA為陽(yáng)性對(duì)照，CCK8法及CFSE標(biāo)記法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖情況；同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群(Th1、Th2、Th17及Treg)比例的改變。結(jié)果: hUCMSCs及IL-17RLM-hUCMSCs均對(duì)ConA刺激下的淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用(P<0.05)；當(dāng)MSCs/淋巴細(xì)胞為1∶1～1∶10時(shí)，MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。在有效濃度范圍內(nèi)，IL-17RLM-hUCMSCs較hUCMSCs抑制作用更強(qiáng)(P<0.05)。hUCMSCs及IL-17RLM-hUCMSCs均能夠下調(diào)結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的Th1和Th17細(xì)胞亞群比例，上調(diào)Treg細(xì)胞亞群比例，但I(xiàn)L-17RLM-hUCMSCs對(duì)Th17細(xì)胞亞群的抑制作用更顯著(P<0.05)。結(jié)論: IL-17RLM-hUCMSCs 呈濃度依賴性地抑制TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，且該作用優(yōu)于hUCMSCs。同時(shí)，IL-17RLM-hUCMSCs可調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群的免疫平衡，且抑制Th17細(xì)胞亞群作用強(qiáng)于hUCMSCs。

[關(guān)鍵詞]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 白細(xì)胞介素17受體樣分子； 淋巴細(xì)胞； 免疫調(diào)節(jié)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種病因不明的慢性、復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)及潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，目前尚無(wú)理想的治療手段，是消化領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)之一。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因具有來(lái)源廣泛、易于體外擴(kuò)增、低免疫原性及具有組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)等作用成為細(xì)胞治療的優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSCs治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型后反映全身炎癥狀態(tài)的脾臟淋巴細(xì)胞免疫紊亂得以糾正[1]，小樣本的臨床研究亦發(fā)現(xiàn)，MSCs對(duì)炎癥性腸病具有治療作用[2]，但仍具爭(zhēng)議，種子細(xì)胞的來(lái)源、培養(yǎng)、優(yōu)化及作用機(jī)制等方面尚需進(jìn)一步探討。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)是近年新興的種子細(xì)胞，與傳統(tǒng)骨髓來(lái)源的MSCs相比，具有操作無(wú)創(chuàng)、取材方便、更易于體外擴(kuò)增及倫理問(wèn)題少等優(yōu)勢(shì)，但目前在IBD治療方面的研究尚少。

目前認(rèn)為遺傳易感人群在環(huán)境因素刺激下誘發(fā)的自體免疫紊亂是IBD主要機(jī)制[3]，其中炎癥通路的激活是核心環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，CD患者的Th17細(xì)胞數(shù)是正常對(duì)照組的20倍，是非活動(dòng)性CD患者的4倍，活動(dòng)期CD患者Th17細(xì)胞分布貫穿了黏膜層、黏膜下層以及肌層[4]；在活動(dòng)期CD患者中，IL-17的表達(dá)明顯上調(diào)，并且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5]，提示其參與IBD的發(fā)病。而抗IL-17單克隆抗體治療可顯著抑制結(jié)腸炎的發(fā)生[6]，提示阻斷IL-17通路在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎動(dòng)物模型中顯示出治療作用。IL-17主要由CD4+T細(xì)胞分泌，其家族包括6個(gè)成員(IL-17A～F)。當(dāng)IL-17與其受體IL-17R結(jié)合并激活該通路時(shí)，導(dǎo)致趨化因子、集落刺激因子和黏附分子的表達(dá)或釋放，招募和激活炎癥細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞，從而介導(dǎo)炎癥并與多種細(xì)胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用放大炎癥反應(yīng)。2003年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了IL-17受體樣分子(IL-17 receptor-like molecule, IL-17RLM或Sef)[7]，其主要為IL-17受體樣蛋白與可溶性Fc受體的融合蛋白，是一種單跨膜細(xì)胞因子受體，N末端還有1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)較長(zhǎng)的胞漿結(jié)構(gòu)域，其較長(zhǎng)的胞漿結(jié)構(gòu)域還含有1個(gè)潛在的SH3互相作用結(jié)構(gòu)域和眾多的酪氨酸磷酸化部位，在胞漿臨膜區(qū)含有1個(gè)Toll/IL-1受體樣結(jié)構(gòu)域。IL-17RLM通過(guò)與IL-17R相互作用可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-17[8]，阻斷IL-17與其受體結(jié)合以調(diào)控IL-17，為治療IL-17通路激活導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病提供了新的切入點(diǎn)。

鑒于阻斷IL-17通路和MSCs對(duì)炎癥性腸病均有治療作用，我們?cè)O(shè)想將針對(duì)IL-17的靶向治療與細(xì)胞移植治療結(jié)合，將MSCs進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建具有雙重作用的種子細(xì)胞，增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)功能，為炎癥性腸病的干細(xì)胞治療提供更優(yōu)的種子細(xì)胞。因此，本研究構(gòu)建過(guò)表達(dá)IL-17RLM基因的hUCMSCs細(xì)胞系，觀察其對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步使用該細(xì)胞治療IBD提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1材料

正常剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn)的臍帶標(biāo)本均來(lái)自中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院產(chǎn)科，乙肝5項(xiàng)、HCV、HIV、梅毒等其它相關(guān)傳染性指標(biāo)均呈陰性；BALB/c小鼠，SPF級(jí)，6～8周齡，雄性，體重18～22 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前于中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物中心檢測(cè)5～7 d。

2主要試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)、絲裂霉素C、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、離子霉素(ionomycin)和三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)均購(gòu)自Sigma；CCK-8試劑盒(Dojindo)；CFSE細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Invitrogen)；流式抗體CD29-PE-Cy5、CD44-PE、CD34-PE、CD45-PE-Cy5、CD105-PE、HLA-DR-PE-Cy5、CD3-FITC、CD8-APC、CD4-FITC、CD25-APC、IFN-γ-PE-Cy7、IL-4-PE、IL-17A-PE、Foxp3-PE、固定/破膜試劑盒及流式細(xì)胞儀(BD)；倒置顯微鏡(Olympus)；熒光顯微鏡(Leica)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher)。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定無(wú)菌條件下取臍帶標(biāo)本，用PBS充分沖洗并將其剪碎至1～2 mm3大小組織塊，置于T75培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2飽和度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)鏡下觀察組織塊周圍有成纖維狀細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，去除組織塊，添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。約20 d后細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后按1∶3傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3～5代細(xì)胞參考國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(ISCT)確定的 MSCs判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]和國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。利用熒光標(biāo)記CD34、CD44、CD45、CD29、CD105、HLA-DR等抗體染色，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表型鑒定。成脂誘導(dǎo)加1 μmol/L地塞米松、10 mg/L 胰島素、0.5 mmol/L IBMX和200 mmol/L吲哚美辛，每3 d 換液一次培養(yǎng)4 周，第 21天油紅O染色鏡檢。成骨誘導(dǎo)加0.1 mmol/L地塞米松、50 mmol/L抗壞血酸和10 mmol/L β-磷酸甘油，隔3 d 換液培養(yǎng)4周，茜素紅染色鑒定。

3.2過(guò)表達(dá)IL-17RLM人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備分析所需合成的IL-17RLM基因全序列，將擴(kuò)增的IL-17RLM基因連入慢病毒表達(dá)載體(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)并進(jìn)行包裝(以上委托上海吉?jiǎng)P基因公司制備)。hUCMSCs用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按每孔2×104接種于24孔板，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，第2天用培養(yǎng)基(含5 mg/L polybrene)按MOI=1、5、10、50、100和200稀釋慢病毒，去除舊培養(yǎng)基，加入0.5 mL稀釋的病毒液以感染h-UCMSCs，同時(shí)做eGFP陽(yáng)性對(duì)照的轉(zhuǎn)導(dǎo)。感染12 h后更換常規(guī)培養(yǎng)基，72 h后熒光顯微鏡觀察eGFP表達(dá)情況，并開始藥物篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)IL-17RLM的mRNA及蛋白表達(dá)情況。以β-actin為內(nèi)參照，以不攜帶IL-17RLM基因的慢病毒感染的細(xì)胞為陰性對(duì)照，qPCR檢測(cè)目的基因IL-17RLM表達(dá)，檢測(cè)用引物序列如下：β-actin: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’ (forward)，5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(reverse)；IL-17RLM: 5’-GTGCCCAGCA CCTGAATTCGA-3’(forward)，5’-TGAGGACGCTGACCACACGGT-3’(reverse)。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán);60 ℃～95 ℃熔解曲線分析。

3.3TNBS誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的制備取6～8周齡雄性BALB/c小鼠，按參考文獻(xiàn)[10]的方法，經(jīng)皮膚致敏7 d后用2.5 mg TNBS(50%乙醇溶解)溶液100 μL灌腸誘導(dǎo)結(jié)腸炎，每天觀察小鼠的一般情況(體重、大便性狀和大便出血情況)，于灌腸第3 天(此時(shí)炎癥反應(yīng)最明顯)無(wú)菌摘取小鼠脾臟，用注射器內(nèi)芯輕輕研磨脾臟組織至分散成單個(gè)細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞并用濾網(wǎng)過(guò)濾后制成淋巴細(xì)胞懸液備用。

3.4共培養(yǎng)體系的制備以方法 3.3中分離的淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞(T)，第3～5代hUCMSCs和IL-17RLM-hUCMSCs(預(yù)先用絲裂霉素于37 ℃預(yù)處理30 min，抑制其過(guò)度分化)作為效應(yīng)細(xì)胞(E)。將一定濃度的靶細(xì)胞與相應(yīng)不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，并且設(shè)置對(duì)照組(即淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組)。

3.5CCK-8法檢測(cè)共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞活力按MSCs/淋巴細(xì)胞=1∶1、1∶5、1∶10、1∶50和1∶100濃度將MSCs接種于96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其充分貼壁后，將按方法3.3分離的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞每孔1×105接種于絲裂霉素C預(yù)處理的MSCs上，并加入2.5 mg/L ConA刺激淋巴細(xì)胞增殖。以單獨(dú)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞為陰性對(duì)照，淋巴細(xì)胞+ConA為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè)3復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，收集各孔懸浮細(xì)胞，洗滌后移至另一96孔板中，每孔200 μL，設(shè)200 μL培養(yǎng)液為空白對(duì)照孔，每孔加CCK-8 10 μg，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在450 nm波長(zhǎng)處用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度(A)，并計(jì)算淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)及生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)指數(shù)/陽(yáng)性對(duì)照組生長(zhǎng)指數(shù))×100%，其中生長(zhǎng)指數(shù)=(A實(shí)驗(yàn)組或陽(yáng)性對(duì)照組-A空白對(duì)照組)/(A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)照組)。

3.6CFSE標(biāo)記法檢測(cè)共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞增殖情況按3.5的方法接種MSCs，取按方法3.3分離的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，用 RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×1010/L，加入5 μmol/L 的CFSE試劑，充分混勻后 37 ℃反應(yīng) 10 min，離心棄上清，用含 10% FBS 的 RMPI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃ 封閉 10 min，PBS 洗2次后每孔1×105個(gè)接種于絲裂霉素C預(yù)處理的MSCs上，加入2.5 mg/L ConA刺激淋巴細(xì)胞增殖，以單獨(dú)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞為陰性對(duì)照，淋巴細(xì)胞+ConA為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè)3復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后收集各孔懸浮細(xì)胞，以相同來(lái)源的未經(jīng) CFSE 標(biāo)記的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞的CFSE熒光強(qiáng)度。

3.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)后各淋巴細(xì)胞亞群比例的變化按不同比例加入小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和MSCs至24孔培養(yǎng)板(淋巴細(xì)胞約每孔1×106個(gè)，MSCs/淋巴細(xì)胞比例為1∶1和1∶10)，調(diào)整體積至1 mL，分組檢測(cè)Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞比例。用于檢測(cè)Th1/Th2/Th17的細(xì)胞加入PMA(100 μg/L)、ionomycin(1 mg/L)和GolgiStop(0.7 mg/L)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱刺激4 h，收集淋巴細(xì)胞懸液，PBS清洗后加入CD3-FITC、CD8-APC抗體孵育30 min，接著按固定/破膜試劑盒說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞固定和破膜，再分別加入抗IFN-γ-PE-Cy7、IL-4-PE和IL-17A-PE抗體，染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)；用于Treg檢測(cè)的細(xì)胞無(wú)需刺激，直接收集淋巴細(xì)胞懸液，PBS清洗后加入CD4-FITC和CD25-APC抗體孵育30 min，固定破膜后加入抗Foxp3-PE 抗體，染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)：CD3+CD8-IFN-γ+為Th1細(xì)胞群；CD3+CD8-IL-4+為Th2細(xì)胞群；CD3+CD8-IL-17A+為Th17細(xì)胞群；CD4+CD25+Foxp3+為Treg細(xì)胞群。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件，根據(jù)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)或者中位數(shù)及四分位數(shù)間距對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。根據(jù)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)或者成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組變量之間的比較，分組多于兩組時(shí)根據(jù)是否符合方差齊性的條件采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或方差分析進(jìn)行組間比較，進(jìn)一步采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1hUCMSCs形態(tài)學(xué)觀察

組織塊貼壁1周后可見貼壁組織塊周圍有長(zhǎng)梭形成纖維樣細(xì)胞向外游出，約15～20 d細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，細(xì)胞傳代后形態(tài)多為梭形或三角形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞由松散變?yōu)榫o密細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榫坏募忓N形，呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)，經(jīng)傳代10次后，細(xì)胞仍較有活力，以1∶3傳代在72 h內(nèi)可長(zhǎng)滿，形態(tài)亦多呈長(zhǎng)梭性，呈極性排列,見圖1A。

2表面分子鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，約90%細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)抗原如CD29、CD44和CD105，但不表達(dá)造血細(xì)胞系的表面抗原如CD34、CD45和HLA-DR，說(shuō)明hUCMSCs具有低免疫原性，見圖1B。

Figure 1.Identification of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs). A: morphological changes in hUCMSCs at passage 3 (P3) and passage 5 (P5); B: detection of the surface molecules of hUCMSCs by flow cytometry; C: adipogenic differentiation of hUCMSCs (P5)invitro(oil red O staining,×400); D: osteogenic differentiation of hUCMSCs (P5)invitro(alizarin red staining).

圖1hUCMSCs形態(tài)學(xué)變化及鑒定

3體外誘導(dǎo)分化能力

3.1成脂分化加入hUCMSCs成脂誘導(dǎo)液，約21 d后脂滴形成但數(shù)量較少，繼續(xù)誘導(dǎo)，脂滴有少量的增加和增大，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或多邊形，見圖1C。

3.2成骨分化加入hUCMSCs成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)第5天，細(xì)胞呈多角形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多；第8天，胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積；第21天，細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，見圖1D。

4通過(guò)慢病毒感染實(shí)現(xiàn)IL-17RLM對(duì)hUCMSCs的基因修飾

過(guò)表達(dá)IL-17RLM慢病毒感染后4 d，倒置熒光顯微鏡觀察，在MOI=100的條件下感染12 h為最佳。同時(shí)以不攜帶IL-17RLM基因的慢病毒感染作為陰性對(duì)照，72 h后檢測(cè)目的基因IL-17RLM的表達(dá)量，qPCR結(jié)果顯示hUCMSCs組和陰性對(duì)照組目的基因未見表達(dá)，攜帶IL-17RLM基因慢病毒感染組可見目的基因表達(dá)，見表1。免疫熒光檢測(cè)目的蛋白表達(dá)可見紅色熒光為IL-17RLM，綠色熒光為轉(zhuǎn)染攜帶的eGFP，見圖2。

5CCK8法檢測(cè)IL-17RLM-hUCMSCs對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活力的抑制作用

從表2可以看出，在與MSCs共培養(yǎng)的條件下，ConA刺激的淋巴細(xì)胞活力受到抑制，MSCs/淋巴細(xì)胞為 1∶1～1∶10時(shí)生長(zhǎng)指數(shù)降低(P<0.01)，且該抑制作用呈現(xiàn)對(duì)MSCs 濃度的依賴，hUCMSCs濃度越高，其抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用越明顯；當(dāng)MSCs/淋巴細(xì)胞為1∶50～1∶100時(shí)，MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。而圖3顯示當(dāng)MSCs/淋巴細(xì)胞為1∶1～1∶10時(shí)，有IL-17RLM基因修飾的hUCMSCs表現(xiàn)出較hUCMSCs更好的抑制效果(P<0.05)。

表1慢病毒感染后IL-17RLM mRNA的表達(dá)

Table 1.The expression of IL-17RLM mRNA in the cells after lentivirus infection (Mean±SD.n=3)

Figure 2.The expression of IL-17RLM protein in the cells after lentivirus infection. A: observation under fluorescence microscope 4 d after lentivirus infection (×200); B: the expression of IL-17RLM in the cells after lentivirus infection (×100).

圖2慢病毒感染后IL-17RLM 蛋白的表達(dá)

表2CCK-8法和CFSE標(biāo)記法檢測(cè)MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用

Table 2.Inhibitory effects of mesenchymal stem cells on the proliferation of lymphocytes by the methods of CCK8 assay and CFSE labeling (Mean±SD.n=3)

*P<0.05,**P<0.01vslymphocytes+ConA group;#P0.05,##P<0.01vshUCMSCs+lymphocytes+ConA group.

Figure 3.The inhibitory effects of IL-17RLM-hUCMSCs and hUCMSCs on the viability of lymphocytes detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vshUCMSCs+lymphocytes+ConA group

圖3CCK8法比較相同濃度IL-17RLM-hUCMSCs與hUCMSCs對(duì)淋巴細(xì)胞活力的抑制作用

6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFSE標(biāo)記的結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖情況

結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增值率低；經(jīng)ConA激活后，細(xì)胞增殖率明顯升高；淋巴細(xì)胞與MSCs 共培養(yǎng)后，當(dāng)MSCs/淋巴細(xì)胞為1∶50～1∶100時(shí)，MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用；當(dāng)MSCs/淋巴細(xì)胞為1∶1～1∶10時(shí)，hUCMSCs可抑制淋巴細(xì)胞的增殖，且該抑制作用呈濃度依賴性，MSCs 濃度越高，其抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用越明顯見圖4、5。而圖6顯示當(dāng)MSCs/淋巴細(xì)胞為1∶1～1∶5時(shí)，IL-17RLM基因修飾的hUCMSCs表現(xiàn)出較hUCMSCs更好的抑制效果(P<0.05)，這與用CCK-8法檢測(cè)的結(jié)果相符(表2)。

7IL-17RLM-hUCMSCs對(duì)結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群百分比的影響

圖7及表3結(jié)果分析可見MSCs 對(duì)Th1和Th17細(xì)胞亞群有抑制作用并具有量效關(guān)系(P<0.05)；圖8及表3結(jié)果可見MSCs對(duì)Treg細(xì)胞亞群則具有上調(diào)作用，但未表現(xiàn)出量效差異；而對(duì)Th2細(xì)胞亞群無(wú)顯著影響(圖9)。在有作用差異的Th1、Th17和Treg細(xì)胞亞群中比較IL-17RLM-hUCMSCs與hUCMSCs作用效果，圖9顯示當(dāng)MSCs/淋巴細(xì)胞為1∶1時(shí)IL-17RLM-hUCMSCs對(duì)Th17細(xì)胞亞群的抑制作用更為顯著(P<0.05)，而對(duì)Th1和Treg細(xì)胞亞群作用的差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；當(dāng)MSCs/淋巴細(xì)胞為1∶10時(shí)，IL-17RLM-hUCMSCs和hUCMSCs對(duì)Th1、Th17和Treg細(xì)胞亞群作用的差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 4.The effect of IL-17RLM-hUCMSCs on the proliferation of CFSE-labeled lymphocytes detected by flow cytometry analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vslymphocytes+ConA group.

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-17RLM-hUCMSCs對(duì)CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞增殖的影響

Figure 5.The effect of hUCMSCs on the proliferation of CFSE-labeled lymphocytes detected by flow cytometry analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vslymphocytes+ConA group.

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hUCMSCs對(duì)CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞增殖的影響

Figure 6.The effects of IL-17RLM-hUCMSCs and hUCMSCs on the proliferation of CFSE-labeled lymphocytes. Mean±SD.n=3.#P<0.05vshUCMSCs+lymphocytes+ConA group.

圖6比較相同濃度IL-17RLM-hUCMSCs與hUCMSCs對(duì)CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞增殖的影響

討論

目前研究發(fā)現(xiàn)hUCMSCs具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用，且其作用不受主要組織相容性復(fù)合物的限制，不須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格配對(duì)使用，可用于不同個(gè)體之間的移植[11-12]。hUCMSCs因易于獲得及體外易于擴(kuò)增而成為新興的優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)將hUCMSCs與人外周血T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制 T 淋巴細(xì)胞的增殖及γ-干擾素的分泌，提示hUCMSCs可以通過(guò)抑制Th1型細(xì)胞因子分泌來(lái)減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13]，但該類研究較少，且各研究建立的反應(yīng)體系不同，實(shí)驗(yàn)方法差異較大，研究結(jié)論不統(tǒng)一。本實(shí)驗(yàn)采用炎癥性腸病的經(jīng)典動(dòng)物模型——TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型[14]，觀察hUCMSCs對(duì)異體脾臟淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)hUCMSCs可明顯抑制ConA刺激的炎癥小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，該抑制作用表現(xiàn)為對(duì)hUCMSCs的濃度依賴性，hUCMSCs濃度越高，其抑制作用越強(qiáng)，且其抑制作用基本局限在 hUCMSCs/淋巴細(xì)胞為 1∶1～1∶10的范圍，當(dāng)hUCMSCs濃度進(jìn)一步降低時(shí)未表現(xiàn)出對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。體外共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫平衡，這與近年來(lái)hUCMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用研究結(jié)果相符。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)在人臍帶中hUCMSCs的收獲量較骨髓來(lái)源更高，相較其它來(lái)源的MSCs其取材更為方便、對(duì)供者無(wú)損傷、不受倫理限制，易于外源基因轉(zhuǎn)染并能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，在有限擴(kuò)增后其生物學(xué)特性能夠保持不變，提示hUCMSCs作為種子細(xì)胞在細(xì)胞治療方面的應(yīng)用前景。

*P<0.05,**P<0.01vslymphocytes group.

Figure 7.The effect of mesenchymal stem cells on the proportion of Th1, Th2 and Th17 subsets of spleen lymphocytes in the mice with TNBS-induced colitis determined by flow cytometry analysis. A: the proportion of Th1, Th2 and Th17 subsets of spleen lymphocytes in mice with TNBS-induced colitis; B: the effect of mesenchymal stem cells on the proportion of Th1, Th2 and Th17 subsets of spleen lymphocytes in mice with TNBS-induced colitis.

圖7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Th1、Th2和Th17細(xì)胞亞群的影響

Figure 8.The effect of mesenchymal stem cells on the proportion of Treg subsets of spleen lymphocytes in mice with TNBS-induced colitis determined by flow cytometry analysis.

圖8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Treg細(xì)胞亞群的影響

同時(shí)，我們將這一新興的細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化，開創(chuàng)性地引入靶向治療與細(xì)胞治療相結(jié)合的新設(shè)想，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)IL-17RLM的hUCMSCs，觀察其對(duì)結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)在有效濃度范圍內(nèi)，IL-17RLM-hUCMSCs可明顯抑制ConA刺激的炎癥小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，且可以下調(diào)Th1、Th17細(xì)胞比例，上調(diào)Treg細(xì)胞比例，使Th1/Th2降低，Treg/Th17升高，提示IL-17RLM基因修飾的hUCMSCs仍能保持干細(xì)胞原有的免疫調(diào)節(jié)特性。此外，IL-17RLM-hUCMSCs對(duì)結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖表現(xiàn)出較hUCMSCs更強(qiáng)的抑制效果。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IL-17RLM-hUCMSCs可且對(duì)Th17細(xì)胞的下調(diào)作用更為明顯，提示IL-17RLM基因修飾的hUCMSCs在具備干細(xì)胞原有免疫調(diào)節(jié)作用的同時(shí)，可產(chǎn)生IL-17RLM與IL-17R相互作用，影響內(nèi)源性IL-17與其受體結(jié)合，從而抑制IL-17對(duì)下游炎癥因子及趨化因子的激活從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

Figure 9.The effect of mesenchymal stem cells on the proportion of T lymphocyte subsets. A: the effects of different concentrations of IL-17RLM-hUCMSCs on the proportion of T lymphocyte subsets; B: the effects of different concentrations of hUCMSCs on the proportion of T lymphocyte subsets; C: the effects of IL-17RLM-hUCMSCs and hUCMSCs on the proportion of T lymphocyte subsets when MSCs/lymphocytes=1∶1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsIL-17RLM-hUCMSCs+lymphocytes (1∶10) group;#P<0.05vshUCMSCs+lymphocytes group.

圖9MSCs對(duì)炎癥小鼠脾臟T細(xì)胞亞群比例的影響。

綜上所述，IL-17RLM-hUCMSCs在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠脾臟淋巴細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，且優(yōu)于hUCMSCs，可能成為炎癥性腸病細(xì)胞治療的優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞，但本實(shí)驗(yàn)僅限于體外研究，進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究尚需進(jìn)行。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Immunomodulatory effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells with interleukin-17 receptor-like molecule overexpression on spleen lymphocytes from mice with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis

GUO Jing1, CHAO Kang1, TANG Jian1, WANG Pei-pei2, GAO Xiang1

(1DepartmentofGastroenterology,TheSixthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity;2DepartmentofInfectiousDiseases,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510000,China.E-mail:helengao818@163.com)

[KEY WORDS]Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Interleukin-17 receptor-like molecule; Lymphocytes; Immunomodulation

[ABSTRACT]AIM: To investigate the immunomodulatory effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells with interleukin-17 receptor-like molecule overexpression (IL-17RLM-hUCMSCs) on the spleen lymphocytes from the mice with trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis for providing optimal seed cells to treat inflammatory bowel disease. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from human umbilical cord. TheIL-17RLMgene was transferred into mesenchymal stem cells by lentivirus vector to establish IL-17RLM-hUCMSCs. The experimental colitis mice were induced by TNBS enema, and the spleen lymphocyte suspension was isolated. The lymphocytes were co-cultured with different concentrations of IL-17RLM-hUCMSCs and hUCMSCs under the stimulation of concanavalin A (ConA) for 72 h. The proliferation of lymphocytes was detected by the methods of CCK8 assay and CFSE labeling with lymphocytes+ConA as positive control. The changes of lymphocyte subsets (Th1, Th2, Th17 and Treg) were examined by flow cytometry.RESULTS: Both hUCMSCs and IL-17RLM-hUCMSCs inhibited T-cell proliferationinvitroco-culture system (P<0.05). When the ratios of MSCs to lymphocytes ranged from 1∶1 to 1∶10, the inhibitory rates were in a dose-dependent manner. IL-17RLM-hUCMSCs showed higher inhibitory rate than hUCMSCs within the effective concentration range (P<0.05). Both hUCMSCs and IL-17RLM-hUCMSCs reduced the proportions of Th1 and Th17 cell subsets and increased Treg cell population of spleen lymphocytes from TNBS-induced colitis mice, and IL-17RLM-hUCMSCs showed a stronger inhibitory effect on Th17 cell subset (P<0.05). CONCLUSION: IL-17RLM-hUCMSCs remarkably inhibit the proliferation of spleen lymphocytes from TNBS-induced colitis mice in a dose-dependent manner. Meanwhile, they regulate immune balance of T cells and have stronger inhibitory effect on Th17 subset.

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 0961- 10

[收稿日期]2016- 02- 17[修回日期] 2016- 05- 09

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No．81370498)

通訊作者△Tel： 020-38254101； E-mail： helengao818@163.com

[中圖分類號(hào)]R392.32

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.001