葡萄白粉病抗性鑒定方法優(yōu)化及品種抗性評(píng)價(jià)

賈靜怡 張瑋 燕繼曄 徐海英 孫磊 李興紅

摘要 ：本研究通過對(duì)葉盤保濕方法的改進(jìn)，不同菌源接種后發(fā)病嚴(yán)重度的分析，抗、感病對(duì)照品種的確定，建立了一種更為便捷、可靠、穩(wěn)定的葡萄白粉病室內(nèi)抗性鑒定方法：取葡萄藤自上而下第2～4片幼嫩葉片，打取直徑15 mm的葉盤置于1.5%水瓊脂平板進(jìn)行保濕，采集田間菌源直接制備孢子濃度為2×105個(gè)/mL的孢子懸浮液接種，選定抗、感病葡萄品種做對(duì)照，14 d即可完成抗性鑒定。采用此方法對(duì)11個(gè)葡萄品種（品系）進(jìn)行了葡萄白粉病抗性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：供試的11個(gè)品種（品系）對(duì)葡萄白粉病的抗性存在明顯差異，其中高感品種為‘巨峰‘夏黑和‘陽光玫瑰等，感病品種為‘玫瑰香和‘馬瑟蘭，抗病品種為‘瑞都科美和‘無核翠寶，高抗品種為‘北冰紅。試驗(yàn)結(jié)果為葡萄抗病品種的選育及利用提供了方法和基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 ：葡萄白粉病; 品種; 抗性鑒定

中圖分類號(hào)： S 436.631.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019630

Optimization of grapevine powdery mildew resistance identification methods and evaluation of variety resistance

JIA Jingyi1，2， ZHANG Wei1， 2， YAN Jiye1， 2， XU Haiying3， SUN Lei3， LI Xinghong1， 2*

（1. Institute of Plant Protection and Environmental Protection，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，

Beijing 100097， China; 2. Beijing Key Laboratory for Environment Friendly Management on Fruit Diseases and Pests in

North China， Beijing 100097， China; 3. Beijing Academy of Forestry and Pomology Sciences， Beijing 100093， China）

Abstract ：Through the improvement of leaf disc moisturization methods， analysis of the severity of disease after inoculation with different strains， and identification of resistant and susceptible varieties， a more convenient， reliable and stable laboratory resistance identification method on grapevine powdery mildew was established. The method is as follows： collect the 2-4 young leaves of the vine from top to bottom， make leaf discs using a borer with 15 mm diameter， place the leaf discs on a 1.5% water agar plate for moisturizing purpose， prepare the spore suspension directly with the conidia on the diseased leaves collected from the field， inoculate at the concentration of 2×105 conidia/mL， select resistant and susceptible grape varieties as the control， and resistance identification could be completed within 14 days. Resistance evaluation of 11 grape varieties （lines） to grapevine powdery mildew by this method showed that the resistance of the tested 11 varieties （lines） was significantly different. The highly susceptible varieties were ‘Kyoho ‘Summer Black ‘Shine Muscat etc.， the susceptible varieties were ‘Muscat and ‘Marselan， the resistant varieties were ‘Ruidu Kemei and ‘Nuclear Cuibao， the highly resistant variety was ‘Arctic Red. The resistant evaluation results provide method and basic reference data for screening and utilization of grapevine powdery resistant varieties.

Key words ：grapevine powdery mildew; variety; resistance identification

葡萄是世界上種植最廣泛的水果作物之一[1]。國(guó)際葡萄與葡萄酒組織OIV（Organisation Internationale de la Vigne et du Vin）發(fā)布的《2017年全球葡萄種植面積分析及預(yù)測(cè)》顯示，截至2017年，世界葡萄種植面積約為760萬hm2，我國(guó)葡萄種植面積約為87萬hm2。而我國(guó)主要的栽培品種一般對(duì)真菌病害的抗性表現(xiàn)不佳[2]。葡萄白粉病（grapevine powdery mildew）是葡萄栽培中最重要的真菌病害之一，在歐洲葡萄種植歷史上與葡萄霜霉病（grapevine downy mildew）和葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae Fitch并為三大病蟲害，曾導(dǎo)致法國(guó)的葡萄酒生產(chǎn)減產(chǎn)80%[3]。葡萄白粉病由白粉菌Erysiphe necator引起，可危害葡萄葉片、莖、果實(shí)等，除導(dǎo)致大幅減產(chǎn)外，還會(huì)影響果實(shí)及葡萄酒的品質(zhì)[46]。目前化學(xué)防治仍是國(guó)內(nèi)葡萄真菌病害防治的主要措施，其缺點(diǎn)為病原菌易產(chǎn)生抗藥性，并且產(chǎn)生農(nóng)藥殘留和污染環(huán)境。選育抗病品種等無污染防治措施是現(xiàn)今研究的重點(diǎn)課題，因其便捷、經(jīng)濟(jì)、有效的特點(diǎn)成為控制葡萄白粉病大面積暴發(fā)的有效途徑[78]。盡管我國(guó)主栽葡萄品種對(duì)白粉病的抗性較差，但是不同品種間存在抗、感差異，探究可靠的葡萄白粉病抗性鑒定方法可在一定程度上對(duì)抗病品種的快速選育起到重要作用[9]。目前國(guó)內(nèi)已有的抗性鑒定方法有田間自然發(fā)病鑒定、田間人工接種鑒定和室內(nèi)離體葉圓片（葉盤）接種鑒定。不同鑒定方法獲得的抗性結(jié)果存在顯著的一致性[911]。但是田間接種鑒定所需發(fā)病時(shí)間都較長(zhǎng)，對(duì)大量葡萄品種進(jìn)行快速抗病性鑒定耗時(shí)、耗力，而室內(nèi)離體葉圓片接種鑒定方法穩(wěn)定性較差[12]。本試驗(yàn)在已有鑒定方法的基礎(chǔ)上，對(duì)接種不同菌源后發(fā)病情況進(jìn)行比較，并對(duì)試驗(yàn)方法的可行性及穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為葡萄白粉病抗性品種的評(píng)價(jià)提供一種快速和可靠的鑒定方法，從而提高抗病品種的評(píng)價(jià)和選育效率。本試驗(yàn)還用此方法對(duì)生產(chǎn)上的主栽葡萄品種和新培育品種（品系）進(jìn)行了抗病性鑒定，為抗病品種的選育及利用提供了基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌源

在北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院葡萄資源圃采集感染白粉病菌的新鮮病葉帶回實(shí)驗(yàn)室，作為接種體備用。

1.1.2 供試葡萄品種

抗、感對(duì)照篩選品種：歐亞種‘里扎馬特和‘京秀為生產(chǎn)中較感病品種;歐亞種和圓葉葡萄雜交后代‘R23‘Ms2731由北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院初步確定為抗病品種。供試接種葉片采自北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院葡萄資源圃健康植株。

抗病性鑒定品種：歐亞種有‘瑞都紅玉‘瑞都紅玫‘無核翠寶‘早黑寶‘玫瑰香‘馬瑟蘭‘瑞都科美;歐美雜種有‘陽光玫瑰‘夏黑‘巨峰;山歐雜種有‘北冰紅。供試接種葉片采自北京市海淀區(qū)、昌平區(qū)、延慶區(qū)、順義區(qū)的葡萄采摘園及葡萄資源圃健康植株。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.5%水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種體培養(yǎng)方法

1.2.1.1 田間采集

田間采集葡萄白粉病新鮮病葉，在體視顯微鏡下觀察菌斑，挑選分生孢子梗較直立、透明，分生孢子串生的病葉。用無菌水潤(rùn)濕的脫脂棉包裹葉柄基部，置于密封袋中室溫保濕備用。待準(zhǔn)備好葉盤后于采集當(dāng)天完成接種。

1.2.1.2 離體葉片培養(yǎng)

從田間采集葡萄白粉病新鮮病葉，在體視顯微鏡下挑選出分生孢子梗較直立、透明，僅有1～2個(gè)分生孢子的白粉菌菌斑病葉放在長(zhǎng)方形保鮮盒中保濕培養(yǎng)。培養(yǎng)前用75%乙醇消毒的尼龍畫筆（筆毛寬2.5 mm）輕輕刷掉菌斑上的老熟分生孢子。在長(zhǎng)方形保鮮盒底部鋪放兩層濾紙和一層衛(wèi)生紙加適量無菌水潤(rùn)濕，將傾斜剪去葉柄基部的病葉插入潤(rùn)濕的衛(wèi)生紙。再用噴壺向葉片上方噴霧（勿直接對(duì)準(zhǔn)葉片噴霧），使葉片表面均勻覆蓋細(xì)小霧滴，而無明顯水滴。最后用保鮮膜密封，放置（25±1）℃、相對(duì)濕度（60±10）%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，葉面長(zhǎng)出分生孢子備用。

1.2.2 接種體（孢子懸浮液）的制備

將田間采集的菌源或離體葉片培養(yǎng)的菌源在體視顯微鏡下鏡檢，觀察分生孢子生長(zhǎng)情況。用尼龍畫筆將菌斑上的分生孢子刷至裝有無菌水的1.5 mL離心管，混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)至2×105個(gè)/mL備用。

1.2.3 接種葉盤的制備

選取葡萄藤自上而下第2～4片幼嫩葉片用于白粉病菌的接種。待接種葉片首先在體視顯微鏡下鏡檢，確保葉面無白粉菌菌落或菌絲后，用75%乙醇處理30 s，無菌水清洗3遍，然后用滅菌的濾紙吸干葉片表面的水分，用打孔器打取直徑15 mm的葉盤，均勻擺放在直徑9 cm玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)的水瓊脂培養(yǎng)基上。每皿擺放10個(gè)葉盤，葉正面朝上。

1.2.4 接種及培養(yǎng)

采用滴接法接種，用移液槍在每個(gè)葉盤中央接種20 μL孢子懸浮液，無菌水做空白對(duì)照。接種后2～3 min用無菌濾紙吸去葉盤表面的懸浮液，用封口膜封住培養(yǎng)皿，置于光照培養(yǎng)箱中25℃，L∥D=12 h∥12 h下培養(yǎng)14 d，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)葉盤，接種后每天觀察發(fā)病情況。試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.5 發(fā)病情況調(diào)查及統(tǒng)計(jì)

葉盤接種后14 d，用體視顯微鏡觀察所有接種葉盤的發(fā)病情況。按葉盤病斑面積的百分比進(jìn)行病害分級(jí)[13]，0級(jí)：無病斑;1級(jí)：病斑面積占葉盤面積的5%及以下;3級(jí)：病斑面積占葉盤面積的6%～25%;5級(jí)：病斑面積占葉盤面積的26%～50%;7級(jí)：病斑面積占葉盤面積的51%～75%;9級(jí)：病斑面積占葉盤面積的75%以上。按以下公式計(jì)算病情指數(shù)：

病情指數(shù)=∑（各級(jí)葉盤數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù)的代表值）/（總?cè)~盤數(shù)×最高級(jí)數(shù)的代表值）×100。

1.2.6 抗病性鑒定指標(biāo)

抗病性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照劉會(huì)寧等[12]的方法，分為5級(jí)，即免疫：病情指數(shù)0.00;高抗：病情指數(shù)0.10～5.00;抗?。翰∏橹笖?shù)5.01～25.00;感病：病情指數(shù)25.01～50.00;高感：病情指數(shù)50.00以上。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 21.0進(jìn)行差異顯著性分析，Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照品種的確定

以田間采集菌源作為接種體，采用葉盤法對(duì)‘里扎馬特‘京秀‘R23和‘Ms2731進(jìn)行抗、感對(duì)照品種的篩選。結(jié)果表明‘里扎馬特和‘京秀病情指數(shù)分別為75.56和86.67，為高感品種;‘R23和‘Ms2731病情指數(shù)均為0.00，為免疫品種，并且4個(gè)品種的重復(fù)性都較好。高感品種和免疫品種的發(fā)病情況有明顯差異，高感品種的葉盤上可產(chǎn)生較大面積，明顯的菌落，而免疫品種無菌落和孢子產(chǎn)生（圖1）。因此‘里扎馬特和‘京秀可作為抗病性鑒定中感病對(duì)照品種，‘R23和‘Ms2731為抗病對(duì)照品種。

2.2 接種體的確定

以田間采集菌源和離體培養(yǎng)菌源作為接種體，分別接種感病對(duì)照品種‘里扎馬特，進(jìn)行抗病性測(cè)定試驗(yàn)，比較接種體來源對(duì)抗性測(cè)定的影響。用田間采集菌源接種后病情指數(shù)為74.07±1.29，發(fā)病率為（100±0.00）%;離體培養(yǎng)菌源接種后病情指數(shù)為31.13±4.53，發(fā)病率為（87.83±5.27）%。結(jié)果表明離體培養(yǎng)菌源相較于田間采集菌源其病情指數(shù)及發(fā)病率均較低，且重復(fù)性差（圖2）。作為感病對(duì)照品種的‘里扎馬特葉盤，用離體培養(yǎng)菌源接種后的病情指數(shù)未能達(dá)到抗病性鑒定指標(biāo)的最高分級(jí)（高感），故后續(xù)不同葡萄品種對(duì)白粉病的抗性鑒定試驗(yàn)中使用田間采集菌源。

2.3 不同葡萄品種對(duì)白粉病的抗性鑒定

以田間采集菌源作為接種體，選取‘里扎馬特和‘R23分別作感病和抗病對(duì)照品種，采用離體葉盤法對(duì)11個(gè)葡萄品種（品系）進(jìn)行葡萄白粉病抗性鑒定。肉眼觀察結(jié)合體視顯微鏡的觀察結(jié)果表明：不同品種（品系）接種白粉病菌后葉盤發(fā)病面積存在較大差異（圖3）。在體視顯微鏡下可以清晰觀察到發(fā)病部位菌落的形態(tài)，以及病斑面積統(tǒng)計(jì)時(shí)肉眼難以觀察到的病斑菌落邊緣（圖4）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：病情指數(shù)區(qū)間為0.00～82.10，發(fā)病率區(qū)間為0.00%～100.00%?？共⌒澡b定指標(biāo)分級(jí)顯示高感品種為‘巨峰‘夏黑‘陽光玫瑰‘瑞都紅玉‘早黑寶和‘瑞都紅玫，占供試品種的54.54%;感病品種為‘玫瑰香和‘馬瑟蘭，占供試品種的18.18%;抗病品種為‘瑞都科美和‘無核翠寶，占供試品種的18.18%;高抗品種為‘北冰紅，占供試品種的9.09%（表1）。

3 結(jié)論與討論

李華等[9]曾報(bào)道可采用離體葉盤接種方法進(jìn)行葡萄白粉病品種抗性的室內(nèi)鑒定，但其接種發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)25 d后才進(jìn)行嚴(yán)重度觀察。劉會(huì)寧等[12]參照此方法進(jìn)行試驗(yàn)，兩周后出現(xiàn)葉盤干枯現(xiàn)象導(dǎo)致室內(nèi)試驗(yàn)無果。本研究對(duì)葡萄白粉病抗性鑒定方法進(jìn)行了優(yōu)化，接種后沒有選取常規(guī)的濾紙保濕方法，而是用水瓊脂平板對(duì)葉盤進(jìn)行保濕。經(jīng)對(duì)兩種方法比較后發(fā)現(xiàn)，葉盤在水瓊脂平板上連續(xù)放置兩周依舊保持新鮮。本試驗(yàn)用肉眼觀察結(jié)合體視顯微鏡鏡檢對(duì)葉盤發(fā)病等級(jí)進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)。直接用肉眼觀察葡萄白粉病在葉盤上的菌落較為模糊，而在體視顯微鏡下能清晰看到菌落的分生孢子梗及串生的分生孢子（圖4a），也能清楚觀察到病斑擴(kuò)展區(qū)的部分稀疏菌落（圖4b），使得調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。有報(bào)道表明，葡萄霜霉病菌不同代數(shù)的菌源存在致病性差異[1314]。但筆者通過文獻(xiàn)查閱并未發(fā)現(xiàn)有關(guān)葡萄白粉病菌的相關(guān)報(bào)道。本研究比較了田間采集菌源以及離體培養(yǎng)菌源的接種效果，發(fā)現(xiàn)用田間采集菌源直接接種后，在相同時(shí)間內(nèi)發(fā)病嚴(yán)重度高于離體培養(yǎng)菌源，能較快地進(jìn)行抗性測(cè)定，但并未進(jìn)行更多不同培養(yǎng)代數(shù)間的差異研究。并且本研究在進(jìn)行品種抗病性鑒定前，預(yù)先通過接種試驗(yàn)確定抗感病的對(duì)照品種，在對(duì)鑒定方法進(jìn)行驗(yàn)證的同時(shí)，也能對(duì)大量品種抗病性鑒定提供更加快速、可靠的發(fā)病嚴(yán)重度參照標(biāo)準(zhǔn)。

本研究通過葡萄白粉病抗病性鑒定方法的優(yōu)化，對(duì)11個(gè)生產(chǎn)上主栽葡萄品種和新培育品種（品系）進(jìn)行了白粉病抗性鑒定。其中‘巨峰‘瑞都紅玉‘早黑寶‘馬瑟蘭等為抗性較差品種，‘北冰紅為高抗品種，均與前人研究結(jié)果一致[1519]。本試驗(yàn)中歐美雜種‘陽光玫瑰和‘夏黑鑒定為高感品種，病情指數(shù)分別高達(dá)79.63和81.48，田間觀察也發(fā)現(xiàn)‘陽光玫瑰和‘夏黑白粉病發(fā)病嚴(yán)重，與室內(nèi)測(cè)定結(jié)果一致。但有研究表明這兩個(gè)品種為抗病品種[1921]，分析這可能與抗性鑒定方法不同等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。與此同時(shí)，在‘陽光玫瑰‘夏黑等白粉病高感品種的種植過程中，對(duì)白粉病的發(fā)生情況應(yīng)該予以關(guān)注。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）