中胚層分化蛋白2對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬功能的影響*

陳秀萍，　袁源智，　王歷陽，　袁　非

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院眼科，上海 200032)

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中胚層分化蛋白2對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬功能的影響*

陳秀萍，袁源智，王歷陽，袁非△

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院眼科，上海 200032)

[摘要]目的： 觀察中胚層分化蛋白2對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬功能的影響。方法: 采用人D407細(xì)胞和體外培養(yǎng)新生小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，加入不同劑量的純化中胚層分化蛋白2，通過共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)觀察視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)吞視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜的情況。結(jié)果: 中胚層分化蛋白2主要表達(dá)在視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜層，與視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜生物標(biāo)志物視紫紅質(zhì)完全共定位，純化的中胚層分化蛋白2可刺激人D407細(xì)胞及小鼠原代視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜，吞噬體生物標(biāo)志物Rab7與攝入的視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜共定位，D407細(xì)胞吞噬視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜與中胚層分化蛋白2的濃度呈劑量依賴性，但在達(dá)到飽和濃度后其吞噬能力下降，中胚層分化蛋白2可結(jié)合至視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜及D407細(xì)胞表面。結(jié)論: 中胚層分化蛋白2對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬功能有促進(jìn)作用。

[關(guān)鍵詞]中胚層分化蛋白2； 吞噬； 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞

吞噬(phagocytosis)是一個重要的生物學(xué)過程，可以清除凋亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片和有害代謝產(chǎn)物，維持組織的平衡，損傷的修復(fù)和先天免疫平衡[1-2]。吞噬功能障礙可能導(dǎo)致代謝廢物堆積，自身免疫性疾病及組織變性。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞的吞噬作用對維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)和感光體活力是必需的[3]。RPE功能受損，消化后的代謝物不能及時清除，形成脂褐質(zhì)和玻璃膜疣，繼而Bruch膜與色素上皮細(xì)胞變性, 是發(fā)生年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)的重要因素。

低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)受體家族的所有成員都被視為細(xì)胞表面胞吞受體，其在細(xì)胞吞噬中起到重要作用，例如最早發(fā)現(xiàn)的人LDL受體，其介導(dǎo)含膽固醇的脂蛋白顆粒的內(nèi)吞作用；中胚層分化蛋白2(mesoderm development candidate 2，Mesdc2)是LDL受體家族低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL receptor-related protein, LRP)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)分子伴侶[4]，已被報道與LRP5、LRP6[5]及LRP4[6]結(jié)合。

本研究使用人D407細(xì)胞及原代小鼠RPE細(xì)胞，證實(shí)了Mesdc2可促進(jìn)RPE細(xì)胞吞噬，Mesdc2主要表達(dá)在感光細(xì)胞外節(jié)段(photoreceptor outer segment，POS)的細(xì)胞質(zhì)，可促進(jìn)D407 RPE細(xì)胞和原代RPE細(xì)胞吞噬POS盤膜，其減少極有可能是RPE細(xì)胞吞噬功能下降的一個重要原因。

材料和方法

1材料

C57BL/6小鼠(上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司提供)，6～8周齡及7～10日齡。 人D407細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和新鮮牛眼(上海富衡生物科技有限公司提供)。

2主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液(Gibco)；MEM培養(yǎng)液、聚L-賴氨酸和蛋白酶抑制劑(Sigma)，胎牛血清(天津TBD公司)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)和pHrodo標(biāo)記盒(Thermo Fisher)；RIPA緩沖液裂解液(Pierce)；TCS SP5共聚焦顯微鏡及其軟件分析系統(tǒng) LAS AF (Leica)。

3方法

3.1Mesdc2質(zhì)粒制備及蛋白提純用RT-PCR產(chǎn)生的小鼠Mesdc2 cDNA通過PCR擴(kuò)增與C末端FLAG標(biāo)簽相連，并用BglⅡ和NotⅠ位點(diǎn)克隆到pEGFP-N1質(zhì)粒(Clontech)，以取代GFP，生成Mesdc2-FLAG質(zhì)粒。另外，編碼序列通過PCR擴(kuò)增，用BglⅡ和XhoⅠ消化，克隆至pMAL-C4E質(zhì)粒(New England Biolab)的BamH Ⅰ、SalⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)，組成麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein, MBP) -Mesdc2質(zhì)粒。所有的質(zhì)粒通過DNA測序驗證。將MBP-Mesdc2和pMAL-C4E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)細(xì)菌，之后用IPTG誘導(dǎo)，使用直鏈淀粉柱純化MBP-Mesdc2和MBP蛋白，用PBS透析，并用SDS-PAGE進(jìn)行分析。

3.2原代小鼠RPE細(xì)胞培養(yǎng)用CO2處死10日齡C57BL/6小鼠，立即取出眼球，在無菌狀態(tài)下沿鋸齒緣將眼球剪開，棄去角膜，晶狀體和視網(wǎng)膜后，將胰蛋白酶加入RPE眼杯37 ℃消化3 min，10%胎牛血清終止消化，用吸管輕輕吹打，使RPE細(xì)胞脫落分離成單個細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，加入MEM(含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)10 μg/L、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)1 μg/L、1×N1 Supplement、牛磺酸210 μg/L、氫化可的松1.2 mg/L和三碘甲狀腺氨酸60 μg/L)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)基每2～3 d更換1次，直到RPE細(xì)胞長出。用胰蛋白酶解離細(xì)胞，在吞噬實(shí)驗前3 d更換無bFGF和EGF的培養(yǎng)基。

3.3POS盤膜提取取死亡24 h內(nèi)新鮮牛眼，4 ℃下，將分離的視網(wǎng)膜輕輕地在含有2.5%蔗糖的PBS中振蕩15 min，移去視網(wǎng)膜之后，分離的POS盤膜經(jīng)過2次38 700×g離心30 min收集并洗滌。純化的POS盤膜用pHrodo標(biāo)記盒標(biāo)記[7]。POS盤膜與pHrodo(500 μg)孵育30 min后，于室溫下在含1% BSA的PBS中孵育15 min。在吞噬實(shí)驗前30 min該標(biāo)記的盤膜用PBS 16 000×g離心5 min洗滌2次。

3.4RPE細(xì)胞吞噬POS盤膜實(shí)驗采用雙重?zé)晒鈽?biāo)記法。分別用pHrodo和DAPI標(biāo)記POS盤膜及RPE細(xì)胞。將D407細(xì)胞或原代RPE細(xì)胞接種在預(yù)先涂有聚L-賴氨酸玻璃片的12孔板，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長孵育至80%融合時，將MBP-Mesdc2及MBP按所示濃度分別與pHrodo標(biāo)記POS盤膜(50 mg/L)加入到RPE細(xì)胞37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，4 h時用PBS充分沖洗，將游離的POS盤膜去除，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗干凈，細(xì)胞核用DAPI染色，通過共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)分析。胞內(nèi)pHrodo信號通過ImageJ軟件分析。

吞噬功能分析按參考文獻(xiàn)的方法[8]，采用Leica TCS SP5 共聚焦顯微鏡及 LAS AF軟件系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，每組隨機(jī)拍攝5個視野，并選取中間的一組進(jìn)行統(tǒng)計。采用ImageJ軟件定量分析每幅圖像中的熒光量。每幅圖像中的吞噬熒光量/每幅圖像中DAPI熒光量即為熒光密度。

3.5免疫組化熒光標(biāo)記和免疫共定位實(shí)驗取6～8周齡C57BL/6小鼠于麻醉下用10%福爾馬林灌注心臟。眼球在相同固定液中4 ℃過夜，去除角膜和晶狀體后，將眼杯孵育蔗糖梯度溶液10%和20%各3 h；30% 4 ℃過夜，然后進(jìn)行3輪凍融和OCT包埋，制成7 μm厚的冰凍組織切片。分別用兔抗Mesdc2和小鼠抗視紫紅質(zhì)的抗體孵育，再用Alexa594標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體和Alexa488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體，細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記，通過共聚焦顯微鏡分析熒光信號。

采用3種熒光標(biāo)記，分別用pHrodo標(biāo)記POS盤膜，DAPI標(biāo)記RPE細(xì)胞，D407細(xì)胞與pHrodo標(biāo)記POS盤膜共同孵育3 h，4%多聚甲醛固定10 min，用含有1%Triton X-100的PBS透化，再加入抗Rab7抗體，然后通過FITC標(biāo)記的 II 抗定位Rab7。通過共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞內(nèi)的熒光信號。

3.6檢測人D407細(xì)胞表達(dá)Mesdc2的mRNA水平(1) RNA提?。喝?0 cm2D407細(xì)胞加入1 mL TRIzol，倒入1.5 mL的Eppendorff管中，先后以氯仿、異丙醇、75%乙醇處理RNA樣品后，加入20 μL的DEPC溶解，測定吸光度(A)值后，計算樣品RNA濃度。 (2) 逆轉(zhuǎn)錄PCR：逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(12 μL)：1 μL引物，10 μL模板RNA，1 μL dNTP，2 μL DEPC，65 ℃ 5 min;再加入4 μL 5×first-strand buffer，2 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL RNase inhibitor，42 ℃ 2 min;再加入1 μL SSIII逆轉(zhuǎn)錄酶，42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。(3) PCR反應(yīng)體系(20 μL)：GAPDH上游引物和下游引物各1 μL，人Mesdc2上游引物和下游引物各1 μL，5倍PCR緩沖液4 μL，TaKaRa EX TaqTMHS 0.4 μL，滅菌ddH2O 12.6 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán);4 ℃終止反應(yīng)。人Mesdc2的上游引物序列為5’-ATGGCGGCTTCCAGGTGGGC-3’，下游引物序列為5’-ACTGCTGCCCCATCACAGGT-3’，擴(kuò)增片段長度為716 bp；GAPDH作為內(nèi)參照， 上游引物序列為5’- CTTCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游引物序列為5’-ATGAGGTCCACCACCCTGTTG-3’，擴(kuò)增片段長度為681 bp。

3.7檢測小鼠視網(wǎng)膜表達(dá)Mesdc2的mRNA水平(1) RNA提?。喝?個小鼠視網(wǎng)膜加入1 mL TRIzol，研磨組織后倒入1.5 mL的Eppendorff管中，先后以氯仿、異丙醇、75%乙醇處理RNA樣品后，加入20 μL的DEPC溶解。測定吸光度(A)值后，計算樣品RNA濃度。 (2) 逆轉(zhuǎn)錄PCR:采用兩步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：1 μL引物，8 μL模板RNA，1 μL dNTP，2 μL DEPC，65 ℃ 5 min；再加入4 μL 5× first-strand buffer, 2 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL RNase inhibitor，1 μL SSIII逆轉(zhuǎn)錄酶，50 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。 (3) PCR反應(yīng)體系(20 μL)：GAPDH上游引物和下游引物各1 μL，小鼠Mesdc2上游引物和下游引物各1 μL，5倍PCR緩沖液4 μL，TaKaRa EX TaqTMHS 0.4 μL，滅菌ddH2O 12.6 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán); 4 ℃終止反應(yīng)。小鼠Mesdc2上游引物序列為5’-TCAGATCTATGGCGGACACTCCGGGCGAGG-3’，下游引物序列為5’-TTCTCGAGCTAAAGGTCTTCTCTTCTGCTCCC-3’，擴(kuò)增片段長度為587 bp；GAPDH作為內(nèi)參照， 上游引物序列為5’-GTGCAGCGAACTTTATTGATGG-3’，下游引物序列為5’-TGGTGAAGCAGGCATCTGAG-3’，擴(kuò)增片段長度為403 bp。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6倍的loading緩沖液混合后，加入1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為1倍Tris-硼酸-EDTA緩沖液，室溫下恒定電壓170 V，電泳30 min。使用BLS303PC凝膠自動成像系統(tǒng)記錄。

3.8免疫印跡法檢測Mesdc2的表達(dá)取牛POS及視網(wǎng)膜組織用RIPA裂解液裂解提取組織蛋白，并通過使用抗Mesdc2抗體和HRP標(biāo)記的II抗進(jìn)行Western blot分析。

3.9POS盤膜與Mesdc2的結(jié)合實(shí)驗將HEK293細(xì)胞用Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。用蛋白酶抑制劑通過3次冷凍-解凍得到細(xì)胞裂解物，隨后在4 ℃下16 000×g離心30 min，將裂解液通過0.2微米的過濾器過濾。 4 ℃下POS盤膜(500 μg)與細(xì)胞裂解物共同孵育1 h，用PBS洗滌并離心5次。POS結(jié)合Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG用鼠抗FLAG單克隆抗體，然后Alex594羊抗鼠II抗，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測。

3.10D407細(xì)胞與Mesdc2結(jié)合實(shí)驗4 ℃下D407與細(xì)胞裂解物共同孵育1 h，用PBS洗滌并離心5次。 D407細(xì)胞結(jié)合Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG用鼠抗FLAG單克隆抗體，然后Alex594羊抗鼠II抗，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測。

4統(tǒng)計學(xué)分析

使用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實(shí)驗至少獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)按均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1Mesdc2在小鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)

與巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞不同，RPE細(xì)胞是固定的吞噬細(xì)胞，因此Mesdc2在視網(wǎng)膜表達(dá)的位置非常重要，與其作為RPE細(xì)胞吞噬配體高度相關(guān)。我們首先通過RT-PCR驗證其在視網(wǎng)膜中的表達(dá)。其次我們通過免疫印跡檢測Mesdc2在視網(wǎng)膜和POS表達(dá)的量，我們在POS中沒有檢測到β-肌動蛋白，這可能與POS的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)。我們進(jìn)一步通過免疫組化檢測Mesdc2在視網(wǎng)膜中的表達(dá)，抗Mesdc2和抗視紫紅質(zhì)抗體可以驗證其在視網(wǎng)膜的表達(dá)，結(jié)果表明Mesdc2主要表達(dá)在POS層，與POS生物標(biāo)志物視紫紅質(zhì)完全共定位，雖然視網(wǎng)膜各層均有表達(dá)，但表達(dá)量遠(yuǎn)少于POS層，表明Mesdc2集中表達(dá)在具有促進(jìn)RPE細(xì)胞吞噬作用的有利表達(dá)部位，見圖1。

Figure 1.The expression of Mesdc2 in mouse retina. A: Mesdc2 expression in mouse retina detected by RT-PCR; B: Mesdc2 expression in the bovine retina and POSs detected by Western blot; C: Mesdc2 and rhodopsin expression and co-localization in mouse retina detected by immunohistochemistry.

圖1Mesdc2在小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)分析

2Mesdc2促進(jìn)D407細(xì)胞吞噬POS盤膜

pHrodo是pH敏感的熒光染料，從新鮮牛眼制備的POS用pHrodo標(biāo)記后，在被吞噬成為酸性吞噬體后，其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)[8]，結(jié)合共聚焦顯微鏡可明確區(qū)分?jǐn)z入和未攝入的POS。同時使用流式細(xì)胞儀檢測被吞噬的POS熒光信號。共聚焦顯微鏡結(jié)果表明，純化的Mesdc2可刺激人D407 RPE細(xì)胞吞噬POS，pHrodo信號與亮視野顯微鏡圖疊加圖像清楚地顯示，標(biāo)記的POS被吞噬進(jìn)D407細(xì)胞。加入Mesdc2的D407細(xì)胞吞噬POS明顯多于MBP，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。同時我們做了濃度梯度的實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)D407細(xì)胞吞噬POS與Mesdc2的濃度呈現(xiàn)劑量依賴性，但在達(dá)到飽和濃度后其吞噬能力下降，而MBP不具有此特征，兩者在50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性，其中100 nmol/L 達(dá)到吞噬的峰值(P<0.01), 見圖2。

3Mesdc2促進(jìn)原代小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬POS

我們使用新生小鼠眼球制備原代RPE細(xì)胞與Mesdc2蛋白及POS共同孵育，分析其促吞噬作用，MBP蛋白作為陰性對照。結(jié)果表明Mesdc2可誘導(dǎo)原代RPE細(xì)胞吞噬POS，而MBP沒有誘導(dǎo)RPE細(xì)胞吞噬，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。這些結(jié)果表明，人D407和原代小鼠RPE細(xì)胞具有相似的吞噬機(jī)制,見圖3。

4Mesdc2能與POS和D407細(xì)胞結(jié)合

本實(shí)驗將Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG細(xì)胞裂解物分別與脫落的POS盤膜及D407細(xì)胞一起孵育，通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)Mesdc2-FLAG可結(jié)合至POS盤膜及D407細(xì)胞表面, GFP-FLAG作為陰性對照。在與POS盤膜的結(jié)合實(shí)驗中，GFP為5.5%，Mesdc2為42.8%。在D407細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗中，GFP為0.3%，Mesdc2為64.2%，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖4。

5Mesdc2通過吞噬體介導(dǎo)內(nèi)吞

我們使用吞噬體生物標(biāo)志物Rab7來驗證Mesdc2介導(dǎo)POS攝入是通過吞噬途徑，在Mesdc2組，Rab7與攝入的POS共定位，MBP是陰性對照，因此Mesdc2介導(dǎo)的內(nèi)化是通過靶向攝取POS到吞噬體的一個吞噬過程,見圖5。

Figure 2.Mesdc2 stimulated the phagocytosis of D407 cells. A: the phagocytosis of pHrodo by D407 cells stimulated by Mesdc2, MBP was negative control; B: quantification of relative fluorescence intensity in D407 cell phagocytosis stimulated by Mesdc2 and MBP; C: quantification of relative fluorescence intensity in D407 cell dose-dependent phagocytosis stimulated by Mesdc2 and MBP. Mean±SEM.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsMBP.

圖2Mesdc2促進(jìn)D407細(xì)胞吞噬

Figure 3.Mesdc2 stimulated phagocytosis of mouse primary RPE cells. A: the phagocytosis of pHrodo by mouse primary RPE cells stimulated by Mesdc2, MBP was negative control; B: quantification of relative fluorescence intensity in mouse primary RPE cell phagocytosis stimulated by Mesdc2 and MBP. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsMBP.

圖3Mesdc2促進(jìn)小鼠原代視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬

Figure 4. The binding of Mesdc2 with POS (A) and D407 cells (B) analyzed by flow cytometry. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsGFP-FLAG.

圖4流式細(xì)胞術(shù)分析Mesdc2-FLAG與POS和D407細(xì)胞的結(jié)合情況

Figure 5. The co-localization of pHrodo and Rab7 in D407 cells observed by confocal microscopy. The pHrodo signal (red) co-loca-lized with Rab7 signal (green).

圖5共聚焦顯微鏡下檢測D407細(xì)胞攝入的POS與Rab7共定位

討論

年齡相關(guān)性黃斑變性的一個顯著特征是細(xì)胞內(nèi)脂褐素和細(xì)胞外玻璃膜疣的沉積，隨后出現(xiàn)RPE細(xì)胞的缺失、感光細(xì)胞的損傷及Bruch膜的改變、新生血管長入等病理改變。隨著研究的深入, 人們逐漸認(rèn)識到RPE細(xì)胞吞噬及降解POS功能的異常在AMD的發(fā)病中起著重要的作用[9]。在老年小鼠RPE中脂褐素的含量約為剛出生時的20倍，并且脂褐素的蓄積阻礙RPE吞噬POS盤膜[10]。還有研究發(fā)現(xiàn), 未吞噬的POS碎片由RPE細(xì)胞頂端轉(zhuǎn)移到RPE下，參與形成玻璃膜疣[11]。

Mesdc2是LRP家族的分子伴侶，可促進(jìn)細(xì)胞表面LRP分子的折疊和表達(dá)。例如促進(jìn)LRP1，2，4，5，6的表達(dá)[6]。敲除Mesdc2可導(dǎo)致LRP5/6的異常表達(dá)和胚胎極性的破壞[12-13]。LRP家族的內(nèi)吞活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是眾所周知的。LRP1是一種多功能的清道夫受體[14]。LRP1有至少30個不同的配體，參與脂蛋白代謝和病毒及細(xì)菌毒素進(jìn)入細(xì)胞。LRP5/6是Wnt信號通路的共同受體，參與內(nèi)吞作用。

本實(shí)驗證實(shí)了Mesdc2是一個新的RPE細(xì)胞的吞噬配體，它可能從脫落的POS盤膜中被釋放，并與RPE細(xì)胞和POS盤膜表面受體結(jié)合，并將其連接后進(jìn)行吞噬清除。Mesdc2在視網(wǎng)膜表達(dá)的位置非常重要，與其作為RPE細(xì)胞吞噬配體高度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Mesdc2主要表達(dá)在POS層，其它視網(wǎng)膜層也存在低水平表達(dá)，雖然視網(wǎng)膜各層均有表達(dá)，但表達(dá)量遠(yuǎn)少于POS，表明Mesdc2集中表達(dá)在具有促進(jìn)RPE細(xì)胞吞噬作用的有利表達(dá)部位。在感光細(xì)胞中，蛋白質(zhì)主要在光感受器內(nèi)節(jié)層合成，此處即是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[15]。成熟的蛋白質(zhì)通過連接纖毛從內(nèi)節(jié)層轉(zhuǎn)運(yùn)到POS層。雖然Mesdc2作為ER伴侶在無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的POS層高表達(dá)的分子機(jī)制還不清楚，但Mesdc2在POS的高表達(dá)提示了其可作為配體調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞吞噬作用。

本實(shí)驗通過人D407細(xì)胞和鼠原代RPE細(xì)胞驗證了純化的Mesdc2可刺激RPE細(xì)胞吞噬POS盤膜，pHrodo信號與亮視野顯微鏡圖疊加圖像清楚地顯示，標(biāo)記的POS被吞噬進(jìn)D407細(xì)胞。加入Mesdc2的D407細(xì)胞吞噬POS盤膜明顯多于MBP，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，在濃度梯度的實(shí)驗，Mesdc2在高濃度(200 nmol/L)刺激的RPE細(xì)胞吞噬作用的活性降低，可能在濃度過高時橋接分子效率降低。因此，這些結(jié)果支持Mesdc2是一個RPE細(xì)胞吞噬橋接分子。

一個蛋白質(zhì)作為吞噬配體的標(biāo)準(zhǔn)是其可在胞外結(jié)合被吞噬體和受體。本實(shí)驗通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)Mesdc2-FLAG可結(jié)合至POS盤膜及D407細(xì)胞表面，與陰性對照組GFP-FLAG比較，差異明顯，可見Mesdc2可在胞外結(jié)合至RPE細(xì)胞及POS表面，并促進(jìn)吞噬，但在RPE細(xì)胞和POS的結(jié)合受體目前還有待鑒定。

雖然RPE細(xì)胞吞噬的分子機(jī)制并不明確，但本研究通過多方面的證據(jù)獨(dú)立驗證Mesdc2是RPE細(xì)胞的一個吞噬配體，其中包括其在POS的高表達(dá)，刺激誘導(dǎo)RPE細(xì)胞吞噬。Mesdc2作為一種新的RPE細(xì)胞吞噬配體將有助于深入了解RPE細(xì)胞吞噬的分子生物學(xué)機(jī)制。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effect of Mesdc2 on phagocytosis of retinal pigment epithelial cells

CHEN Xiu-ping, YUAN Yuan-zhi, WANG Li-yang, YUAN Fei

(DepartmentofOphthalmology,ZhongshanHospitalofFudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:yuan.fei@zs-hospital.sh.cn)

[KEY WORDS]Mesoderm development candidate 2; Phagocytosis; Retinal pigment epithelial cells

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of mesoderm development candidate 2 (Mesdc2) on phagocytosis of retinal pigment epithelial (RPE) cells. METHODS: The purified Mesdc2 protein was used to incubate with mouse primary RPE cells or D407 cells. The bound and ingested photoreceptor outer segments (POSs) by RPE cells were observed by confocal microscopy and flow cytometry. RESULTS: The Mesdc2 protein was expressed throughout the retina, and predominantly in POSs. Internalized POSs were co-localized with phagosome biomarker Rab7, suggesting that Mesdc2-mediated engulfment was involved in a phagocytosis pathway. Mesdc2 stimulated phagocytosis of POS vesicles by D407 RPE cells in a dose-dependent manner. The effect of Mesdc2 on phagocytosis decreased after the saturation concentration. Mesdc2 bound to both D407 RPE cells and shed POS vesicles. CONCLUSION: Mesdc2 stimulates the phagocytosis of retinal pigment epithelial cells.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1084- 07

[收稿日期]2015- 08- 03[修回日期] 2016- 03- 09

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81470637); 上海市科學(xué)技術(shù)委員會基金資助項目 (No. 13411950405)

通訊作者△Tel: 021-64041990-2671； E-mail: yuan.fei@zs-hospital.sh.cn

[中圖分類號]R774; R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.021