Sirtuin 6對肝癌細(xì)胞增殖的影響*

陶娜娜，　周洪鐘，　任吉華，　陳　祥，　李宛蔚，　劉　波，　陳　娟

(重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

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Sirtuin 6對肝癌細(xì)胞增殖的影響*

陶娜娜，周洪鐘，任吉華，陳祥，李宛蔚，劉波，陳娟△

(重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

[摘要]目的： 探究sirtuin 6 (SIRT6)對肝癌細(xì)胞增殖的影響。方法: RT-qPCR檢測200例肝癌病人及50例健康人外周血中的SIRT6的mRNA表達(dá)水平，并將肝癌病人外周血SIRT6的mRNA表達(dá)水平與多個(gè)臨床病理參數(shù)相結(jié)合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Western blotting檢測SIRT6在原代肝細(xì)胞、永生化肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平。在肝癌細(xì)胞中利用shRNA干擾SIRT6基因的表達(dá)，并通過Western blotting驗(yàn)證沉默效率；MTS實(shí)驗(yàn)檢測SIRT6基因沉默對肝癌細(xì)胞活力的影響。EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測SIRT6基因沉默對肝癌細(xì)胞DNA合成的影響；平板集落實(shí)驗(yàn)檢測SIRT6基因沉默對肝癌細(xì)胞集落形成能力的影響；軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測SIRT6基因沉默對肝癌細(xì)胞錨定非依賴生長能力的影響。結(jié)果: SIRT6在肝癌病人的外周血中表達(dá)明顯增高，且SIRT6的表達(dá)量增高與腫瘤的大小、腫瘤的分級以及腫瘤的血管侵襲相關(guān)。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)SIRT6在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)水平較原代肝細(xì)胞PHH及永生化肝細(xì)胞MIHA增高。在2個(gè)肝癌細(xì)胞系中沉默SIRT6可以抑制肝癌細(xì)胞的活力及DNA合成能力，也可抑制肝癌細(xì)胞集落形成能力及錨定非依賴生長能力。結(jié)論: SIRT6促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化。

[關(guān)鍵詞]Sirtuin 6； 肝細(xì)胞癌； 細(xì)胞增殖

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)在全球腫瘤死亡率中居第2位[1]。近期對各種癌癥發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌的全球年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為10.1/100 000，其中男性發(fā)病率約為女性的3倍[2]。在原發(fā)性肝癌中，約有80%為肝細(xì)胞癌(he-patocellular carcinoma，HCC)。肝細(xì)胞癌的全球發(fā)病率在男性中排名第五，女性中排名第七[2]。肝細(xì)胞癌起病隱匿，具有發(fā)現(xiàn)晚，放化療及手術(shù)切除效果差，預(yù)后不良等特點(diǎn)，并最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的死亡率較高[3]。惡性增殖是肝細(xì)胞癌最重要病理特征，故研究肝細(xì)胞癌惡性增殖的分子調(diào)節(jié)機(jī)制對于肝細(xì)胞癌的干預(yù)治療具有重要的意義。

Sirtuin家族是酵母中沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2，Sir2)的哺乳動物同源蛋白。Sirtuin家族是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)[4]。目前發(fā)現(xiàn)人類的sirtuin家族共有7個(gè)成員，它們的細(xì)胞定位不同，各自發(fā)揮著重要的生理作用。SIRT1、6、7位于細(xì)胞核，SIRT2位于細(xì)胞質(zhì)，SIRT3、4、5位于線粒體[5]。研究證實(shí)sirtuin家族成員通過對組蛋白及多種非組蛋白進(jìn)行去乙?；揎梺碚{(diào)節(jié)基因表達(dá)[6-7]，參與細(xì)胞分化、凋亡、衰老、能量代謝及應(yīng)激耐受等多種重要的生理活動，從而在多種腫瘤的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[8]。SIRT6定位于細(xì)胞核異染色質(zhì)中，同時(shí)具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶和去乙酰化酶活性。研究發(fā)現(xiàn)SIRT6可在多種腫瘤中發(fā)揮作用。但對SIRT6在腫瘤形成過程中起促進(jìn)或抑制作用尚存爭議。且目前關(guān)于SIRT6對肝細(xì)胞癌增殖及惡性轉(zhuǎn)化的影響尚不明確。在本研究中，我們從肝癌病人的外周血樣本入手，首先檢測了在200例肝癌病人及50例健康人外周血SIRT6的mRNA表達(dá)水平，并將SIRT6的表達(dá)水平與多個(gè)臨床病理參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。進(jìn)一步檢測SIRT6在正常肝組織、永生化肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平。并在肝癌細(xì)胞中沉默SIRT6基因的表達(dá)來觀察其對肝癌細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化的影響。因此，本研究有助于進(jìn)一步了解肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為尋找新的肝細(xì)胞癌治療藥物靶點(diǎn)提供了依據(jù)。

材料和方法

1材料

200例肝癌病人及50例健康人外周血均來源于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院。肝癌細(xì)胞系SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMMC-7721及永生化肝細(xì)胞系MIHA購于ATCC；肝癌細(xì)胞系Huh-7購于HSRRB；HM培養(yǎng)基和原代肝細(xì)胞系PHH購自ScienCell；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；GV248-shcont、GV248-shSIRT6-1和GV248-shSIRT6-2質(zhì)粒購于吉凱基因；SIRT6抗體購于Novus Biologicals；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG及NC膜購于GE；GAPDH及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購于Santa Cruz；BCA試劑盒購于Thermo；Cell-LightTMEdU Apollo?488InVitroImaging Kit試劑盒購于銳博公司；CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑(MTS實(shí)驗(yàn))購于Promega；TRIzol試劑購于Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Bio-Rad；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑、FastStart Universal SYBR Green Master Mix及EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets (PI) 購于Roche；opti-MEM及DMEM購于Gibco。

2方法

2.1RT-qPCR在試管中加入淋巴細(xì)胞分離液，再吸取等體積血液樣本加于分離液之液面上。500×g離心30 min。離心后試管中由上至下分為4層，第1層為血漿層,第2層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層,第3層為透明分離液層,第4層為紅細(xì)胞層。用吸管小心吸取第2層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一試管中，生理鹽水洗滌。1 mL TRIzol裂解，提取總RNA。取1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行PCR檢測，以β-actin為內(nèi)參照。設(shè)置復(fù)孔3個(gè)。以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)PHH細(xì)胞培養(yǎng)于HM培養(yǎng)基中；肝癌細(xì)胞系SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Huh-7及永生化肝細(xì)胞系MIHA均培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清、1% 青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。上述細(xì)胞均在含有5% CO2、37 ℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染接種8×104SK-Hep-1或Huh-7細(xì)胞于6孔板中。24 h后更換培養(yǎng)基為無抗生素的DMEM。并將2 μg質(zhì)粒與6 μL轉(zhuǎn)染試劑加入200 μL opti-MEM中充分混勻，靜置15 min后逐滴加入6孔板中。轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基。

2.4Western blotting實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞，用適量含PI的RIPA裂解液使細(xì)胞充分裂解，4 ℃搖床裂解20 min， 16 000×g離心5 min，取上清于新的EP管中。BCA試劑盒測蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，每孔上樣量為30 μg蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，SIRT6 I抗4 ℃搖床孵育過夜，II抗室溫孵育2 h。以GAPDH為內(nèi)參照。

2.5MTS實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染24 h后將shControl組與shSIRT6組細(xì)胞分別消化計(jì)數(shù)，并接種8 000個(gè)于96孔板中。分別于轉(zhuǎn)染后2 d、3 d、4 d和5 d向96孔板中加入20 μL MTS試劑，37 ℃孵育2 h，490 nm檢測吸光度(A)值。操作按照Promega試劑說明書進(jìn)行。

2.6EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)在接種之前將蓋玻片加入6孔板中，轉(zhuǎn)染3 d后進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)，操作按照銳博生物試劑盒說明書進(jìn)行。

2.7平板集落實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染24 h后換液，在培養(yǎng)基中加入0.25 μmol/L嘌呤霉素。每3 d換1次液，當(dāng)細(xì)胞長至50%以上時(shí)重新傳代，3周后可觀察到肉眼可見的明顯集落，甲醇固定后0.1%結(jié)晶紫染色。

2.8軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)將濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠與含有20%血清的2×DMEM充分混勻后加入6孔板中，作為底層膠。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將2 000個(gè)細(xì)胞加入含有20%血清的2×DMEM中，并與0.7%瓊脂糖凝膠混勻作為上層膠加入6孔板中。每3 d向6孔板中加入幾滴完全培養(yǎng)基。3周后可觀察到肉眼可見的明顯集落，0.05%結(jié)晶紫染色。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1SIRT6在肝癌病人及健康人外周血樣本中的表達(dá)差異

將收集的外周血提取RNA后，采用RT-qPCR方法檢測SIRT6的mRNA表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，在肝癌病人樣本中，SIRT6的mRNA相對表達(dá)水平為7.3870±0.7245，癌旁組織中SIRT6的mRNA相對表達(dá)水平為1.0090±0.0746。SIRT6的mRNA表達(dá)水平在肝癌病人中顯著高于正常人(P<0.01),見圖1。隨后，我們將肝癌病人的SIRT6的mRNA表達(dá)水平與多個(gè)臨床病理參數(shù)相結(jié)合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，SIRT6的表達(dá)量增高與腫瘤的大小、腫瘤的分級以及腫瘤的血管侵襲相關(guān)(P<0.01)。而與病人的性別、年齡以及腫瘤的分期、壞死、硬化不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)性，見表1。

Figure 1.The mRNA expression levels of SIRT6 in the periphe-ral blood of HCC patients (n=200) and healthy persons (n=50) detected by RT-qPCR analysis.**P<0.01.

圖1SIRT6在外周血中的mRNA表達(dá)水平

表 1SIRT6表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)

Table 1.Correlation between SIRT6 expression and clinicopathologic parameters

2SIRT6在不同細(xì)胞系中的表達(dá)差異

提取原代肝細(xì)胞PHH、永生化肝細(xì)胞MIHA以及肝癌細(xì)胞SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Huh-7的總蛋白。Western blotting檢測SIRT6的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示SIRT6在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于原代肝細(xì)胞和永生化肝細(xì)胞，見圖2。

3SIRT6沉默對肝癌細(xì)胞增殖的影響

我們首先在SK-Hep-1和Huh-7這2種肝癌細(xì)胞系中靶向沉默SIRT6的表達(dá)，Western blotting 檢測沉默效率(圖3)。結(jié)果顯示，SK-Hep-1和Huh-7細(xì)胞中的沉默效率約為90%和80%。并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行MTS實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示SIRT6沉默可顯著抑制肝癌細(xì)胞的活力(P<0.01)，且隨著天數(shù)的增加，抑制趨勢更加明顯，在第5 天時(shí)抑制率分別達(dá)到43%及42%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖4。

Figure 2.The protein expression levels of SIRT6 in primary he-patocytes, immortalized hepatocytes and 4 hepatoma cell lines.

圖2SIRT6在細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平

Figure 3.The silencing efficiency of shSIRT6 was analyzed by Western blotting analysis.

圖3Western blotting檢測shSIRT6的沉默效率

Figure 4.The effect ofSIRT6 silencing on the viability of HCC cells determined by MTS assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

圖4MTS實(shí)驗(yàn)檢測SIRT6沉默對肝癌細(xì)胞活力的影響

在SK-Hep-1細(xì)胞中靶向沉默SIRT6的表達(dá)，并進(jìn)行EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示SIRT6沉默組肝癌細(xì)胞的DNA合成能力明顯減弱，說明沉默SIRT6可顯著抑制肝癌細(xì)胞的DNA合成能力，抑制率達(dá)43%，見圖5。結(jié)合MTS實(shí)驗(yàn)和EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的一致變化，證實(shí)沉默SIRT6可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

4SIRT6沉默對肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

在SK-Hep-1細(xì)胞中靶向沉默SIRT6的表達(dá)，以0.25 μmol/L嘌呤霉素處理，3周后0.1%結(jié)晶紫染色。結(jié)果顯示沉默SIRT6組肝癌細(xì)胞形成的集落明顯小于對照組，說明沉默SIRT6可顯著抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，抑制率達(dá)50%,見圖6。

Figure 5.The effect ofSIRT6 silencing on the DNA synthesis of HCC cells detected by EdU incorporation assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

圖5EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測SIRT6沉默對肝癌細(xì)胞DNA合成能力的影響

Figure 6.The effect ofSIRT6 silencing on the ability of colony formation in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

圖6平板集落實(shí)驗(yàn)檢測SIRT6沉默對肝癌細(xì)胞集落形成能力的影響

5SIRT6沉默對肝癌細(xì)胞錨定非依賴生長能力的影響

在SK-Hep-1細(xì)胞中靶向沉默SIRT6的表達(dá)，將2 000個(gè)細(xì)胞與瓊脂糖凝膠混勻種入6孔板中，3周后0.05%結(jié)晶紫染色。結(jié)果顯示沉默SIRT6組肝癌細(xì)胞形成的集落明顯小于對照組，說明沉默SIRT6可顯著抑制肝癌細(xì)胞的錨定非依賴生長能力，抑制率達(dá)53%(P<0.01)，見圖7。

Figure 7.Effect ofSIRT6 silencing on the ability of anchorage-dependent growth in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

圖7軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測SIRT6沉默對肝癌細(xì)胞錨定非依賴生長能力的影響

討論

SIRT6在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是具有爭議的。有文獻(xiàn)報(bào)道SIRT6促進(jìn)了細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并促使其遷移到胰腺癌細(xì)胞中，并發(fā)現(xiàn)SIRT6促進(jìn)了炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，如IL-8和TNF-α，通過增強(qiáng)Ca2+反應(yīng)，促進(jìn)了細(xì)胞遷移[9]，且在皮膚癌[10]、前列腺癌[11]和乳腺癌[12]中，SIRT6的表達(dá)水平是異常增高的。在前列腺癌中，SIRT6基因沉默可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞出現(xiàn)G1期細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，并同時(shí)增加前列腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[11]。在乳腺癌病人中，SIRT6的表達(dá)上調(diào)使得乳腺癌病人對紫杉醇及表阿霉素耐藥，并與病人預(yù)后不良相關(guān)[12]。這些研究結(jié)果揭示著SIRT6作為一種腫瘤促進(jìn)因子發(fā)揮作用。而另一方面，胚胎成纖維細(xì)胞在SIRT6缺失的情況下可以不依賴于致癌基因而發(fā)生腫瘤，提示SIRT6可作為一種腫瘤抑癌因子。且SIRT6的缺失促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解，使得腫瘤生長加快[13]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，SIRT6還可通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡并減少氧化應(yīng)激，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長[14]。此外，SIRT6在人類頭頸部癌和卵巢癌中的表達(dá)量異常降低[15-16]。綜上所述，SIRT6在人類復(fù)雜的遺傳背景下既可能是抑癌基因也可以是促癌基因。而目前有關(guān)SIRT6在肝細(xì)胞癌中的報(bào)道還很少。

在本研究中，我們從臨床樣本入手，分別檢測了肝癌病人及健康人外周血中SIRT6的表達(dá)水平。結(jié)果顯示其在肝癌病人外周血中的表達(dá)量顯著增高，提示SIRT6可以作為肝癌診斷中新的標(biāo)志物。且SIRT6的mRNA表達(dá)水平增高與腫瘤的大小、分級以及腫瘤的血管侵襲相關(guān)。提示其可以作為評價(jià)肝癌惡性程度的指標(biāo)之一。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)SIRT6在多個(gè)肝癌細(xì)胞系中也呈現(xiàn)出高表達(dá)。沉默SIRT6可抑制細(xì)胞的增殖能力和DNA合成能力，并可抑制肝癌細(xì)胞的集落形成能力及錨定非依賴生長能力，說明SIRT6基因沉默后可抑制肝癌細(xì)胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化。在SIRT6調(diào)控癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究進(jìn)展中，有文獻(xiàn)報(bào)道，在皮膚癌中SIRT6通過抑制AMPK信號通路促進(jìn)COX-2的表達(dá)，從而促進(jìn)皮膚癌細(xì)胞的增殖[10];而在卵巢癌中，SIRT6通過下調(diào)Notch3的表達(dá)從而抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖[16]。說明在不同的腫瘤類型中，SIRT6通過不同的機(jī)制發(fā)揮不同的作用。因此，我們也將繼續(xù)研究在肝癌細(xì)胞中，SIRT6是通過何種機(jī)制發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化的作用。綜上所述，我們的結(jié)果突顯出sirtuin家族在肝細(xì)胞癌增殖及惡性轉(zhuǎn)化過程中的重要性，為癌癥防治工作提供了有用的工具。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effect of sirtuin 6 on proliferation of hepatocellular carcinoma cells

TAO Na-na, ZHOU Hong-zhong, REN Ji-hua, CHEN Xiang, LI Wan-yu, LIU Bo, CHEN Juan

(KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseases,MinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:yixin_xinyuan@163.com)

[KEY WORDS]Sirtuin 6; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation

[ABSTRACT]AIM: To illuminate the effect of sirtuin 6 (SIRT6) on the proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cells. METHODS: The mRNA expression of SIRT6 in the peripheral blood from 200 cases of HCC patients and 50 cases of healthy people was detected by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). The mRNA expression levels of SIRT6 in the peripheral blood from 200 cases of HCC patients were combined with multiple clinicopathologic parameters for statistical analysis. The protein expression of SIRT6 in primary hepatocytes, immortalized hepatocytes and 4 hepatoma cell lines were determined by Western blotting. The silencing ofSIRT6 was conducted by transfection of vector expressing short hairpin RNA targeting onSIRT6, and the protein level of SIRT6 was measured by Western blotting. The viability of HCC cells was tested by MTS assay. DNA synthesis was analyzed by Cell-LightTMEdU Apollo?488InVitroImaging Kit. The abilities of colony formation and anchorage-dependent growth were measured by colony formation assay and soft agar assay, respectively. RESULTS: The mRNA expression of SIRT6 in the peripheral blood of HCC patients was significantly higher than that in the healthy people, and its expression was highly associated with tumor size, tumor grade and vascular invasion. SIRT6 expression in 4 hepatoma cell lines was significantly higher than that in the others.SIRT6 silencing led to a significant decrease in the cell viability as tested by MTS assay. EdU staining revealed thatSIRT6 silencing reduced DNA synthesis.SIRT6 silencing reduced the ability of colony formation and anchorage-dependent growth as determined by colony formation assay and soft agar assay, respectively. CONCLUSION: Sirtuin 6 promotes the proliferation and malignant transformation of HCC cells.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1031- 06

[收稿日期]2016- 01- 11[修回日期] 2016- 02- 24

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81472271)

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[中圖分類號]R735.7; R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.012