原發(fā)性肝癌患者CTCs與CD4+/CD8+、NLR、TTV及腫瘤分期的相關(guān)性研究*

萬　磊，　陳佳佳，　劉建軍，　闞和平

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科， 廣東 廣州 510515)

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原發(fā)性肝癌患者CTCs與CD4+/CD8+、NLR、TTV及腫瘤分期的相關(guān)性研究*

萬磊，陳佳佳，劉建軍，闞和平△

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科， 廣東 廣州 510515)

[摘要]目的： 探討原發(fā)性肝癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)與T細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(NLR)、腫瘤總體積(TTV)及腫瘤分期的關(guān)系。方法：收集80例原發(fā)性肝癌患者外周血，采用益善生物技術(shù)公司使用的“免疫去除結(jié)合納米過濾法” CanPatrolTM行CTCs 檢測。同時使用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量；收集患者外周血中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、腫瘤最大直徑及腫瘤分期等臨床病理參數(shù)。計算出外周血CD4+/CD8+比值、NLR及TTV。根據(jù)CD4+/CD8+平均值及TTV、NLR中位數(shù)將CD4+/CD8+比值、TTV和NLR分為高、低2組；根據(jù)肝癌第7版TMN分期標(biāo)準(zhǔn)將患者分為I+II 期和 III+IV期2組。分別比較CTCs在2組中的差別。結(jié)果：高CD4+/CD8+比值組外周血CTCs數(shù)及間質(zhì)型CTCs數(shù)明顯低于低CD4+/CD8+比值組(P<0.05)。高TTV組外周血的CTCs數(shù)、間質(zhì)型CTCs數(shù)及混合型CTCs數(shù)明顯高于低TTV組(P<0.05)；腫瘤分期 I、 II 期組外周血的CTCs數(shù)、間質(zhì)型CTCs數(shù)及混合型CTCs數(shù)明顯低于 III、IV期組(P<0.05)。高NLR組與低NLR組外周血的CTCs數(shù)、間質(zhì)型CTCs數(shù)、混合型CTCs數(shù)和上皮型CTCs數(shù)間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。結(jié)論：原發(fā)性肝癌患者外周血中存在CTCs；外周血CTCs與T細(xì)胞免疫、TTV及腫瘤分期有顯著相關(guān)：T細(xì)胞免疫越差、TTV越大及腫瘤分期越晚，外周血的CTCs越多。

[關(guān)鍵詞]肝細(xì)胞癌； 循環(huán)腫瘤細(xì)胞； T細(xì)胞免疫； 腫瘤總體積； 中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值； 腫瘤分期

原發(fā)性肝癌患者術(shù)后大多數(shù)死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[1]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是指因自發(fā)或診療操作由原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞[2]， 其存在于多種實體瘤中。正常情況下，腫瘤越大，越容易脫落形成CTCs；腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血后被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別并予以清除，但當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時，將導(dǎo)致一部分CTCs得以存活，因而成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因。目前已有研究證實原發(fā)性肝癌患者外周血CTCs與復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)聯(lián)[3]。但肝癌CTCs與腫瘤總體積、腫瘤分期及機(jī)體細(xì)胞免疫狀況的關(guān)系目前無明確的相關(guān)報道。本研究通過檢測原發(fā)性肝癌患者外周血CTCs、T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+、腫瘤總體積(total tumor volume，TTV)和中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)，探討肝癌CTCs與T細(xì)胞亞群、NLR、TTV及腫瘤分期的關(guān)系，為肝癌的療效評估和術(shù)后治療方式的選擇提供依據(jù)。

材料和方法

1材料

收集2013年8月～2015年8月南方醫(yī)院肝膽外科經(jīng)手術(shù)治療的原發(fā)性肝癌患者80例，其中男56例，女24 例，年齡28～75 歲，中位年齡46 歲。術(shù)后病理均證實為原發(fā)性肝癌。收集患者的外周血中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、腫瘤最大直徑、腫瘤分期等臨床病理資料。其中入選的患者均排除感染、血液系統(tǒng)疾病等疾病，術(shù)前無化療及免疫治療。對入選的患者均于1周內(nèi)抽取靜脈血進(jìn)行血常規(guī)檢查，同時用EDTA抗凝采血管及普通肝素抗凝管抽取10 mL靜脈血進(jìn)行CTCs及T細(xì)胞亞群檢測，血液標(biāo)本均于抽血當(dāng)日處理。

2方法

2.1CTCs的檢測本研究采用廣州益善公司開發(fā)的CanPatrolTM法檢測外周血中CTCs。首先裂解外周血中的紅細(xì)胞，通過納米技術(shù)利用CTCs與白細(xì)胞大小差異進(jìn)行CTCs的分離與富集，然后通過多重mRNA原位分析方法對富集的CTCs進(jìn)行特異性基因核酸定位確定腫瘤細(xì)胞，最后通過多重RNA探針，分別針對多種CTCs特異性基因，通過不同顏色的熒光信號，將外周血中的CTCs進(jìn)行分型[4]。

2.2T淋巴細(xì)胞亞群CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的檢測患者外周靜脈血2 mL加入乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，充分混勻后待測。外周血T淋巴細(xì)胞亞群采用貝克曼-庫爾特FC-500流式細(xì)胞儀及CD45-異硫氰酸熒光素(FITC)/CD4-藻紅蛋白(RD1)/CD8-藻紅蛋白德州紅(ECD)熒光抗體檢測。CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+比值采用流式細(xì)胞儀和CXP軟件進(jìn)行熒光信號參數(shù)獲取和分析。

2.3計算TTV、NLR和CD4+/CD8+比值根據(jù)影像學(xué)數(shù)據(jù)評估腫瘤負(fù)荷，腫瘤體積(cm3)=4/3×3.14×r3(r=可測量腫瘤結(jié)節(jié)的最大半徑)。腫瘤總體積等于各可測量病灶體積總和。NLR為外周血中性粒細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞數(shù)；CD4+/CD8+比值為外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)/CD8+T細(xì)胞數(shù)。

2.4分組本研究根據(jù)TTV中位數(shù)38.86 cm3、NLR中位數(shù)2.65及CD4+/CD8+比值平均值0.921為臨界值分組；根據(jù)肝癌第七版TMN分期標(biāo)準(zhǔn)將患者分為 I+II 期組和 III+IV期組2組，其中I+II 期組38例，III+IV期組42例。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman方法分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1外周血CTCs檢測結(jié)果

CanPatrolTM法檢測CTCs，發(fā)現(xiàn)肝癌外周血中存在上皮型、間質(zhì)型和混合型3種不同類型的CTCs。其中上皮型為CD45探針陰性，EpCAM和CK8、9及19探針陽性，熒光鏡下為紅色熒光信號；間質(zhì)型為CD45探針陰性，vimentin探針及Twist探針陽性，熒光鏡下為綠色熒光信號；而混合型則在熒光鏡下顯示紅色及綠光信號。在入組患者中CTCs的檢出率為87.5%(70/80)，其中上皮型CTCs檢出率為77.5%(62/80)，間質(zhì)型CTCs的檢出率為67.5%(54/80)，混合型CTCs的檢出率為72.5%(58/80)，見圖1。

2外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

原發(fā)性肝癌患者外周血的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見圖2。圖中右上象限分別為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的檢測情況。

Figure 1.Observation of the epithelial CTCs (A), mesenchymal CTCs (B) and hybrid CTCs (C) in the peripheral blood by the method of CanPatrolTM(immunofluorescence，×200).

圖1CanPatrolTM法檢測外周血中的CTCs

Figure 2.The images of the flow cytometry analysis for determining CD4+T cells and CD8+T cells．

圖2CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測圖

3外周血中CTCs與CD4+/CD8+比值的關(guān)系

高CD4+/CD8+組的間質(zhì)型CTCs及CTCs總數(shù)較低CD4+/CD8+組明顯減少，兩組之間CTCs數(shù)的差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；而外周血中的上皮型CTCs數(shù)及混合型CTCs數(shù)在2組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表1。

*P<0.05,**P<0.01vshigh CD4+/CD8+group.

4CTCs與TTV及腫瘤分期的關(guān)系

高TTV組的CTCs總數(shù)、間質(zhì)型CTCs及混合型CTCs數(shù)目明顯高于低TTV組，2組之間差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，而2組上皮型CTCs數(shù)目的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見表2；腫瘤分期Ⅰ+Ⅱ期組患者外周血的CTCs總數(shù)、間質(zhì)型CTCs及混合型CTCs數(shù)目均低于Ⅲ+Ⅳ期組，2組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，而2組上皮型CTCs數(shù)目的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表3。

5NLR與CTCs的關(guān)系

研究結(jié)果表明高NLR組和低NLR組間的外周血中CTCs總數(shù)、間質(zhì)型CTCs、混合型CTCs及上皮型CTCs數(shù)目的差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表4。

*P<0.05,**P<0.01vshigh TTV group.

*P<0.05vsI+II group.

討論

1869 年Ashworth 從血液中發(fā)現(xiàn)有一種血細(xì)胞同尸檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞相似，首次提出CTCs 這一概念[2]。進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的CTCs 絕大多數(shù)在機(jī)體的免疫作用下發(fā)生凋亡，少數(shù)可以存活下來，形成轉(zhuǎn)移灶。盡管如此，CTCs 具有與原發(fā)灶相似乃至相同性質(zhì)特征，因此可以作為一種代表原發(fā)腫瘤的“液態(tài)活檢標(biāo)本”。檢測外周血中的CTCs，有助于肝癌 的早期診斷、有助于對復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的監(jiān)測和對預(yù)后的預(yù)測，有助于治療手段的選擇以及優(yōu)化。研究表明，外周血中CTCs存在不同型別，間質(zhì)型CTCs比上皮型CTCs和混合型CTCs具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，外周血中檢測出間質(zhì)型CTCs，則腫瘤發(fā)生惡化、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險明顯增高[5]。

機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。而在機(jī)體抗腫瘤免疫中，T細(xì)胞免疫發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究證實，肝癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)[6-7]。肝癌患者存在CD4+/CD8+比值失衡，CD4+/CD8+比值可反映機(jī)體T細(xì)胞免疫功能，比值越低表示T細(xì)胞免疫功能越差[8]。本研究表明高CD4+/CD8+比值組，外周血CTCs總數(shù)及間質(zhì)型CTCs、混合型CTCs數(shù)目顯著低于低CD4+/CD8+比值組，這一方面可能與CD4+T淋巴細(xì)胞減少，而抑制性CD8+T淋巴細(xì)胞增多，更加抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)及殺傷效應(yīng)，對外周血的CTCs的識別能力及殺傷清除能力明顯下降有關(guān)；另一方面，研究顯示腫瘤細(xì)胞在進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)時需經(jīng)過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[9]，間質(zhì)化后的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力，使其更容易侵入血管進(jìn)入血液；在上述轉(zhuǎn)化過程中，腫瘤細(xì)胞可能通過細(xì)胞表面抗原成分改變逃避機(jī)體免疫監(jiān)視而避免被機(jī)體消滅。本研究表明，T細(xì)胞免疫功能越差，肝癌患者CTCs就越多，特別是更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的CTCs增多，是引起肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因。

TTV是臨床用于評估腫瘤負(fù)荷的新型指標(biāo)，比起單純使用腫瘤最大直徑及腫瘤個數(shù)相比，TTV更能準(zhǔn)確反映腫瘤負(fù)荷[10]。隨TTV的增加，肝癌患者的死亡風(fēng)險比呈進(jìn)行性升高[11]；本研究表明高TTV組肝癌患者外周血CTCs總數(shù)、間質(zhì)型及混合型CTCs數(shù)目明顯高于低TTV組患者，可能是隨著TTV不斷增大，腫瘤細(xì)胞不斷增殖，通過EMT等形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞會分泌胞外酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，造成細(xì)胞間及細(xì)胞與周圍基質(zhì)間相互附著力下降，從而利于腫瘤細(xì)胞逃離組織束縛進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)形成CTCs。TTV大的患者預(yù)后較差，可能與患者外周血中CTCs增多密切相關(guān)。TNM分期是目前臨床上用于肝癌最常用的的分期方法之一，分期越晚提示預(yù)后越差，我們研究結(jié)果認(rèn)為Ⅲ、Ⅳ期患者外周血CTCs總數(shù)、間質(zhì)型及混合型CTCs數(shù)目明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者，上述結(jié)果可充分解釋分期越晚預(yù)后越差，但臨床上部分I期患者術(shù)后早期內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而且我們在檢測CTCs時發(fā)現(xiàn)部分I期患者外周CTCs數(shù)量較多，提示TNM分期存在一定誤差，導(dǎo)致部分晚期患者被誤認(rèn)為早期，從而耽誤患者治療。本研究表明外周血CTCs類型、數(shù)目與TNM分期關(guān)系密切，因此也許可將外周血CTCs作為TNM分期的一項指標(biāo)，從而進(jìn)一步減少TNM分期與臨床之差異。

研究表明炎癥在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用，機(jī)體炎癥程度與腫瘤患者的預(yù)后有密切關(guān)系[12]。NLR作為一個評估中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞相對水平的免疫學(xué)指標(biāo), 能反映機(jī)體中促瘤性炎癥反應(yīng)與抗瘤性炎癥反應(yīng)的平衡關(guān)系，有研究表明NLR是肝癌的獨立預(yù)后因素，NLR相對較高的患者預(yù)后差[13]。本研究表明外周血CTCs類型、數(shù)目與NLR無明顯關(guān)聯(lián)，但我們發(fā)現(xiàn)NLR高組外周血CTCs數(shù)目較低組要少，提示體內(nèi)適當(dāng)?shù)目鼓[瘤炎癥存在有利于消滅外周血CTCs。

總之，肝癌患者外周血中存在CTCs，而外周血CTCs與TTV及腫瘤分期存在正相關(guān)關(guān)系，與T細(xì)胞免疫存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，患者T細(xì)胞免疫功能越差、TTV越大及腫瘤分期越晚，外周血中CTCs數(shù)量及惡性程度高的間質(zhì)型CTCs數(shù)目、混合型CTCs數(shù)目明顯增多，因此我們可通過提高患者免疫功能及減少腫瘤負(fù)荷而改善患者預(yù)后。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Yu TT, Xu XM, Hu Y, et al. Long noncoding RNAs in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(23):7208-7217.

[2]Leong SM, Tan KM, Chua HW, et al. Sampling circulating tumor cells for clinical benefits: how frequent?[J]. J Hematol Oncol, 2015, 8(1):1-8.

[3]曹宇勃，許崇安. 循環(huán)腫瘤細(xì)胞預(yù)測肝細(xì)胞癌患者臨床預(yù)后價值的 Meta 分析[J]. 中國全科醫(yī)學(xué), 2014, 17 (12):1394-1399.

[4]Wu S，Liu Z，Lin L,et al. Enrichment and enumeration of circulating tumor cells by efficient depletion of leukocyte fractions[J]. Clin Chem Lab Med, 2013, 53(2):1-9.

[5]Bidard FC, Peeters DJ, Fehm T, et al. Clinical validity of circulating tumour cells in patients with metastatic breast cancer: a pooled analysis of individual patient data[J]. Lancet Oncol, 2014, 15(4):406-414.

[6]Mizukoshi E, Nakamoto Y, Arai K, et al. Comparative analysis of various tumor-associated antigen-specific T-cell responses in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2011, 53(4):1206-1216.

[7]Fu J, Xu D, Liu Z, et al. Increased regulatory T cells correlate with CD8 T-cell impairment and poor survival in hepatocellular carcinoma patients[J]. Gastroenterology, 2007, 132(7):2328-2339.

[8]張一超，夏駿，李雄. 肝硬化合并肝癌及單純肝癌患者免疫功能檢測結(jié)果分析[J]. 檢驗醫(yī)學(xué), 2014, 29 (11):1128-1131.

[9]Chaffer CL, Weinberg RA. A perspective on cancer cell metastasis[J]. Science, 2011, 331(6024):1559-1564.

[10]Toso C, Trotter J, Wei A, et al. Total tumor volume predicts risk of recurrence following liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Liver Transpl, 2008, 14(8):1107-1115.

[11]Huo TI, Hsu CY, Huang YH, et al. Prognostic prediction across a gradient of total tumor volume in patients with hepatocellular carcinoma undergoing locoregional therapy[J]. BMC Gastroenterol, 2010, 10:138.

[12]Roxburgh CS, McMillan DC. Role of systemic inflammatory response in predicting survival in patients with primary operable cancer[J]. Future Oncol, 2010, 6(1):149-163.

[13]Li X, Chen ZH, Ma XK, et al. Neutrophil-to-lymphocyte ratio acts as a prognostic factor for patients with advanced hepatocellular carcinoma[J]. Tumour Biol, 2014, 35(11):11057-11063.

(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Relationship of CTCs with CD4+/CD8+, NLR, TTV and tumor stage in patients with primary hepatocellular carcinoma

WAN Lei, CHEN Jia-jia, LIU Jian-jun, KAN He-ping

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:khp5513@126.com)

[KEY WORDS]Hepatocellular carcinoma; Circulating tumor cells; T-cell immune; Total tumor volume; Neutrophil-to-lymphocyte ratio; Tumor stage

[ABSTRACT]AIM: To explore the relationship of circulating tumor cells (CTCs) with CD4+/CD8+, neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR), total tumor volume (TTV) and tumor stage in the patients with primary hepatocellular carcinoma.METHODS: We selected 80 cases of histologically diagnosed primary hepatocellular carcinoma in the study. The method of CanPatrolTMwas used, which was developed by SurExam biotechnology company to identify CTCs in the blood. CD4+T cells and CD8+T cells were counted by flow cytometry. The patients were divided into 2 groups according to the levels of CD4+/CD8+ratio, NLR and TTV. The patients were also divided into Ⅰ+ Ⅱstage group and Ⅲ+ Ⅳ stage group according to the seventh edition of TMN staging criteria.RESULTS: The numbers of peripheral blood CTCs and mesenchymal CTCs in high CD4+/CD8+ratio group were significantly lower than those in low CD4+/CD8+ratio group (P<0.05). The numbers of peripheral blood CTCs, mesenchymal CTCs and hybrid CTCs in high TTV group were significantly higher than those in low TTV group (P<0.05). The numbers of peripheral blood CTCs, mesenchymal CTCs and hybrid CTCs in I+ II stage group were significantly lower than those in III+ IV stage group (P<0.05). The numbers of peripheral blood CTCs, mesenchymal CTCs, hybrid CTCs and epithelial CTCs between high NLR group and low NLR group had no statistical difference.CONCLUSION: CTCs exist in the peripheral blood of the patients with primary hepatocellular carcinoma. The peripheral blood CTCs have significant correlations with TTV, tumor stage and T-cell immunity．The worse cell immune function, the larger TTV and the later tumor stage a patient has, the more the peripheral blood CTCs are.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1017- 05

[收稿日期]2016- 04- 08[修回日期] 2016- 04- 29

*[基金項目]廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.S2012020010942)

通訊作者△Tel: 020-61641706; E-mail: khp5513@126.com

[中圖分類號]R730．23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.009