IGF-Ⅱ在肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移與侵襲中的作用*

陳　磊,　 陳?ài)锓?　高　飛,　黃　衛(wèi)△

(1廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)二科, 廣東 廣州 510800；2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科， 廣東 廣州 510632)

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IGF-Ⅱ在肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移與侵襲中的作用*

陳磊1, 陳?ài)锓?,高飛2,黃衛(wèi)2△

(1廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)二科, 廣東 廣州 510800；2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科， 廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 以胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)為靶點(diǎn)，觀察不同表達(dá)水平的IGF-Ⅱ?qū)Ω伟〩uh7細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲和遷移的影響，探討IGF-Ⅱ基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，為肝癌的靶向治療提供新的思路。方法: 分別將構(gòu)建好的IGF-Ⅱ基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-IGF-Ⅱ和RNA干擾質(zhì)粒pLVX-shRNA2-IGF-Ⅱ轉(zhuǎn)染肝癌Huh7細(xì)胞，通過(guò)real-time PCR及Western blot檢測(cè)IGF-Ⅱ的表達(dá)，采用CCK-8、平板克隆形成、細(xì)胞劃痕、Transwell小室實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)過(guò)表達(dá)與抑制IGF-Ⅱ?qū)Ω伟〩uh7細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲與遷移的影響。結(jié)果: 過(guò)表達(dá)IGF-Ⅱ能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及侵襲遷移 (P<0.05)，而抑制IGF-Ⅱ的表達(dá)得到相反的結(jié)果。結(jié)論: IGF-Ⅱ參與調(diào)控肝癌Huh7細(xì)胞的生物學(xué)行為，可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ； 肝細(xì)胞癌

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是對(duì)人類構(gòu)成嚴(yán)重威脅的疾病之一，其全球發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，在腫瘤相關(guān)死亡中位居第3位[1]。胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ(insulin-like growth factor Ⅱ,IGF-Ⅱ)，是一種促胚胎生長(zhǎng)因子，現(xiàn)有的研究表明，IGF-Ⅱ在肝癌及癌旁組織中異常過(guò)量表達(dá)，并與分化程度呈負(fù)相關(guān)，即分化程度越低IGF-Ⅱ的表達(dá)量越高，在肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)、不典型增生、肝纖維化等癌前病變中表達(dá)量更高，提示IGF-Ⅱ與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特別是在肝細(xì)胞癌變的早期階段發(fā)揮著重要作用[2-3]，本課題組擬利用前期靶向IGF-Ⅱ基因構(gòu)建的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及RNA干擾質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝癌Huh7細(xì)胞，在細(xì)胞水平上觀察IGF-Ⅱ?qū)Ω伟〩uh7細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為的影響，為尋找肝癌基因治療的新靶點(diǎn)和新方法奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞株Huh7由廣州萊德爾生物科技有限公司提供，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2的濕潤(rùn)無(wú)菌環(huán)境中。

2主要試劑與儀器

pLVX-shRNA2-IGF-Ⅱ和pcDNA3.1(+)-IGF-Ⅱ由前期實(shí)驗(yàn)合成，測(cè)序結(jié)果與已知序列進(jìn)行BLAST完全一致；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(HyClone)；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；SYBRGreenPCRMasterMix(TOYOBO)；BCA法蛋白含量檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)；CCK-8溶液(Beyotime)。定量PCR儀(ABIPRISM?7500SequenceDetectionSystem)；電泳儀(北京百晶生物科技有限公司BG-Power600i);酶標(biāo)儀(Thermo)。

3方法

3.1實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染根據(jù)IGF-Ⅱ在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，分5個(gè)組：blank組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染;IGF-Ⅱ?qū)φ战M轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒;IGF-Ⅱ組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-IGF-Ⅱ重組質(zhì)粒;siIGF-Ⅱ組轉(zhuǎn)染pLVX-shRNA2-IGF-Ⅱ重組質(zhì)粒的細(xì)胞;siIGF-Ⅱ?qū)φ战M轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前1d，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞，接種于不同試驗(yàn)需要的培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右，根據(jù)說(shuō)明書采用Lipofectamine2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3.2IGF-Ⅱ 表達(dá)的real-timePCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，按照TRIzol說(shuō)明書抽提細(xì)胞總RNA，進(jìn)行總RNA純度和完整性檢測(cè)后，在PCR儀上完成逆轉(zhuǎn)錄得到產(chǎn)物cDNA，并以此為模板，采用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，IGF-Ⅱ的PCR上游引物序列為5’-CTGGAGACGTACTGTGCTA-3’, 下游引物序列為5’-GACTGCTTCCAGGTGTCAT-3’;內(nèi)參照18S的PCR上游引物序列為5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物序列為5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30s；95 ℃ 5s，60 ℃ 30s，72 ℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)real-timePCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，每個(gè)樣品重復(fù)3次。IGF-II的mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

3.3IGF-Ⅱ表達(dá)的Westernblot檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，按照蛋白提取試劑盒抽提細(xì)胞總蛋白，使用BCA法蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。再進(jìn)行SDS-PAGE，選擇恒壓電泳：80V恒壓電泳30min，肉眼見(jiàn)到溴酚藍(lán)指示劑跑到分離膠水平后，改成100V恒壓電泳直到溴酚藍(lán)剛跑出膠底部便可終止，將凝膠電泳結(jié)果轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上；孵育Ⅰ抗、Ⅱ抗進(jìn)行免疫印記。

3.4IGF-Ⅱ表達(dá)對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的影響采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)，按照每1×104個(gè)的接種量將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔，每孔體積200μL；將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜；收集各個(gè)時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞(0、24、48、72h)，在避光條件下每孔加入10μLCCK-8溶液，于37 ℃繼續(xù)孵育4h；酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值即A值；根據(jù)同一樣品的“增殖率(%)=待測(cè)時(shí)點(diǎn)A值平均值÷0hA值平均值×100%”公式，并以增殖率為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

3.5IGF-Ⅱ表達(dá)對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞克隆形成能力的影響采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，分別按照每孔50、100和200個(gè)細(xì)胞的接種量將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組總共接種9個(gè)孔；將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每天察看，當(dāng)有細(xì)胞克隆形成時(shí)即可吸掉各孔的培養(yǎng)基終止培養(yǎng)，PBS緩沖液漂洗2次，每孔加入100μL的甲醇溶液室溫下固定15min，然后棄去固定液；每孔加入200μL蘇木素染色液充分覆蓋皿底染色20min后，自來(lái)水沖洗后晾干，計(jì)算集落數(shù)；使用酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像自動(dòng)分析儀分析、掃描拍照；根據(jù)“克隆形成率(%)=克隆數(shù)÷接種細(xì)胞數(shù)×100%”的公式，計(jì)算克隆形成率。

3.6IGF-Ⅱ?qū)Ω伟〩uh7細(xì)胞遷移能力的影響采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌Huh7細(xì)胞接種6孔培養(yǎng)板上，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；待細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)，使用10μL無(wú)菌微量移液槍頭在細(xì)胞板上劃?rùn)M線，盡量用力均勻一致、不要傾斜；用無(wú)菌的PBS液沿培養(yǎng)皿的側(cè)壁輕輕地沖洗細(xì)胞3次，洗去劃下的細(xì)胞； 加入不含血清的培養(yǎng)基置于37 ℃孵箱中進(jìn)行孵育，分別于劃痕后0、6、24和48h取樣，拍照；Image-ProPlus6.0軟件測(cè)量各組細(xì)胞相同時(shí)點(diǎn)任意8個(gè)部位劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率[(0h距離-其它時(shí)點(diǎn)距離)/0h距離],以反映各組肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力。

3.7IGF-Ⅱ?qū)Ω伟〩uh7細(xì)胞侵襲能力的影響采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，將上室放入下室(24孔板)中，每個(gè)上室中加入2滴無(wú)血清培養(yǎng)基使膜浸潤(rùn)，放入培養(yǎng)箱中，棄去上室中浸膜用的培養(yǎng)基，每個(gè)上室中加入200μL的單細(xì)胞懸液(即每室1×105個(gè)細(xì)胞)，每個(gè)下室中加入600μL完全培養(yǎng)基，每組細(xì)胞做6個(gè)小室，共30個(gè)小室；在培養(yǎng)箱中孵育30h后，取出小室，用棉簽拭去上室的細(xì)胞，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定5min，蘇木素溶液染色10min；切去小室膜，置于載玻片上，滴少許二甲苯覆蓋，再滴樹膠上蓋蓋玻片；計(jì)數(shù)，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS15.0軟件處理各組數(shù)據(jù)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，再做單因素方差分析(one-wayANOVA)，然后兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用t’檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1IGF-ⅡmRNA在各組肝癌Huh7細(xì)胞中的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)不同試驗(yàn)組中IGF-ⅡmRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅱ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組IGF-ⅡmRNA表達(dá)顯著高于IGF-Ⅱ?qū)φ战M(P<0.05)；而siIGF-Ⅱ組IGF-ⅡmRNA的表達(dá)顯著低于siIGF-Ⅱ?qū)φ战M(P<0.05),blank組與IGF-Ⅱ?qū)φ战M、siIGF-Ⅱ?qū)φ战M無(wú)明顯差異。此結(jié)果說(shuō)明，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄，在siIGF-Ⅱ組IGF-Ⅱ基因的轉(zhuǎn)錄也被成功抑制，見(jiàn)圖1。

2IGF-Ⅱ蛋白在各組肝癌Huh7細(xì)胞中的表達(dá)

用DAB顯色法，分別對(duì)5組蛋白樣品中IGF-Ⅱ蛋白及內(nèi)參照GAPDH進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示各組中GAPDH表達(dá)量基本一致，然而IGF-Ⅱ在5組的表達(dá)量存在較大差異。在IGF-Ⅱ組的IGF-Ⅱ表達(dá)量顯著高于blank組，siRNA組中的表達(dá)量顯著低于blank組，而IGF-Ⅱ?qū)φ战M、siIGF-Ⅱ?qū)φ战M與blank組比較，IGF-Ⅱ蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，見(jiàn)圖2。

Figure1.RelativeexpressionofIGF-IImRNAinHuh7cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vsIGF-IIgroup;#P<0.05 vssiIGF-IIgroup.

圖1肝癌Huh7細(xì)胞IGF-II mRNA的相對(duì)表達(dá)量

Figure 2.IGF - II protein expression level in Huh7 cells.

圖2肝癌Huh7細(xì)胞IGF-II 蛋白水平的表達(dá)量

3IGF-Ⅱ表達(dá)對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響

采用CCK-8法檢測(cè)Huh7細(xì)胞生長(zhǎng)速度的改變，結(jié)果顯示，從第1天開始，IGF-Ⅱ組細(xì)胞A值就顯著高于blank組及IGF-Ⅱ?qū)φ战M(P<0.05)，而IGF-Ⅱ?qū)φ战M與blank組無(wú)明顯差異；從第2天開始，siIGF-Ⅱ組細(xì)胞A值顯著低于blank組及siIGF-Ⅱ?qū)φ战M(P<0.05)，siIGF-Ⅱ?qū)φ战MA值與blank組無(wú)明顯差異，見(jiàn)表1。

*P<0.05vsIGF-Ⅱgroup;▲P<0.05vssiIGF-Ⅱ group.

4IGF-Ⅱ表達(dá)對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞增殖能力的影響

采用平板克隆實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，IGF-Ⅱ組細(xì)胞克隆形成率顯著高于blank組及IGF-Ⅱ?qū)φ战M(P<0.05)，而IGF-Ⅱ?qū)φ战M與blank組無(wú)明顯差異；siIGF-Ⅱ組細(xì)胞克隆形成率顯著低于blank組及siIGF-Ⅱ?qū)φ战M，而siIGF-Ⅱ?qū)φ战M與blank組無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖3、4。

Figure 3.Colony formation experiment of Huh7 cells.

圖3肝癌Huh7細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

5IGF-Ⅱ表達(dá)對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞遷移能力的影響

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)劃痕6 h后，與blank組和IGF-Ⅱ?qū)φ战M相比，IGF-Ⅱ組的遷移能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，48 h后劃痕已經(jīng)基本被遷移過(guò)來(lái)的細(xì)胞所覆蓋；siIGF-Ⅱ組的Huh7細(xì)胞遷移能力則明顯下降(P<0.05),見(jiàn)圖5、表2。

Figure 4.Colony formation efficiency of Huh7 cells.Mean±SD.n=9.*P<0.05vsIGF-II group;#P<0.05vssiIGF-II group.

圖4肝癌Huh7細(xì)胞平板克隆率

6IGF-Ⅱ表達(dá)對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞侵襲能力的影響

采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅱ組的Huh7細(xì)胞，穿膜細(xì)胞數(shù)量顯著高于blank組及IGF-Ⅱ?qū)φ战M(P<0.05)，而IGF-Ⅱ?qū)φ战M與blank組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。siRNA組的Huh7細(xì)胞相對(duì)于blank組及siIGF-Ⅱ?qū)φ战M，穿膜細(xì)胞數(shù)量顯著降低 (P<0.05)，而siIGF-Ⅱ?qū)φ战M與blank組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6、7。

Figure 5.Scratch experiment images of Huh7 cells.

圖5肝癌Huh7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

*P<0.05vsIGF-Ⅱ;▲P<0.05vsblank.

Figure 6.The representative result of Transwell experiment of Huh7 cells.

圖6肝癌Huh7細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)

Figure 7.Transwell experiment results in Huh7 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsIGF-II group;#P<0.05vssiIGF-II group.

圖7肝癌Huh7穿膜細(xì)胞數(shù)

討論

HCC是世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤之一，我國(guó)屬于高發(fā)地區(qū)，在腫瘤相關(guān)死亡原因中占第3位[1]，其發(fā)病率及死亡率逐年遞增，其起病隱匿且早期極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此有效抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是治療肝癌的關(guān)鍵。

在肝癌的發(fā)生早期，IGF-Ⅱ在肝癌組織中已有過(guò)量表達(dá)，高于癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織，并與分化程度呈負(fù)相關(guān)，即分化程度越低IGF-Ⅱ的表達(dá)量越高，而且在肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)及肝細(xì)胞不典型增生這些肝癌前病變中表達(dá)量更高，在肝炎、肝硬化到肝細(xì)胞癌的整個(gè)演變過(guò)程中，IGF-Ⅱ mRNA的異常表達(dá)也表現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢(shì)，這些研究結(jié)果提示IGF-Ⅱ與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其在肝癌的初期階段發(fā)揮著重要作用[2-3]。

1IGF-Ⅱ表達(dá)與肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的關(guān)系

IGF-Ⅱ作為一種非常強(qiáng)的絲裂原，可以促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖調(diào)控因子，我們采用CCK-8法和平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察IGF-Ⅱ表達(dá)與肝癌的生長(zhǎng)和增殖的關(guān)系，結(jié)果顯示：高表達(dá)IGF-Ⅱ?qū)Ω伟〩uh7細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有促進(jìn)作用，下調(diào)IGF-Ⅱ表達(dá)可抑制肝癌的生長(zhǎng)。其它抑制IGF-Ⅱ表達(dá)方法也有相似效果，如Zhang等[4]利用以IGF-Ⅱ基因P3啟動(dòng)子為靶點(diǎn)合成的脫氧核酶轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞成功下調(diào)IGF-Ⅱ基因，MTT法繪制生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比生長(zhǎng)能力被明顯抑制。Yao等[5]通過(guò)構(gòu)建靶向IGF-Ⅱ的miRNA轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞下調(diào)IGF-Ⅱ基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的克隆形成能力下降。目前認(rèn)為其可能的機(jī)制是肝癌細(xì)胞通過(guò)分泌大量的IGF-Ⅱ，直接作用于自身或通過(guò)細(xì)胞間隙作用于周圍肝細(xì)胞膜上的IGF-ⅠR和/或IGF-ⅡR，促發(fā)分子間及信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成一個(gè)自我促進(jìn)增殖的自分泌及旁分泌系統(tǒng)，以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[6-8]。阻斷IGF-Ⅱ表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞則有可能成為肝癌基因治療的手段之一。

2IGF-Ⅱ表達(dá)與肝癌細(xì)胞遷移、侵襲的關(guān)系

目前已有臨床觀察發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅱ與肝癌的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，如Qian等[9]利用PCR法檢測(cè)38例伴肝外轉(zhuǎn)移的肝癌患者,其循環(huán)中IGF-ⅡmRNA陽(yáng)性率達(dá)100%，遠(yuǎn)高于不伴肝外轉(zhuǎn)移者11.1%的陽(yáng)性率；Xiong等[10]利用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)肝癌患者血清中IGF-Ⅱ含量，發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅱ的水平與化療后肝癌的轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)。相關(guān)研究表明[11-12]，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中miR-625可通過(guò)抑制IGF-II mRNA結(jié)合蛋白1(IGF-ⅡBP1)阻止肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。我們?cè)诩?xì)胞水平利用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅱ的表達(dá)對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞的侵襲遷移有促進(jìn)作用，下調(diào)IGF-Ⅱ表達(dá)能夠削弱肝癌的侵襲遷移能力，其機(jī)制尚未清楚，有研究表明[13],肝癌細(xì)胞遷移、侵襲與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)，我們將行進(jìn)一步研究來(lái)驗(yàn)證IGF-Ⅱ是否涉及其中。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Role of IGF-Ⅱ in proliferation and migration of hepatocellular carcinoma Huh7 cells

CHEN Lei1, CHEN Shan-fang2, GAO Fei2, HUANG Wei2

(1SecondDepartmentofInternalMedicine,GuangzhouCityHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,Guangzhou510800,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thuangw@163.com)

[KEY WORDS]Insulin-like growth factor Ⅱ; Hepatocellular carcinoma

[ABSTRACT]AIM: To observe the effects of insulin-like growth factorⅡ (IGF-Ⅱ) at different expression levels on hepatocellular carcinoma Huh7 cell proliferation and migration, and to explore the role of IGF-Ⅱ in the development of HCC. METHODS: The Huh7 cells were transfected with the over-expression plasmid pcDNA3.1(+)- IGF-Ⅱ or RNA interference plasmid pLVX-shRNA-IGF-Ⅱ by Lipofectamine 2000. The quantitative real-time PCR and Western blotting were used to verify the expression of IGF-II. The biological behaviors of the Huh7 cells were analyzed by CCK-8 assay, plate clone formation assay, cell scratch test and Transwell chamber experiment.RESULTS: Over-expression of IGF-II promoted the growth and migration of hepatocellular carcinoma cells (P<0.05), and the cell proliferation was significantly inhibited in the Huh7 cells with low IGF-II expression (P<0.05).CONCLUSION: IGF-II is involved in the regulation of biological behavior of hepatocellular carcinoma Huh7 cellsinvitro, which may play a promoting role in the development of hepatocellular carcinoma．

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 1011- 06

[收稿日期]2015- 11- 10[修回日期] 2016- 04- 15

*[基金項(xiàng)目]廣東省科技計(jì)劃(No. 2010B080701063)

通訊作者△Tel: 020-38688931; E-mail: thuangw@163.com

[中圖分類號(hào)]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.008