達努塞替對HL-60細胞抗腫瘤作用機制的研究*

何思佳，　舒莉萍，　任　濤，　何志旭△

(1貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科，貴州 貴陽 550001；2第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院腫瘤科，重慶 400042)

?

達努塞替對HL-60細胞抗腫瘤作用機制的研究*

何思佳1，舒莉萍1，任濤2，何志旭1△

(1貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科，貴州 貴陽 550001；2第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院腫瘤科，重慶 400042)

[摘要]目的： 探討絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑達努塞替對人急性髓細胞白血病(AML)細胞株HL-60的細胞周期阻滯、自噬和凋亡的影響。方法: 用MTT法檢測達努塞替對HL-60細胞的生長抑制作用；用流式細胞術檢測相同時間不同濃度藥物組與同一濃度不同時間組的細胞周期、細胞凋亡及細胞自噬；用Western blot方法檢測細胞周期相關蛋白CDK1/CDC2、 CDK2、 cyclin B1、 P21Waf1/Cip1、P27Kip1和 P53，凋亡相關蛋白Bcl-xL、Bcl-2、 Bax、 PUMA、cleaved caspase-3及cleaved caspase-9以及自噬相關蛋白p-PI3K、PTEN、p-Akt、 p-mTOR、Beclin 1、LC3-I和LC3-II的水平。用共聚焦顯微鏡檢測同時間不同濃度藥物組細胞的自噬情況。結果: 達努塞替能明顯抑制HL-60細胞的活力，誘導細胞周期G2/M期阻滯，可以通過線粒體caspase-3途徑誘導細胞凋亡，同時可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導細胞自噬。結論: 達努塞替可通過抑制作為染色體伴侶蛋白且在有絲分裂中調控染色質復制與分離的極光激酶A/B有效抑制HL-60細胞生長，引起細胞周期阻滯、凋亡和自噬發(fā)生，可能是AML臨床治療具有前景的抗腫瘤靶點。

[關鍵詞]PI3K/Akt/mTOR信號通路； 細胞周期； 細胞凋亡； 自噬； HL-60細胞

急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)的一種亞型，以骨髓及外周血中異常增多的早幼粒細胞為主要特征，占AML的15%，預后兇險[1-2]。出血并發(fā)癥是導致APL早期死亡主要原因。因此，研究AML新的治療靶點和開發(fā)新藥十分必要。

極光激酶(Aurora kinase)家族是一類結構與功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞有絲分裂中起重要調控作用[3-5]。其活性異常及過表達可以導致非整倍體的出現(xiàn)及細胞癌變。Sen等[4]首先發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌中極光激酶A的高表達，并相繼在胰腺癌和胃癌細胞中發(fā)現(xiàn)極光激酶A的過表達。而且，極光激酶A和B的過表達可促進AML的病情進展，增加AML細胞的增殖能力和侵襲性[6]。因此，抑制極光激酶成為腫瘤治療的新策略。

已有一些靶向極光激酶的抑制劑，且顯示出抑制腫瘤生長的作用，有望進入臨床[7]。絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑達努塞替(danusertib，Danu；化學結構見圖1A)是一種有效的泛極光激酶抑制劑，對極光激酶家族成員均有抑制作用，但主要抑制極光激酶B，極具發(fā)展前景[8-9]。目前，國內尚未見有關于使用達努塞替作用于AML細胞的基礎研究。

材料和方法

1細胞株與試劑

人HL-60細胞株由美國南佛羅里達大學周樹鋒教授惠贈。達努替塞、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Sigma；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自Thermo；細胞凋亡試劑盒購自BD ；自噬檢測試劑盒購自Enzo Life Sciences；p-Aurora kinase B、Aurora kinase B、p-mTOR、m-TOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt抗體均購自于CST；β-actin及II 抗購自于Santa Cruz。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組HL-60細胞使用含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)、鏈霉素(100 mg/L)和2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM(Corning)培養(yǎng)液，細胞在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。實驗分為空白對照組、陰性對照組(0.05%的DMSO)和Danu實驗組。Danusertib實驗組用0.1、1和5 μmol/L的Danu處理HL-60細胞24 h，或用5 μmol/L Danu處理HL-60細胞4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h后觀察相關指標變化。

2.2MTT法檢測細胞活力取對數(shù)生長期的HL-60細胞加入96孔板， 每孔8 000個。設空白對照組、陰性對照組(0.05%的DMSO)和Danu實驗組，每組設6個復孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入 MTT試劑，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3 h，離心去上清，再加入100 μL DMSO，酶標儀490 nm處讀吸光值。通過在Danu濃度曲線下細胞的相對活力值計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2.3流式細胞術檢測細胞周期收集各組HL-60細胞，PBS洗2次，分別以3 mL 70%的乙醇固定于-20 °C過夜，用含有1 g/L RNase A 和50 mg/L PI的PBS重懸細胞。室溫下避光孵育30 min 后使用流式細胞儀(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)檢測G1、S與G2/M期的細胞分布情況。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡收集各組HL-60細胞預冷PBS洗2次，用含有2.5 μL的Annexin V-PE和2.5 μL的7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D,7-AAD；核酸染料)的1×binding buffer 100 μL輕柔重懸細胞，室溫避光孵育15 min后，加入150 μL 1×binding buffer，在1 h內使用流式細胞儀檢測細胞死亡率、早期凋亡率及晚期凋亡率。

2.5流式細胞術檢測細胞自噬收集各組HL-60細胞，分別用250 μL 1×assay 緩沖液洗滌 1 次，再用250 μL含有0.25 μL Cyto-ID和0.25 μL Hoechst的1×assay緩沖液輕柔重懸細胞，置于37 °C避光孵育30 min，離心棄上清，分別加入250 μL 1×assay緩沖液輕柔混后移入流式管，置于冰上于1 h內于流式細胞儀檢測細胞自噬率。

2.6Western blot檢測細胞周期相關蛋白及PI3K/mTOR信號通路相關蛋白的表達取處于對數(shù)生長期的HL-60細胞，按預定濃度和時間Danu處理細胞后，預冷PBS洗滌2次，加入細胞裂解液110 μL冰上裂解，14 000g/min、4 ℃離心15 min，平衡后，100 ℃下變性5 min。35 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，孵I抗4 ℃過夜，II抗室溫孵育2 h，使用化學發(fā)光劑Bio-Rad ChemiDocTMXRS 顯影，條帶用Image Lab 3.0 (Bio-Rad)軟件分析。

2.7激光共聚焦顯微鏡觀察HL-60細胞自噬分別收集0.1、1和5 μmol/L濃度的Danu處理24 h后的HL-60細胞，1×assay 緩沖液洗滌1次，使用100 μL含有0.25 μL Cyto-ID與0.25 μL Hoechst的1×assay緩沖液輕柔混勻細胞，37 ℃避光孵育30 min，1×assay緩沖液洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min后， 1×assay緩沖液洗3次。取5 μL細胞滴入載玻片，用蓋玻片推片，滴入20 μL含有DAPI的Mouting media(Sigma)并指甲油封片，使用TCS SP2 laser scanning 共聚焦顯微鏡(Leica)，以405/488 nm波長檢測HL-60細胞自噬信號。

3統(tǒng)計學處理

采用Prism 5.0統(tǒng)計學軟件進行結果處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較則采用單因素方差分析(one-way ANOVA)結合Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1達努塞替對HL-60細胞活力的抑制

MTT方法檢測結果顯示，以0.1、1、10、25、50和100 μmol/L Danu處理HL-60細胞24 h，細胞生長抑制率分別為97.2%、99.3%、71.5%、61.9%、32.9%和30.1%，與對照組相比，Danu能明顯抑制HL-60細胞生長(P<0.05)，IC50值為30.19 μmol/L,見圖1B。

Figure 1. The chemical structure (A) and the effect of danusertib (Danu) on the viability of HL-60 cells for 24 h determined by MTT assay (B). Mean±SD.n=3.

圖1達努塞替的化學結構及其對HL-60細胞活力的影響

2達努塞替對HL-60細胞中極光激酶B的抑制

如圖2所示，與對照組比較，0.1～5 μmol/L Danu處理HL-60細胞24 h后細胞中磷酸化極光激酶B的表達量均有所降低，其中1和5 μmol/L處理組的降低效應最顯著；達努塞替明顯抑制磷酸化極光激酶B活性，而總極光激酶B表達量無明顯變化(P<0.05)。

Figure 2. Danusertib (Danu) inhibited the expression of phosphorylated Aurora kinase B in the HL-60 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2達努塞替抑制HL-60細胞磷酸化極光激酶B的表達

3達努塞替誘導HL-60細胞周期G2/M阻滯

用1和5 μmol/L的達努塞替處理24 h后的HL-60細胞G2/M期百分率與對照組細胞相比均顯著增加 (P<0.01)。使用5 μmol/L的達努塞替在不同時點處理HL-60細胞后，與對照組細胞相比G2/M期增加明顯，48 h和72 h差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3A。

Western blot檢測細胞周期相關蛋白的結果顯示，促進細胞有絲分裂的蛋白質CDK1/CDC2、 CDK2和cyclin B1的表達量顯著降低，相反，抑制細胞有絲分裂的蛋白質P21Waf1/Cip1、P27Kip1和 P53的表達量顯著增加。24 h的實驗組中cyclin B1的表達量被顯著抑制，CDK1/CDC2的表達量僅在5 μmol/L濃度組低于對照組；相反，P27Kip1和 P53的蛋白表達量與對照組細胞相比明顯增加,見圖3B。

4達努塞替通過激活線粒體途徑誘導HL-60細胞發(fā)生凋亡

5 μmol/L Danu處理細胞24 h后，細胞凋亡率較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。觀察藥物的時間依賴性可見，使用5 μmol/L的達努塞替處理細胞4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h的凋亡百分率分別為8.6%、9.8%、9.8%、10.3%、9.4%和13.4%;其中，在藥物處理24 h和72 h后，細胞凋亡相對于對照組明顯增加(P<0.01),見圖4A。

0.1～5 μmol/L Danu處理細胞24 h后,促細胞凋亡蛋白Bax表達量較對照組高，而抑制細胞凋亡的蛋白Bcl-2和Bcl-xL減少。Bcl-2家族下游相關蛋白cleaved caspase-9與cleaved caspase-3均增加。隨著藥物濃度的增加，PUMA蛋白的表達量較對照組逐漸增加，見圖4B。5 μmol/L Danu處理不同時間后，與對照組相比，Bax的表達量在處理12 h、24 h、48 h和72 h后分別增加了1.9、2.0、2.1和2.5倍；相反，Bcl-2從處理4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h 后表達量卻降低到46.7%、45.7%、27.7%、43.7%、33.7%和18.0%，Bcl-xL的表達量與對照組細胞相比降低至87.3%、51.0%、30.3%、35.0%、41.3%和32.7%，見圖4C。

Figure 3. Danusertib (Danu) induced cell cycle arrest in the HL-60 cells. The cells were treated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h or with 5 μmol/L Danu for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h, and subjected to flow cytometric analysis. The protein samples were subjected to Western blot. A: the bar graphs showing the percentages of HL-60 cells in G1, S and G2/M phases; B: the expression of CDK1/CDC2, CDK2, cyclin B1, P21Waf1/Cip1, P27Kip1, and P53 in HL-60 cells. β-actin was used as the internal control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖3達努塞替誘導細胞周期阻滯

5達努塞替通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導HL-60細胞自噬

與對照組細胞相比，0.1～5 μmol/L Danu處理細胞 24 h后，細胞自噬率增加，其中1和5 μmol/L處理組顯著增加。5 μmol/L Danu處理細胞48 h和72 h自噬率與對照組相比明顯增加，見圖5A。Western blot的實驗結果顯示0.1～5 μmol/L Danu處理細胞24 h Beclin 1和LC3-II均呈顯著上升趨勢，見圖5B。激光共聚焦顯微鏡觀察結果亦顯示自噬作用隨劑量增加而增強,見圖6。時間效應的研究結果亦一致,見圖5C。

此外，1.5 μmol/L濃度Danu處理組p-PI3K/PI3K比率分別降低至78%和53%。同樣，與對照組相比，p-Akt與總Akt的比值亦降低，然而PTEN的表達量卻顯著增加。除此之外，細胞在藥物處理后p-mTOR/mTOR比值降低明顯。綜合上述結果表明達努塞替通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導HL-60細胞產生自噬，見圖5B。

討論

在細胞有絲分裂中極光激酶對中心粒周期、紡錘體變化、染色體分離及胞質分裂具有重要調控作用，并且參與細胞癌變的發(fā)生與發(fā)展。極光激酶B還是正常胞質分裂必不可少的激酶之一，它通過不同的底物分子調控胞質分裂的各個階段。所以，極光激酶理所當然成為抗癌治療靶點[10]。

絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑達努塞替是泛極光激酶抑制劑，作為潛在抗癌藥物已經進入臨床II期實驗，具有抗慢性粒細胞白血病及難治性轉移性前列腺癌的活性。在正常細胞中，其激酶表達僅在胸腺組織中較高，其余組織中表達水平很低，因此可以認為，此極光激酶抑制劑相對特異性的靶向腫瘤組織，對其它正常組織損傷性較小[11]。而在含有致癌基因Ras-V12的細胞中，極光激酶B過表達與促進細胞癌變與侵襲有關。同時在肝癌細胞與胰腺癌細胞中達努塞替可通過干擾細胞有絲分裂與產生多倍體來抑制細胞增殖[12]。鑒于臨床資料顯示ATRA治療APL存在白細胞增多癥、維甲酸綜合征和維甲酸耐藥三大弊端，本研究嘗試使用絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑達努塞替作用于HL-60細胞，觀察對其生物學特性的影響，并探討可能涉及的分子機制，以其作為新的小分子靶向制劑的臨床研究打下基礎。

Figure 4.Danusertib (Danu) induced apoptotic death in the HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner. A: bar graphs showed the percentages of apoptotic cells in the HL-60 cells treated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h or with 5 μmol/L Danu for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h, and 72 h; B: the expression of Bcl-xL, Bcl-2, Bax, PUMA, cleaved caspase 9 and cleaved caspase 3 in the HL-60 cells treated with Danu for 24 h; C: the relative levels of Bcl-xL, Bcl-2 and Bax in HL-60 cells treated with 5 μmol/L Danu for 0～72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖4達努塞替誘導HL-60細胞凋亡且具有劑量與時間依賴性

研究結果表明，達努塞替可以顯著抑制HL-60細胞的增殖，其機制是通過抑制對有絲分裂起促進作用的CDK1/CDC2、 CDK2和cyclin B1蛋白表達，增加細胞周期阻滯因子P21Waf1/Cip1、P27Kip1和 P53蛋白的表達，引起細胞周期G2/M阻滯。綜合表明，達努塞替可引起細胞周期重新分布，主要阻滯于G2/M期，并呈濃度及時間依賴性。達努塞替的抗腫瘤效應除了降低細胞增殖作用外，還有促進細胞凋亡的功能。既往研究發(fā)現(xiàn)達努塞替可以明顯促進卵巢癌細胞和乳腺癌等腫瘤細胞的凋亡發(fā)生[11-12]。本研究也觀察到，0.1～5 μmol/L的達努塞替處理24 h后，HL-60細胞的凋亡率上升到10.0%～13.8%，伴有藥物劑量和作用時間的依賴性。由于Bcl-2家族蛋白在凋亡程序中扮有重要作用，能夠通過不同的分子機制對線粒體介導的細胞凋亡發(fā)揮重要調控作用，各種凋亡刺激信號通過BH3蛋白引起B(yǎng)ax蛋白位移到線粒體外膜并多聚化，形成通道以刺激線粒體釋放細胞色素C和Smac，細胞色素C再與凋亡蛋白酶caspase-9形成凋亡小體，導致下游通路中的級聯(lián)反應的發(fā)生與發(fā)展。同時，抗凋亡蛋白Bcl-2可以通過翻譯后修飾或促進PUMA，一種作為通過P53依賴途徑誘導細胞凋亡的蛋白的表達量產生抑制作用[13]。因此我們通過Western blot檢測了凋亡前體蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達變化。本研究亦證明在達努塞替作用下，隨著劑量與時間的增加Bcl-2和Bcl-xL表達降低，而Bax和PUMA蛋白表達增加，從而啟動caspase 3級聯(lián)反應誘導細胞凋亡發(fā)生。

Figure 5.Danusertib (Danu) induced autophagic cell death in the HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner. A: the percentages of autophagic cells in the HL-60 cells treated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h or with 5 μmol/L Danu for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h; B: the protein levels of p-PI3K, PI3K, PTEN, p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin 1, LC3-I, and LC3-II in the HL-60 cells treated with Danu at 0.1, 1, and 5 μmol/L for 24 h; C: the expression of Beclin 1, LC3-I, and LC3-II in the HL-60 cells treated with Danu at 5 μmol/L for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h. β-actin was used as the internal control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖5達努塞替誘導HL-60細胞自噬且具有劑量與時間依賴性

細胞自噬是細胞程序性死亡的重要部分。自噬在細胞凋亡中扮有重要作用。一般認為在腫瘤細胞中，在應激、放射或化療等情況下，自噬起到保護細胞作用。Beclin 1 是酵母 Atg6/Vps30同源基因的表達產物， 最早被發(fā)現(xiàn)時它被認為是一種與細胞凋亡相關調節(jié)因子Bcl-2 相互作用的蛋白，而在腫瘤發(fā)生的過程中，則處于上調細胞自噬信號通路上最重要的調節(jié)因子。Beclin 1通常以復合物Beclin 1/PI3K3C的形式發(fā)揮作用，通過與各種蛋白的相互作用來達到調節(jié)細胞自噬的目的。LC3是唯一的 1 個定位于自噬泡內膜、參與多種信號傳導調節(jié)的自噬蛋白。LC3-I為LC3前體ProLC3加工后形成的可溶體，經暴露剪切后與自噬泡膜表面PE結合，得到定位于自噬泡膜上的膜結合形式的LC3-II，LC3-II則是自噬研究中的主要標志物[14]。本研究結果顯示，達努塞替能誘導HL-60細胞發(fā)生自噬。不同濃度達努塞替處理細胞24 h后細胞自噬率最高可達到20.3%，激光共聚焦顯微鏡觀察還發(fā)現(xiàn)自噬作用隨劑量增加而增強。本研究還發(fā)現(xiàn)，作為細胞自噬作用中的關鍵蛋白Beclin 1和LC3-II表達量顯著增加，同時作為PI3K的拮抗蛋白PTEN的表達量也是顯著增加，說明達努塞替對HL-60細胞自噬的促進作用具有劑量依賴及時間依賴性。而在關于涉及自噬的信號通路中，mTOR是一種PI3K相關激酶，通過mTOR信號復合物mTORC1和mTORC2形成PI3K-Akt-mTOR信號通路，是細胞內3大主要信號通路之一，PI3K/Akt/mTOR軸具有極其重要的地位和作用[15]。在一些腫瘤細胞如白血病、卵巢癌等腫瘤中經常出現(xiàn)該信號通路的異?；罨?，并參與腫瘤細胞周期、凋亡與自噬的生物學過程，調節(jié)腫瘤細胞的增殖與存活[16]。目前，該通路中的受體及激酶已經成為抗白血病的新靶點。PI3K是脂質激酶家族成員，能特異性使磷酸肌醇環(huán)上的3-羥基磷酸化，也是PI3K/Akt/mTOR通路中的始動因子。Akt又稱蛋白激酶B，是信號轉導通路中重要蛋白激酶，也是PI3K下游靶蛋白。mTOR是一種與PI3K/Akt通路相關的蛋白激酶，可以通過磷酸化激活與mRNA翻譯相關的蛋白來增強轉錄與翻譯，同時也能通過磷酸化滅活翻譯抑制蛋白[17]。Akt通過磷酸化mTOR的Ser2448位點激活mTOR，加快腫瘤的發(fā)生[18-20]。同時，PTEN作為PI3K的拮抗蛋白也是一個重要的抑癌蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，PTEN的缺失會導致腫瘤血管的生成增加而加速腫瘤的發(fā)展和轉移。關于達努塞替是否通過干預PI3K/Akt/mTOR信號通路而誘導HL-60細胞自噬的機制在本實驗中也得到印證。Western blot結果提示達努塞替對總PI3K、mTOR與Akt表達量沒有影響，其發(fā)揮自噬作用是通過抑制磷酸化PI3K、mTOR和Akt的表達來來起作用的。據(jù)文獻報道[19]，在細胞信號通路中AMPK的磷酸化位點在Thr172時對細胞自噬具有促進作用，在一些特定的環(huán)境中，AMPK在Ser317和Ser77位點的磷酸化后可直接通過Unc-51樣激酶促進自噬的發(fā)生，并且p38 MAPK的激活可以抑制自噬的發(fā)生，p38 MAPK信號通路在自噬的產生中可能起一定的調控作用，我們假設以上調節(jié)通路也可能影響PI3K-Akt-mTOR通路中產生交叉作用，但調節(jié)機制尚不十分清楚。值得注意的是，達努塞替在誘導自噬的同時促進凋亡的發(fā)生。抑制自噬是否可以進一步增敏達努塞替對HL-60細胞的殺傷作用，包括體內實驗研究，是未來的一個研究方向。

Figure 6. Danusertib (Danu) induced autophagy in the HL-60 cells observed under confocal microscope (×400). The HL-60 cells were incubated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h and then subjected to confocal microscopy. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖6通過共聚焦顯微鏡檢測達努塞替誘導HL-60細胞自噬

綜上所述，達努塞替對HL-60細胞可以抑制細胞增殖，激活細胞線粒體凋亡通路與誘導細胞自噬來發(fā)揮抗癌作用，這種極光激酶抑制劑可能成為今后抗AML選擇性靶向治療的新策略。

致謝：本課題在美國南佛羅里達大學藥學院周樹鋒教授實驗室完成，周樹鋒教授及周志偉博士等對本實驗設計、實驗過程及數(shù)據(jù)分析等方面給予了很大支持和指導，在此一并致謝。

[參考文獻]

[1]Breccia M, Lo Coco F. Thrombo-hemorrhagic deaths in acute promyelocytic leukemia[J]. Thromb Res, 2014, 133 (Suppl 2):S112-S116.

[2]Li J, Zhou H, Hu J, et al. Progress in the treatment of acute promyelocytic leukemia: optimization and obstruction[J]. Int J Hematol, 2014, 100(1):38-50.

[3]李強，吳燕華，閆曉梅，等. 極光(aurora)激酶在細胞有絲分裂和腫瘤形成中的重要功能[J]. 生命科學, 2005, 17(5):424-432.

[4]Andrews PD, Knatko E, Moore WJ, et al. Mitotic mechanics: the auroras come into view[J]. Curr Opin Cell Biol, 2003, 15(6):672-683.

[5]Sen S, Zhou H, White RA. A putative serine/threonine kinase encoding geneBTAKon chromosome 20q13 is amplified and overexpressed in human breast cancer cell lines[J]. Oncogene, 1997, 14(18):2195-2200.

[6]Bolanos-Garcia VM. Aurora kinases[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37(8): 1572-1577.

[7]Goldenson B, Crispino JD. The aurora kinases in cell cycle and leukemia[J]. Oncogene, 2015, 34(5):537-545.

[8]Lens SM,Voest EE, Medema RH. Shared and separate functions of polo-like kinases and aurora kinases in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10(12): 825-841.

[9]Carpinelli P, Ceruti R, Giorgini ML, et al. PHA-739358, a potent inhibitor of Aurora kinases with a selective target inhibition profile relevant to cancer[J]. Mol Cancer Ther, 2007, 6(12):3158-3168.

[10]陳聰琴，范艷華，呂文文，等. 抗腫瘤新靶點-極光激酶及其小分子抑制劑研究進展[J]. 國際藥學雜志, 2013, 40(1):73-78, 104.

[11]Li JP, Yang YX, Liu QL, et al. The pan-inhibitor of Aurora kinases danusertib induces apoptosis and autophagy and suppresses epithelial-to-mesenchymal transition in human breast cancer cells [J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9: 1027-1062.

[12]Zi D, Zhou ZW,Yang YJ, et al. Danusertib induces apoptosis, cell cycle arrest, and autophagy but inhibits epithelial to mesenchymal transition involving PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in human ovarian cancer cells[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(11): 27228-27251.

[13]黃棟棟，孟易禹，孫棟勛，等. 牛蒡子苷元誘導人鼻咽癌CNE-1細胞凋亡及其作用機制[J]. 中國病理生理雜志，2016, 32(1):101-105.

[14]Meulenbeld HJ, Mathijssen RH, Verweij J, et al. Danusertib, an aurora kinase inhibitor[J]. Expert Opin Invest Drugs, 2012, 21(3):383-393.

[15]Benten D, Keller G, Quaas A, et al. Aurora kinase inhi-bitor PHA-739358 suppresses growth of hepatocellular carcinomainvitroand in a xenograft mouse model[J]. Neoplasia, 2009, 11(9):934-944.

[16]Ghobrial IM, Witzig TE, Adjei AA. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(3):178-194.

[17]Dunlop EA, Tee AR. mTOR and autophagy: a dynamic relationship governed by nutrients and energy[J]. Semin Cell Dev Biol, 2014, 36:121-129.

[18]Jiang X, Overholtzer M, Thompson CB. Autophagy in cellular metabolism and cancer[J]. J Clin Invest, 2015, 125(1):47-54.

[19]Kim J, Guan KL. Regulation of the autophagy initiating kinase ULK1 by nutrients: roles of mTORC1 and AMPK[J]. Cell Cycle, 2010, 10(9):1337-1338.

[20]Guertin DA, Sabatini DM. Defining the role of mTOR in cancer[J]. Cancer Cell, 2007, 12(1):9-22.

(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Antitumor mechanism of danusertib in human AML HL-60 cells

HE Si-jia1, SHU Li-ping1, REN Tao2, HE Zhi-xu1

(1DepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guizhou550001,China;2CancerCenter,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:hzx@gmc.edu.cn)

[KEY WORDS]PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Cell cycle; Apoptosis; Autophagy; HL-60 cells

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of danusertib, a pan-inhibitor of Aurora kinases, on the viability, cell cycle, apoptosis and autophagy of human acute myelocytic leukemia (AML) HL-60 cells.METHODS: The effect of danusertib on the viability of HL-60 cells was examined by MTT assay. The effect of danusertib on apoptosis of HL-60 cells was quantitated by the flow cytometry using an Annexin V/7-AAD apoptosis detection kit. The effect of danusertib on autophagy in the HL-60 cells was assessed by flow cytometry and confocal microscopic analysis. The levels of various proteins related to the cell cycle, apoptosis and autophagy were determined by Western blot.RESULTS: Danusertib decreased the viability of human AML HL-60 cells and induced the cell cycle arrest in G2/M phase. Danusertib also induced mitochon-drium-dependent apoptosis by activation of caspase-3 and autophagy in the HL-60 cells via inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.CONCLUSION: Danusertib shows effective antitumor ability for promising AML treatment.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 0990- 08

[收稿日期]2015- 12- 07[修回日期] 2016- 03- 11

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 31460312)

通訊作者△Tel: 0851-86908118； E-mail: hzx@gmc.edu.cn

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.005