豬巨細胞病毒檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，李 峰，姚春陽，沈志強

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬巨細胞病毒檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，李 峰，姚春陽，沈志強

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬巨細胞病毒病是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要傳染病。文章概述了豬巨細胞病毒（PCMV）實驗室檢測方法的研究進展。在細胞生物學方面，主要依靠病毒分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光試驗(IFA)等病毒特異性抗原及其抗體的檢測等。在分子生物學方面，主要依靠國內(nèi)外相繼建立起的聚合酶鏈式反應（PCR）、熒光定量PCR、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）和原位雜交（ISH）技術等。介紹和比較了各種方法的優(yōu)缺點和實用性，為臨床科技工作者建立快速、簡便、準確、實用的檢測方法提供參考。

豬巨細胞病毒；豬包涵體鼻炎；檢測；研究進展

豬巨細胞病毒病又稱豬包涵體鼻炎（Porcine inclusion-body rhinitis），是由皰疹病毒科β皰疹病毒亞科的豬巨細胞病毒（Porcine cytomegalovirus，PCMV）引起的一種免疫抑制性傳染病。主要發(fā)生于幼齡仔豬，在易感豬群中可引起胚胎和仔豬死亡，表現(xiàn)發(fā)育不良、鼻炎和肺炎等臨床癥狀。成年豬多呈隱性感染，正常情況下不會表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但當機體抵抗力下降、應激、免疫麻痹或免疫抑制，PCMV對機體的致病作用會加劇。PCMV于1955年被英國的Done首次發(fā)現(xiàn)，因在患鼻炎的豬鼻甲骨黏膜黏液腺巨細胞中發(fā)現(xiàn)有大量嗜堿性核內(nèi)包涵體，故又被稱為包涵體鼻炎［1］。PCMV是繼偽狂犬病 毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）之后第2個被發(fā)現(xiàn)的豬皰疹病毒［2］。目前PCMV感染已廣泛分布于世界各地，我國多地也先后報道了該病的發(fā)生。常規(guī)飼養(yǎng)條件下大多數(shù)豬群PCMV陽性率很高，且大多數(shù)為亞臨床型或與其他病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等混合感染，大大加劇了患豬的病死率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。本病目前尚無特效治療藥物和方法。本文綜述了PCMV的實驗室檢測方法研究進展，以期為疾病的診斷和有效防治提供參考。

1 病毒分離鑒定

1.1 病毒的細胞培養(yǎng)

病毒分離是最基本的方法之一，PCMV體外培養(yǎng)較困難，R．G．Watt等［3］調(diào)查了多種組織對這種病毒的易感性，結果發(fā)現(xiàn)只有3～5周齡仔豬的肺泡巨噬細胞（PAM）對首次分離和連續(xù)傳代的病毒高度敏感。G．Plummer等［4］應用建立的豬輸卵管類上皮和輸卵管類成纖維細胞（PFT-F）培養(yǎng)PCMV，結果表明：兩種細胞對病毒均敏感，但后者更敏感。對疑似感染PCMV仔豬，采集其鼻液、鼻腔或喉頭等的拭子洗液以及肺、腎、淋巴結等病料，接種于肺泡巨噬細胞或輸卵管類成纖維細胞，進行病毒分離，也可以用無菌或SPF豬的肺泡巨噬細胞直接培養(yǎng)分離病毒。接種后3～14 d可看到巨細胞形成和核內(nèi)包涵體出現(xiàn)。但由于PAM細胞經(jīng)常受到包括PRRSV在內(nèi)的病毒污染，故在細胞使用之前要對其進行監(jiān)測，確保安全可靠、無污染。其他的培養(yǎng)系統(tǒng)包括豬原代睪丸（ST）細胞、豬腎（PK-15）細胞系和豬鼻甲骨黏膜成纖維（PTK75）細胞等都可用以培養(yǎng)分離病毒。這3種細胞被PCMV感染后，直接作帶毒培養(yǎng)，病毒可充分增殖，并出現(xiàn)細胞病變（CPE），但在它們未感染病毒的原代細胞中不能培養(yǎng)。有研究表明：十四烷酰佛波醇乙酸酯（TPA）能增強病毒的復制，PCMV感染的細胞可發(fā)生細胞腫脹、巨化，達到正常細胞大小的6倍；采用吉姆薩染色，可見細胞核內(nèi)的嗜堿性包涵體［5］。

1.2 直接電鏡觀察

取發(fā)病豬肺門淋巴結或上呼吸道黏膜制作成組織切片，經(jīng)磷鎢酸負染色后可直接進行電子顯微鏡觀察。根據(jù)PCMV感染機體后形成的特征性巨細胞與核內(nèi)嗜堿性包涵體，可以做出診斷。也可通過電子顯微鏡觀察PCMV感染細胞的細胞核及空泡內(nèi)典型的、結晶狀排列的、帶囊膜的病毒粒子來確診該病。若病變組織冷凍保存，在病毒活性喪失后至少24 h可在這些組織的冰凍切片上用免疫染色法檢測到病毒病原。

2 血清學方法

2.1 血清中和試驗

血清中和試驗（SN）是經(jīng)典的血清學檢測方法?？捎靡阎獦藴识局甑拿庖哐澹詷藴实牟《九囵B(yǎng)物為對照，對分離毒株進行中和試驗，可對病毒分離物予以鑒定。

2.2 間接免疫熒光試驗

間接免疫熒光試驗（IFA）是常用的檢測PCMV抗體的血清學方法之一。P．R．Rondhuis等［6］使用豬輸卵管細胞系（PFT）制備PCMV抗原，建立了檢測PCMV抗體的IFA方法。對采集于荷蘭各地1 449份臨床豬血清和103份SPF豬血清進行檢測，結果表明，除SPF豬血清無PCMV抗體外，其他血清中93%都含有PCMV抗體，且與患有萎縮性鼻炎和無萎縮性鼻炎的豬血清PCMV抗體無明顯差異，說明PCMV抗體陽性率很高，也說明PCMV多呈隱性感染。日本于1981年對45個都道府縣的441例肉豬血清用IFA法做了抗體調(diào)查，其中434例（98．4%）為陽性。R．Assaf等［7］同樣以全病毒為抗原建立IFA方法，檢測56份臨床豬血清，并與ELISA方法進行比較，結果顯示：30．35%的血清用兩種試驗方法檢測時滴度相同，25．00%血清用間接ELISA方法比IFA法高4個或更高稀釋度。用感染的PAM細胞或PFT-F細胞用丙酮固定，然后進行IFA檢測，其敏感度比中和試驗高8倍以上，而且還可對不同類別的IgG和IgM抗體予以鑒別。商品豬血清的IFA滴度可達1：64～1：128，有時可達到1：1 024。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測方法具有靈敏性高、特異性強的優(yōu)點，適用于開展大規(guī)模的血清流行病學調(diào)查。對于PCMV的檢測，血清學檢測仍然占主導地位。ELISA的包被抗原主要有兩種，一種是全病毒顆?？乖?，另一種是通過基因工程獲取的重組目的蛋白。Assaf等［7］、T．Tajima等［8］、D．Yoo等［9］先后以PCMV全病毒為抗原，建立了檢測PCMV抗體的ELISA方法，用于檢測PCMV抗體。這些方法與IFA相比，具有較高的敏感性。但由于PCMV復制能力較弱，病毒滴度低，很難大量增殖并獲得病毒，所以使得以全病毒作為包被原的ELISA方法不能被廣泛推廣應用。近年來隨著分子生物學技術的快速發(fā)展及對PCMV糖蛋白B（gB）基因研究的進一步深入，有研究者將gB基因與原核或真核表達載體重組進行體外表達。以重組蛋白為抗原，感染PCMV豬的血清為抗體建立ELISA方法，獲得了較好的效果。國內(nèi)李晶等［10］首次截短表達gB蛋白，包被ELISA酶標板后建立了檢測PCMV抗體的間接ELISA方法。用該法檢測收集于2005—2010年間湖南各地500份豬血清，檢測結果顯示，PCMV總血清陽性率為96．4%，其中培育豬抗體陽性率最高達到96．67%，說明中國湖南豬群普遍存在PCMV感染。gB主要抗原表位區(qū)重組蛋白不與CSFV、PRV、PRRSV、PCV2等豬常見感染病毒發(fā)生血清學交叉反應，說明原核表達的gB蛋白具有良好的抗原性。對采自湖南、河南、江西、廣東、廣西和福建六省的690份豬血清樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)我國不同省份血清樣品的整體陽性率為95．21%（657/690），采自從美國進口種豬群的血清樣品陽性率為81．25%（26/32），揭示了該病在我國的高流行，也為PCMV的血清流行病學調(diào)查奠定了基礎。趙鋒祥［11］以純化的重組蛋白GST-gB2作為診斷抗原建立了間接ELISA檢測方法，為臨床檢測PCMV感染提供了新的簡便、快捷的方法，同時為檢測試劑盒的開發(fā)奠定了良好的基礎。劉驍［12］對PCMV gB優(yōu)勢抗原表位區(qū)進行了原核表達，并將表達的重組蛋白作為包被抗原建立了一種檢測PCMV gB抗體的間接阻斷ELISA，對四川省11個地區(qū)進行了PCMV分子流行病學調(diào)查，結果表明該方法具有較好的特異性（98%）和敏感性（97．8%），適用于PCMV抗體的大批量檢測，這為新型PCMV ELISA檢測試劑盒的研發(fā)及PCMV疫苗的評估奠定了基礎。朱月華等［13］以重組PCMV gB蛋白為包被抗原，建立了PCMV抗體的間接ELISA檢測方法。對江蘇省259份仔豬血清樣品進行檢測，抗體陽性率達56．76%。其所建立的方法具有簡單、快速、敏感和特異等優(yōu)點，為PCMV抗體檢測和流行病學調(diào)查提供了有效工具。顧偉偉［14］也利用原核表達系統(tǒng)對PCMV gB基因進行了表達，并用純化的表達蛋白作為包被抗原建立了檢測PCMV抗體的間接ELISA。應用ELISA對2009—2011年收集自我國14個地區(qū)27個豬場的1 234份血清樣本進行PCMV抗體檢測。結果顯示，樣本的PCMV抗體總陽性率為84．28%；豬場陽性率為100%。豬群抗體陽性率隨日齡的增長呈逐漸上升趨勢，母豬群的PCMV陽性率高達99．46%。血清學檢測充分顯示我國豬群中PCMV的感染十分普遍。

2.4 免疫組織化學技術

免疫組織化學技術（IHC）是利用抗原抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原，對其進行定位、定性及定量的研究方法。IHC具有特異性強、靈敏度高、定位準確和簡便快速等優(yōu)點。近年來，IHC越來越多地應用于獸醫(yī)領域，對研究許多意義重大的疾病提供了新的方法。IHC試驗中，S．Maki等［15］制作了PCMV感染仔豬腎臟病理組織切片，并制備了單克隆抗體，進行PCMV抗原與單克隆抗體的特異性免疫反應后，加入標記有熒光素的二抗與抗原抗體結合物反應，最后通過病理組織切片上熒光標記物的顯色對組織細胞內(nèi)的PCMV進行了定位、定量，在熒光顯微鏡下可見細胞內(nèi)的免疫反應產(chǎn)物。結果顯示，在存在PCMV包涵體的30份豬腎臟病理組織切片中有21份檢測為PCMV抗原陽性，符合率達到70%。IHC檢測技術相對于單純的病理組織切片染色特異性和精確度有所提高，為PCMV感染的檢測提供了良好的工具。

3 分子生物學方法

3.1 PCR技術

PCR技術快速、敏感、特異性強，已被廣泛應用于PCMV的檢測。A．L．Hamel等［16］首次報道了應用PCR檢測PCMV，結果顯示加拿大PCMV陽性率大于59%。J．F．Fryer等［17］應用定量競爭PCR對不同的豬器官（包括用于異種移植供體）進行了PCMV的檢測，可以從每微克DNA中檢出低于10至97個基因組拷貝，保證異種器官移植的安全性。C．S．Lee等［18］建立了檢測PRV、PCV和PCMV的多重PCR方法，用于避免這三種病毒在異種器官移植時轉(zhuǎn)移入受體，該方法具有較好的敏感性和特異性。國內(nèi)朱偉等［19］、李晶等［10］和何萬平等［20］通過擴增PCMV部分gB基因建立了PCR檢測方法，為PCMV遺傳變異分析和分子流行病學調(diào)查提供了重要材料，也為gB基因的表達和以gB蛋白作為包被抗原建立間接ELISA檢測方法奠定了基礎。劉興彩等［21］以PCMV的DNA聚合酶（DPOL）基因為模板設計引物建立了PCMV的PCR檢測方法，對我國11個省市的100份樣品進行了檢測，陽性率為33．0%。王燕群［22］（2011）也基于PCMV DNA聚合酶基因設計引物，建立了PRV、PCV2、PPV和PCMV的多重套式PCR檢測方法，對具有繁殖障礙臨床癥狀的123份豬病料進行檢測，結果顯示四種病毒感染普遍存在，其中PCMV和PCV2感染嚴重，陽性率分別為34．1%和32．5%。劉捷等［23］應用PCR方法檢測了2009年從江蘇、上海、廣東等地患病豬群中采集的76份病料，PCMV陽性率為69．7%，說明我國規(guī)模豬場存在PCMV普遍感染。劉紅亮等［24］應用PCR方法對四川省部分地區(qū)（遂寧、樂山、眉山、簡陽、雅安和德陽）采集樣品進行PCMV和PRRSV檢測，研究豬同時感染PCMV和PRRSV的相關性，36份PRRSV陽性病料中，PCMV檢出率為63．89%。王慧［25］也建立了PCR方法對PCMV和PRRSV等病毒進行檢測，證明其所建立的PCR方法能夠用于PCMV的臨床檢測。劉驍?shù)龋?6］應用套式PCR方法，對采自四川省11個地市204份血清和組織樣品進行了檢測，平均陽性率高達81．9%。顧偉偉［14］采用PCR技術，對2006—2010年收集自我國14個地區(qū)49個規(guī)模化豬場的812份肺組織病料進行了PCMV檢測，PCMV陽性率為39．04%，豬場陽性率為97．96%，表明在我國豬群中PCMV感染較為廣泛。裴曉萌等［27］利用PCR方法對2011—2012年來自我國中東部地區(qū)193個患病豬群的仔豬病料進行了PCMV檢測，PCMV陽性率為59．0%，其中江蘇、浙江、上海和安徽的PCMV陽性率分別達到61．9%、64．4%、64．3%和66．7%。表明這些地區(qū)的PCMV感染率較高，為有效預防和控制PCMV感染提供了理論依據(jù)。PCR檢測采樣方便、快捷、僅需用棉簽在鼻孔內(nèi)刮取少量鼻腔分泌物即可，鼻拭子采樣法即可對死亡豬只也可對活體豬只進行，能滿足活體抗原檢測、日常流行病學預防等實際工作的需要，但PCR檢測方法不適宜疾病的大規(guī)模普查。

3.2 熒光定量PCR技術

熒光定量PCR與傳統(tǒng)的PCR相比，能有效減少試驗中的污染，具有檢測快速、批量、靈敏度高、特異性強、可以定性和定量檢測等優(yōu)點。J．E．Abrahante等［28］為了驗證器官移植中所用器官是否含有PCMV病原，建立了檢測PCMV的熒光定量PCR方法，檢測12頭衛(wèi)生要求嚴格供體豬的EMCV、HEV、PCMV和PLHV等病原，結果發(fā)現(xiàn)檢測豬6/12為PCMV陽性，且周齡越大PCMV越陽。拜廷陽等［29］建立了PCMV的TaqMan熒光定量PCR檢測方法，對15份臨床疑似PCMV感染的組織病料進行了檢測，其中有9份樣品為陽性，與常規(guī)PCR方法檢測的陽性符合率為100%。對PCMV陽性豬的不同內(nèi)臟器官進行病毒含量比較檢測，發(fā)現(xiàn)PCMV含量最高為扁桃體，最低的為小腸。表明其所建立的方法可用于臨床上PCMV感染豬的確診和隱性感染豬的早期檢測，對PCMV的快速診斷、綜合防控及凈化等具有重要意義。

3.3 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術在靈敏度、特異性、擴增時間、檢測范圍上都優(yōu)于常規(guī)PCR技術，而且不需要精密儀器，一般用恒溫水浴鍋就可以在短時間內(nèi)進行目的片段的擴增，檢測成本低于熒光定量PCR，該方法簡便快捷，省時省力，是一種適用于基層實驗室快速、準確檢測PCMV的方法。J．L．Yang等［30］根據(jù)PCMV DPOL基因設計及六對特異性引物，對臨床表現(xiàn)PCMV癥狀的病料提取目的基因，通過優(yōu)化反應條件建立了LAMP方法。結果表明，LAMP具有和PCR—樣的敏感性和特異性，適用于大量PCMV樣品的快速檢測。廖春燕等［31］針對PCMV gB基因建立了LAMP方法，對2013年來自四川省雅安、成都、綿陽、眉山、樂山、德陽、遂寧、資陽等市的136份病料進行了PCMV檢測，其中有89份樣品為PCMV陽性，PCMV感染率為65．4%。LAMP為臨床上PCMV感染豬的檢測和確診提供了有效的方法，對PCMV的快速診斷、綜合防控及凈化與異種器官移植的選擇等均具有重要意義。

3.4 原位雜交技術

原位雜交（ISH）是在己獲得的病毒特異片段上標記放射性同位素或生物素作為探針而建立的一種分子雜交方法，是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列的有力工具，具有較高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調(diào)節(jié)機制。

S．Maki等［15］為了研究ISH方法是否適用于PCMV的檢測，建立了地高辛標記的熒光原位雜交技術（FISH）。采集了34份疑似感染PCMV仔豬的腎臟病理組織，制作成病理組織切片并固定，經(jīng)過蘇木紫-伊紅（HE）染色后發(fā)現(xiàn)有30份樣品腎髓質(zhì)腎小管上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞的細胞核內(nèi)出現(xiàn)PCMV包涵體。FISH檢測這30份已知PCMV陽性樣本，陽性率為93．3%。在HE檢測陽性但ISH檢測陰性的2份樣品中，HE染色后只見到少量包涵體，但是用ISH檢測則沒有檢測到或者檢測到少量包涵體。但是與IHC比較，ISH的敏感性相對較高。該法實現(xiàn)了對PCMV精確定量、定位的檢測，發(fā)現(xiàn)PCMV主要存在于巨細胞的細胞核與細胞質(zhì)內(nèi)。

4 小結

目前我國PCMV常以隱形感染的形式在豬群中廣泛存在。在良好的飼養(yǎng)管理條件下，PCMV的地方流行對豬群并不造成嚴重損失，但當引入新豬群時，因在循環(huán)抗體存在的條件下激發(fā)潛伏感染，或在易感豬群中引入原發(fā)性感染，對豬場構成很大的威脅。另外，隨著人類使用豬的活體器官、組織和細胞進行人體器官移植增加，對PCMV的研究和關注也越來越深入［32］：因此，建立PCMV的快速診斷對該病的早期診斷、防治及公共衛(wèi)生等具有重要意義。國外主要采用加強監(jiān)測，淘汰持續(xù)感染和免疫耐受動物來凈化豬群。對我國來說建立、健全并完善PCMV監(jiān)測系統(tǒng)，尤其是建立對畜群PCMV隱形感染檢測的定期監(jiān)測制度顯得尤為重要。傳統(tǒng)的病毒分離方法需進行體外細胞培養(yǎng)增殖并觀察CPE，但由于PCMV在體外增殖較困難，所需時間長，費時費力，難以推廣應用。上述PCMV的血清學和分子生物學檢測方法各有優(yōu)點和缺點，需要根據(jù)不同的場合、條件等選擇使用其中的一種或者多種方法。雖然上述檢測方法為PCMV的檢測提供了有效的技術手段，但是隨著人們對PCMV深入研究，相信現(xiàn)有的檢測方法將不斷的得到改進或者新的檢測方法將很快研制出來，以使其檢測技術更簡便化、快速化和準確化，也將對疾病的有效防控產(chǎn)品及技術的研制奠定基礎。

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2015-06-15）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細胞培養(yǎng)和動物用病毒疫苗研制，

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