補腎助孕方調(diào)節(jié)生殖軸促進胚胎著床的機制探討*

戴佳軒，徐建亞，謝 彤，蔣鳳榮，姜 淼，周伯如，周惠芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

補腎助孕方調(diào)節(jié)生殖軸促進胚胎著床的機制探討*

戴佳軒，徐建亞，謝 彤，蔣鳳榮，姜 淼，周伯如，周惠芳△

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

補腎助孕方是基于國醫(yī)大師夏桂成教授提出的“心(腦)-腎-子宮軸”理論指導(dǎo)下形成的經(jīng)驗方劑。臨床研究已證實，其為治療黃體功能不全性(LPD)不孕癥的有效方藥，并能提高患者胚胎著床期P、LH等水平，實驗結(jié)果提示其能改善卵巢黃體功能及子宮內(nèi)膜容受性?；谥形麽t(yī)對LPD性不孕為生殖軸功能失調(diào)認識上的一致性，課題組認為補腎助孕方能夠作用于垂體，提出“通過GnRH受體后信號通路調(diào)控垂體GTH表達進而調(diào)節(jié)生殖軸功能”的作用新機制假說。首次從GnRH受體后PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA信號通路，開創(chuàng)性地研究補腎助孕方對垂體GTH表達分泌的調(diào)控及補腎法治療LPD的助孕新機制，為中藥治療LPD不孕癥的研究提供新思路和新方法。

補腎助孕方;黃體功能不全;促性腺激素;GnRH受體;信號通路

世界衛(wèi)生組織將不孕不育列入醫(yī)學(xué)界危害人類健康的三大難治性疾病之一，其發(fā)病率近年來呈上升趨勢，可能與晚婚晚育、人工流產(chǎn)、性傳播疾病、女性工作節(jié)奏加快壓力增加而致焦慮等有關(guān)。黃體功能不全(luteal phase defect，LPD)是導(dǎo)致育齡婦女妊娠失敗的直接重要原因，其臨床特點是不孕和反復(fù)早期流產(chǎn)，其中約有3.5%～10%的不孕癥、35%的早期妊娠流產(chǎn)和4%的習(xí)慣性流產(chǎn)是由LPD所引起的［1-2］。目前，LPD的病因及機制仍未完全明了，多種可造成女性不孕不育的生殖內(nèi)分泌疾病亦可導(dǎo)致LPD［3］。臨床上治療LPD的激素支持療法存在種種缺陷［4-7］。

周惠芳教授20余年來跟隨國醫(yī)大師夏桂成教授對女性生殖理論和臨床進行了系統(tǒng)研究和創(chuàng)新，尤其是對黃體功能不全性不孕癥從臨床到基礎(chǔ)、從發(fā)病因素、物質(zhì)基礎(chǔ)、治療效果及中醫(yī)藥有效機制諸方面都進行了深入探討，將名老中醫(yī)的學(xué)術(shù)思想、臨證經(jīng)驗和現(xiàn)代研究相結(jié)合，總結(jié)出適合現(xiàn)代臨床實際運用的新理論和新方法。

1 補腎助孕方理法方藥

中醫(yī)學(xué)尚無“黃體功能不全”、“胚胎著床障礙”之說，根據(jù)其證候?qū)儆凇安辉邪Y”“胎漏、胎動不安”“滑胎”“月經(jīng)失調(diào)”等范疇。腎藏精主生殖，腎氣的盛衰與生殖關(guān)系密切。腎氣旺盛，任通沖盛，兩精相搏，才能受孕。腎主沖任，諸因損及腎，傷及沖任，均可致腎失封藏，沖任不固，胞胎失養(yǎng)，胎元無以維系，胚胎無以著床而不孕。國醫(yī)大師夏桂成教授帶領(lǐng)團隊，經(jīng)歷長達半個多世紀的臨床實踐，完善了以“心(腦)-腎-子宮軸”、“經(jīng)間期學(xué)說”、“調(diào)整月經(jīng)周期節(jié)律法”等創(chuàng)新學(xué)說為主體的中醫(yī)女性生殖節(jié)律調(diào)節(jié)理論，相關(guān)研究成果“中醫(yī)女性生殖節(jié)律理論創(chuàng)新及臨床應(yīng)用”獲2011年江蘇省科技進步一等獎。

夏桂成所創(chuàng)立的補腎調(diào)周法，意在調(diào)整心(腦)-腎-子宮生殖軸，使之恢復(fù)到正常的女性生理狀態(tài)。他指出:“腎藏精，亦主骨髓，精能生髓，心藏神，主神明，腦為髓海、為元神之府，心腦為神之所藏，精神互依，精能養(yǎng)神，神能馭精(包括生殖之女精)，是以心腦神明才是駕馭排卵之所在。心腦通過骨髓與腎相關(guān)聯(lián)，子宮之排經(jīng)、受孕、分娩，腎之分泌天癸、精卵，均與心腦神明有關(guān)，精神合一、心腎相交、在心(腦)－腎－子宮生殖軸的縱橫反饋的作用下，才能維護女性生殖方面的陰陽消長轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)功能?！绷硗?，“通過肝脾升降疏泄而致氣血之間的活動，糾正陰陽消長轉(zhuǎn)化運動中的太過與不及，以保證陰陽運動的動態(tài)平衡，從而也就間接地保證了心腎之間的交合。故在補腎調(diào)周法特別是在經(jīng)前期補腎助陽法的前提下，兼用疏肝寧心的方法，安定心肝魂魄，更有利于調(diào)經(jīng)助孕種子”［8］。

作為課題組長，夏桂成帶領(lǐng)課題組長期研究積累得出LPD性不孕癥臨床的病因病機主要是腎虛偏陽夾有肝郁，所以補腎助陽，佐以疏肝是治療LPD性不孕癥經(jīng)前期的大法，并逐漸篩選改良形成了經(jīng)驗方劑補腎助孕方(原名婦孕1號、助孕湯、助孕合劑，由炒白芍、淮山藥、山萸肉、醋柴胡、莵絲子、鹿角片等8味中藥組成)。方中以鹿角片補腎助陽為君藥，莵絲子平補腎陰腎陽，炒白芍、淮山藥、山萸肉等補腎中陰精共為臣藥，佐以醋柴胡疏肝解郁鼓舞陽氣，諸藥相合在經(jīng)前期(確定排卵后)使用，具有使“陽長至重”、舒暢心肝氣機、安定心肝魂魄，從而矯正心(腦)-腎-子宮生殖軸，有利于調(diào)經(jīng)助孕。

2 補腎助孕方臨床研究

早在20世紀80年代，課題組在大量臨床研究基礎(chǔ)上，將上方制成院內(nèi)制劑助孕合劑，為LPD性不孕癥提供了有效的中藥制劑，并先后開展了2次臨床研究。

2.1 對腎虛肝郁型LPD不孕癥患者的臨床療效觀察

補腎助孕方臨床治療202例腎虛肝郁型LPD性不孕癥，患者月經(jīng)規(guī)則、經(jīng)前腰膝酸軟、乳房脹痛等臨床癥狀消除或改善，基礎(chǔ)體溫(BBT)明顯改善，雌二醇(E2)、孕酮(P)水平均顯著升高，泌乳素(PRL)水平明顯下降，受孕率 38.61%，好轉(zhuǎn)率55.90%，總有效率達94.51%［9］。

2.2 對多囊卵巢綜合癥腎虛肝郁型LPD性不孕癥臨床療效觀察

補腎助孕方臨床治療30例多囊卵巢綜合癥腎虛肝郁型LPD性不孕癥，結(jié)果提示該方能顯著提高患者胚胎著床期P、E2、黃體生成素(LH)水平，降低子宮及卵巢動脈血流阻力，增加子宮及卵巢動脈灌注量與血管壁的通透性［10］。

3 補腎助孕方實驗研究

在上述臨床研究基礎(chǔ)上，周惠芳教授帶領(lǐng)團隊又先后主持2項江蘇省自然科學(xué)基金項目，進一步通過體內(nèi)外動物實驗，對補腎助孕方健全黃體功能、促進胚胎著床的作用機制進行了研究探索。

3.1 對高泌乳素模型大鼠血清 PRL、P和 E2水平的影響

課題組用胃復(fù)胺造成SD大鼠高泌乳素模型，以安宮黃體酮為陽性對照藥，檢測助孕合劑大、小劑量組對各組SD大鼠E2、P、PRL的影響。結(jié)果表明，助孕合劑2劑量組均能明顯提高SD大鼠E2、P水平，降低PRL的水平［11］。

3.2 對LPD模型大鼠子宮內(nèi)膜及卵巢的影響

課題組用米非司酮為模型劑，地屈孕酮為西藥對照藥，將SD雌性大鼠隨機分成空白組、模型組、西藥組和中藥補腎助孕方低、中、高劑量組，光鏡觀察子宮內(nèi)膜及卵巢的形態(tài)，透射電鏡觀察卵巢黃體細胞的超微結(jié)構(gòu)，同時采用Western blot技術(shù)分析各組大鼠胚胎著床期子宮內(nèi)膜雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及整合素αⅤ、β3的蛋白表達等。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補腎助孕方能同時作用于卵巢和子宮內(nèi)膜，改善其結(jié)構(gòu)和形態(tài);主要是改善卵巢線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，改善子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)結(jié)構(gòu)，能有效下調(diào)SD大鼠胚胎著床期子宮內(nèi)膜中ER、PR的蛋白水平表達，并能顯著提高整合素αⅤ、β3的蛋白水平表達，改善黃體功能不全狀態(tài)子宮內(nèi)膜的容受性，為受孕創(chuàng)造良好環(huán)境［12-15］。

3.3 含藥血清對大鼠子宮內(nèi)膜細胞的影響

課題組取未成年SD雌鼠分泌期子宮內(nèi)膜細胞體外培養(yǎng)，加藥干預(yù)48 h后，采用Q-PCR法檢測補腎助孕方藥高、低劑量含藥血清對子宮內(nèi)膜細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9m)RNA、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3m)RNA的表達，同時采用放免法檢測細胞上清液MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的含量。實驗結(jié)果表明，補腎助孕方藥能提高子宮內(nèi)膜細胞MMP-9mRNA的表達及細胞上清液 MMP-9m、TIMP-1水平，同時下調(diào)子宮內(nèi)膜細胞caspase-3mRNA的表達，降低細胞的凋亡，有利于提高子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床，提高臨床妊娠率［16-17］。

4 結(jié)語及展望

前期研究表明，一方面補腎助孕方直接作用于生殖軸的下游卵巢及子宮，通過提高卵巢黃體細胞功能和子宮內(nèi)膜容受性，從而提高胚胎著床率及臨床妊娠率;另一方面也可能作用于垂體，使黃體期LH表達升高、PRL表達下降等，從而正向調(diào)節(jié)生殖軸下游的卵巢及子宮的功能，起到促進胚胎著床的作用。

由于中西醫(yī)理論體系和表述方式不同，“下丘腦-垂體-卵巢-子宮生殖軸”(HPO軸)與“心(腦)-腎-子宮生殖軸”的說法雖然有差別，但內(nèi)容基本一致，中西醫(yī)療法都是通過調(diào)整女性生殖軸、矯正黃體功能，達到臨床妊娠目的。

子宮只是靶器官，垂體處于中樞位置，垂體促性腺激素受體(GnRHR)在與來自下丘腦的促性腺激素釋放激素(GnRH)結(jié)合后，分泌卵泡刺激素(FSH)和LH，LH、FSH是維持黃體功能和卵泡發(fā)育不可或缺的性激素［18-19］。據(jù)國內(nèi)外研究表明，GnRH與垂體GnRHR結(jié)合后，主要通過三大信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，PKC-MAPK(蛋白激酶C-絲裂原活化蛋白激酶)、Ca2+-CAM(鈣-鈣調(diào)蛋白)和cAMP-PKC(環(huán)磷腺苷-蛋白激酶A)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)和控制LH、FSH的合成和分泌［20-23］。其中PKC-MAPK信號傳導(dǎo)通路的PKC是GnRH受體后信號通路中的重要結(jié)點，介導(dǎo)MAPK級聯(lián)放大，包括EPK(細胞外信號調(diào)節(jié)激酶)、p38MAPK(p38絲裂原活化蛋白激酶)、JNK (jun氨基末端激酶)3條分支，激活下游轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1(轉(zhuǎn)錄激活因子)、E1k1(Ets家族轉(zhuǎn)錄因子)、Egr-1(靶分子早期生長反應(yīng)基因)、CREB (cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)，調(diào)控 GTHα、LHβ、FSHβ基因轉(zhuǎn)錄［24-26］，cAMP–PKC通路同樣激活CREB、Egr-1。此外，GnRH與受體結(jié)合后，誘導(dǎo)Ca2+與CAM結(jié)合，通過Egr-1、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)LH、FSH表達。

綜合中西醫(yī)生殖軸的相關(guān)理論，周惠芳課題組提出補腎助孕方治療LPD性不孕癥的作用機制假說，即補腎助孕方并非單純作用于卵巢或子宮單一器官，亦可能直接作用于HPO軸的垂體部位，通過調(diào)控GnRHR表達或GnRH受體后PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA信號通路(包括信號傳導(dǎo)關(guān)鍵分子PKC、SRC、p38MAPK、JNK、ERK1/2、CAM、CAMK2、Calcineurin、cAMP、PKA及重要轉(zhuǎn)錄因子AP-1、Elk1、Egr-1、CREB、Nur77)，調(diào)節(jié)LH、FSH的表達，進而調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)分泌功能，提高子宮內(nèi)膜容受性。通過以上各環(huán)節(jié)的綜合作用，達到矯正LPD、促進胚胎著床的目的。

據(jù)此，周惠芳團隊正著眼于補腎中藥對垂體的調(diào)節(jié)作用研究，立足于GnRH受體后PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA信號通路，以米非司酮構(gòu)建LPD大鼠模型，西曲瑞克構(gòu)建GnRH受體拮抗細胞模型，從體內(nèi)外研究補腎中藥對GTH表達分泌的調(diào)控作用，力求闡明補腎助孕方促進胚胎著床治療LPD性不孕癥的作用機制，為中藥治療LPD不孕癥的研究提供新思路、新方法。研究成果不但能為廣大不孕癥患者帶來福音，產(chǎn)生良好的社會和經(jīng)濟效益，同時為“心(腦)－腎－子宮生殖軸”學(xué)說、“腎主生殖”理論及“中醫(yī)女性生殖節(jié)律理論”體系提供實驗依據(jù)。

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Mechanism of BuShenZhuYun Prescriptions on Regnlatrng the Reproductive Axis to Promote Embryo Implantation

DAI Jia-xuan，XU Jian-ya，XIE Tong，JIANG Feng-rong，JIANG Miao，ZHOU Boru，ZHOU Hui-fang△

(Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)

BuShenZhuYun recipe is based on the theory of heart(brain)-kidney-uterus axis’which was put forward by professor XIA Guicheng.Clinical studies have confirmed its effectiveness for treating infertility caused by Luteal Phase Defect(LPD)and it also improves the level of P，LH in pre-implantation patients embryos.Experiments suggested that it enhanced the function of ovarian corpus luteum and uterine receptivity.Based on the Chinese and Western medicine consensus of LPD infertility is caused by dysfunction of reproductive axis，we believe that BuShenZhuYun recipe has the effects on pituitary and according to this，we put a new hypothesis that we can use GnRH receptor signal pathway to regulate the expression of GTH with the purpose of adjusting the function of reproductive axis.For the first time we use GnRH receptor PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA signal pathways to study the effects of BuShenZhuYun recipe on expression of GTH excretion and the new mechanism of treating LPD reproductive by kidney-nourishing therapy.It provides new ideas and new methods for curing LPD infertility with Chinese medicine.

BuShenZhuYun recipe;LPD;GTH;GnRH receptor;Signal pathways

R285.5

B

1006-3250(2016)11-1508-03

2016-06-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(81473713)-補腎助孕方治療LPD性不孕癥的新機制:垂體GnRH受體后信號通路;江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK20141463)-補腎助孕方調(diào)節(jié)垂體GTH表達治療LPD性不孕的機制;中國和歐洲的醫(yī)療保健業(yè)發(fā)展合作研究計劃(China and Europe taking care of healthcare solutions，簡稱CHETCH，歐盟第七框架瑪麗居里行動國際研究人員交流計劃資助，F(xiàn)P7/2007-2013/PIRSES-GA-2013-612589);2015年度江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團隊-中醫(yī)女性生殖節(jié)律調(diào)節(jié)機制與臨床研究

戴佳軒(1990-)，女，江蘇常州人，醫(yī)學(xué)碩士，從事不孕癥的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者:周惠芳(1962-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事不孕癥的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail:zhouhuifang2011301@ 163.com。